郁征宇, 梁桂逢, 周龍宇, 徐晨曦, 王全華, 蔡曉鋒

(上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 植物種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 200234)

葉用萵苣(Lactucasativa)花青素提取技術(shù)的優(yōu)化

郁征宇, 梁桂逢, 周龍宇, 徐晨曦, 王全華, 蔡曉鋒*

(上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 植物種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 200234)

以紫晶生菜為原料,檸檬酸水溶液為提取劑,分別研究了提取液濃度、浸提溫度、固液比、浸提時(shí)間和浸提次數(shù)對(duì)花青素提取率的影響.在此基礎(chǔ)上,采用三水平四因素安排實(shí)驗(yàn),以520 nm為最大吸收波長(zhǎng),以吸光度為響應(yīng)值,探討浸提溫度、浸提時(shí)間、提取液濃度和固液比對(duì)紫晶生菜花青素提取的影響,并對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化.篩選出的最佳提取工藝條件為:提取劑質(zhì)量濃度0.06 g/mL,浸提溫度70 ℃,固液比1/70,浸提時(shí)間2 h,濾渣提取次數(shù)2次.

生菜; 檸檬酸; 提取; 花青素; 提取工藝

0 引 言

生菜(LactucasativaL.)又名葉用萵苣,菊科萵苣屬,為一年生或二年生草本植物,是世界上重要的綠葉蔬菜之一.生菜按葉片的色澤劃分為綠色生菜和紫色生菜兩種.紫色生菜具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,不僅富含蛋白質(zhì)、糖類、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分,而且含有豐富的花青素,具有清除自由基抗氧化功能、預(yù)防貧血、防癌、抗衰老、降低血壓和防止心律紊亂等保健功能[1-4].

花青素(anthocyanin)又稱花色素,是植物類黃酮生物合成途徑中的重要次生代謝產(chǎn)物,屬類黃酮化合物,主要以水溶性物質(zhì)的形式存在于植物各個(gè)組織的細(xì)胞液泡中,是構(gòu)成植物果實(shí)和花瓣顏色的主要色素之一[5].花青素是一類具有保健功能的活性成分,具有很高的藥用價(jià)值及保健功能,花青素在食品、化妝品、醫(yī)藥、保健等領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力.天然色素直接取自于自然界中的動(dòng)植物及微生物中,相比工合成色素更為安全可靠,是食品著色劑的發(fā)展趨勢(shì).

花青素提取是利用花青素的基礎(chǔ)環(huán)節(jié).關(guān)于花青素提取的報(bào)道很多,提取溶劑多為甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)試劑或者其混合液.畢云楓等[6]發(fā)現(xiàn)紫甘薯花青素的最佳提取劑為80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇酸性溶液,固液比為1/10,60 ℃下浸提時(shí)間為3 h;樊婷等[7]以檸檬酸-乙醇為提取劑提取紫甘薯花青素,最佳提取工藝參數(shù)為檸檬酸質(zhì)量濃度70 g/L,檸檬酸與乙醇的體積比為10/1,固液比為1/20,70 ℃浸提時(shí)間為2 h.蔣召雪等[8]以茄子皮為原料提取花青素,結(jié)果表明以70%(體積分?jǐn)?shù)))乙醇為提取溶劑,固液比為1/20,60 ℃提取90 min,提取3次,茄子皮中花青素提取率最高.Zou等[9]以桑葚為原料,發(fā)現(xiàn)63.8%(體積分?jǐn)?shù))甲醇,固液比為1/23.8,43.2 ℃提取40 min最佳.紫色生菜也是花青素的一種資源,但卻很少有紫色生菜中提取花青素工藝的研究.

本研究采用富含花青素,生長(zhǎng)期短,可周年種植的紫色生菜品種為原料,以檸檬酸為提取劑,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn),研究浸提溫度、浸提時(shí)間、固液比及pH值對(duì)花青素提取率的影響,以探索紫色生菜花青素的最佳提取工藝參數(shù),提供一種綠色、環(huán)保、高效且成本低的花青素分離、純化技術(shù).

1 材料與方法

1.1材料與試劑

供試材料為紫晶生菜,由上海師范大學(xué)從美國(guó)引進(jìn)品種Red oak leaf中經(jīng)系統(tǒng)選育篩選出的耐熱抗病酒紅色生菜新品種.檸檬酸為分析純,購(gòu)買自國(guó)藥集團(tuán).

1.2紫晶生菜預(yù)處理

選取新鮮的紫晶生菜樣品,清洗干凈,置于冷凍干燥機(jī)中干燥至恒重;然后用粉碎機(jī)粉碎,過(guò)80目(篩孔直徑0.18 mm)的篩子,置于4 ℃的冰箱中避光保存,備用.

1.3生菜花青素提取工藝的單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.1 紫晶生菜中花青素的最佳波長(zhǎng)

用分析天平準(zhǔn)確稱取紫晶生菜粉末0.2 g,加入9 mL質(zhì)量濃度為0.06 g/mL的檸檬酸提取劑,60 ℃恒溫水浴,浸提60 min,抽濾,將濾液用紫外分光光度計(jì)在430～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行吸光度測(cè)定,確定其最大吸收波長(zhǎng).

1.3.2 固液比的優(yōu)化

分別取0.2 g紫晶生菜于具塞試管中,固液比依次為1/20、1/30、1/40、1/50、1/60、1/70、1/80、1/90、1/100,加入6%的檸檬酸提取劑依次為3、8、10、12、14、16、18、20 mL,60 ℃恒溫水浴,提取1 h,抽濾,測(cè)定520 nm處的吸光度.

1.3.3 提取劑濃度的優(yōu)化

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定固液比為1/70,分別稱取0.2 g紫晶生菜粉末于具塞比色管中,并分別用體積分?jǐn)?shù)為0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%的檸檬酸溶液作為提取劑.加入14 mL提取劑,在60 ℃恒溫水浴中提取1 h,抽濾,測(cè)定520 nm處的吸光度.

1.3.4 浸提時(shí)間的優(yōu)化

分別取0.2 g紫晶生菜粉末于具塞試管中,按固液比為1/70加入14 mL 6%檸檬酸提取劑,60 ℃恒溫水浴,分別浸提1、2、3、4、5、6 h,抽濾,測(cè)定520 nm處的吸光度.

1.3.5 浸提溫度的優(yōu)化

分別取0.2 g紫晶生菜粉末于具塞試管中,按固液比為1/70加入14 mL 6%檸檬酸提取劑,浸提時(shí)間為2 h,浸提溫度分別為20、30、40、50、60、70、80、90 ℃條件下浸提,抽濾后測(cè)定520 nm處的吸光度.

1.3.6 浸提次數(shù)的優(yōu)化

分別取0.2 g紫晶生菜粉末于具塞試管中,按固液比為1/70加入14 mL 6%檸檬酸提取劑,浸提時(shí)間為2 h,浸提溫度70 ℃,濾渣浸提次數(shù)分別為1、2、3、4次條件下浸提,抽濾后測(cè)定520 nm處的吸光度.

1.4生菜花青素提取的正交實(shí)驗(yàn)

參照單因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果,進(jìn)一步對(duì)影響紫晶生菜中花青素提取效果的主要因素:固液比、提取劑濃度、浸提時(shí)間和浸提溫度進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),采用三水平四因素設(shè)計(jì),以確定最佳的提取條件.多因素正交實(shí)驗(yàn)的四因素、三水平設(shè)置如表1所示.

表1 紫晶生菜中花青素提取條件正交實(shí)驗(yàn)的因素水平設(shè)計(jì)

1.5花青素測(cè)定方法

采用紫外可見(jiàn)分光光度法在波長(zhǎng)520 nm處測(cè)得吸光值,以不同濃度的矢車菊素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品中花青素含量.

2 結(jié)果分析

2.1紫晶生菜花青素提取率的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 波長(zhǎng)對(duì)紫晶生菜花青素提取率的影響

圖1 波長(zhǎng)對(duì)紫晶生菜花青素提取的影響

圖2 固液比對(duì)紫晶生菜中花青素提取率的影響

花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液制成顯色檢測(cè)液后最大吸收波長(zhǎng)一致,均為 520 nm,因而確定紫晶生菜樣品液中花青素含量測(cè)定波長(zhǎng)為520 nm(圖1).

2.1.2 固液比對(duì)紫晶生菜花青素提取率的影響

隨著固液比的增加,花青素含量先快速增加,隨后緩慢增長(zhǎng).當(dāng)固液比在1/60～1/100范圍內(nèi)時(shí),紫晶生菜花青素提取率較高;當(dāng)固液比為1/70時(shí),紫晶生菜花青素提取率最高,超過(guò)1/70提取率變化較小且趨于穩(wěn)定,如圖2所示.這是因?yàn)樯酥谢ㄇ嗨睾坑邢?當(dāng)提取劑達(dá)到一定比例后,花青素可能已完全浸出,當(dāng)再提高提取劑比例時(shí),提取率仍保持穩(wěn)定.而固液比高于1/70時(shí),花青素得率反而有所降低.這可能是因?yàn)槿軇┯昧窟^(guò)多溶解出了較多雜質(zhì),影響了花青素的提取.因此,該單因素實(shí)驗(yàn)測(cè)出最佳固液比為1/70.

2.1.3 提取劑濃度對(duì)紫晶生菜中花青素提取率的影響

當(dāng)提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)在3%～7%范圍內(nèi)時(shí),紫晶生菜花青素提取率較高;當(dāng)提取劑質(zhì)量濃度為0.06 g/mL時(shí),紫晶生菜花青素提取率最高,如圖3所示.

2.1.4 浸提時(shí)間對(duì)紫晶生菜中花青素提取率的影響

紫晶生菜中花青素提取率在浸提時(shí)間為1～2 h范圍內(nèi)隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高;當(dāng)浸提時(shí)間為2 h時(shí),提取率最高;當(dāng)浸提時(shí)間大于2 h時(shí),由于提取出原花青素與細(xì)胞內(nèi)其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng),使花青素含量降低,導(dǎo)致提取率下降.故浸提時(shí)間以2 h較為合適,如圖4所示.

圖3 提取劑濃度對(duì)紫晶生菜中花青素提取率的影響

圖4 浸提時(shí)間對(duì)紫晶生菜花青素提取率的影響

2.1.5 浸提溫度對(duì)紫晶生菜中花青素提取率的影響

在一定階段內(nèi),隨著溫度的升高提取效果也在不斷變優(yōu)異,但如果繼續(xù)升溫,提取效果反而降低.因?yàn)殡m然升溫有利于色素的溶出,但花青素的穩(wěn)定性較差,溫度升高,花青素會(huì)發(fā)生氧化、聚合,導(dǎo)致提取率下降;溫度低時(shí),花青素與蛋白質(zhì)、纖維等分離較慢,也會(huì)導(dǎo)致提取率下降.當(dāng)浸提溫度為60～80 ℃時(shí),紫晶生菜花青素提取率較高;當(dāng)浸提溫度為70 ℃時(shí),紫晶生菜花青素提取率最高,溫度高于70 ℃時(shí)提取率緩慢下降,如圖5所示.溫度過(guò)高,一方面其中活性成分會(huì)受到破壞,雜質(zhì)溶出量增加,給后續(xù)操作帶來(lái)不便;一方面也會(huì)造成溶劑損失.綜合以上因素,浸提溫度應(yīng)選70 ℃較為合適.

2.1.6 浸提次數(shù)對(duì)紫晶生菜中花青素的提取率的影響

當(dāng)浸提次數(shù)為2次時(shí),紫晶生菜花青素提取率達(dá)到87%;當(dāng)浸提次數(shù)為3次時(shí),紫晶生菜花青素提取率達(dá)到96%,如圖6所示.實(shí)際生產(chǎn)中,浸提次數(shù)越多,提取率越高,但對(duì)應(yīng)的成本越高,時(shí)間越久.考慮成本,在濾渣浸提次數(shù)為1～2次時(shí),紫晶生菜花青素提取率較高,濾渣浸提次數(shù)為2次時(shí)的浸提效果更好.

圖5 浸提溫度對(duì)紫晶生菜花青素提取率的影響

圖6 浸提次數(shù)對(duì)紫晶生菜花青素提取率的影響

2.2紫晶生菜花青素提取的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

參照單因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果,對(duì)影響紫晶生菜中花青素提取效果的主要因素:固液比、提取劑濃度、浸提時(shí)間和浸提溫度進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),采用三水平四因素安排實(shí)驗(yàn),以確定最佳工藝參數(shù).實(shí)驗(yàn)浸提結(jié)果與數(shù)據(jù)計(jì)算如表2所示.根據(jù)各因素折算對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析.極差越大表明該因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響越大.

在正交實(shí)驗(yàn)中得出的最優(yōu)因素組合為A3B3C2D1方案,即以520 nm為最大吸收波長(zhǎng),分別取5 g紫晶生菜粉末于三角燒杯中,固液比為1/70,提取劑質(zhì)量濃度為0.07 g/mL,浸提時(shí)間為2 h,浸提溫度為60 ℃,濾渣提取次數(shù)2次.做三組平行實(shí)驗(yàn),測(cè)得紫晶生菜花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為7.21、7.22、7.24 mg/g.與正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相比,每組實(shí)驗(yàn)結(jié)果都是最優(yōu)的,故從正交實(shí)驗(yàn)得出的最佳優(yōu)工藝參數(shù)經(jīng)驗(yàn)證合理.

由上述單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析,能夠看出:單一因素對(duì)浸提效果的影響順序從大到小依次為提取劑濃度、固液比、浸提溫度、浸提時(shí)間.

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注:Ti表示正交實(shí)驗(yàn)中第i次實(shí)驗(yàn)的和,Xi表示正交實(shí)驗(yàn)中第i次實(shí)驗(yàn)的平均值,R表示極差.

3 討 論

花青素提取溶劑選擇主要是依據(jù)“相似相溶原理”.極性與花青素極性越接近,花青素在溶液中溶解度越大.目前,根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,花青素提取溶劑主要選擇甲醇和乙醇兩種,一般加入0.1%(體積分?jǐn)?shù))鹽酸進(jìn)行提取,因?yàn)榛ㄇ嗨卦谒嵝詶l件下,性質(zhì)較穩(wěn)定,不會(huì)很快分解.本實(shí)驗(yàn)采用檸檬酸進(jìn)行提取,安全、無(wú)毒、健康.

花青素在酸性條件下比較穩(wěn)定,但過(guò)度酸化容易破壞花青素的天然結(jié)構(gòu),所以一般采用醇溶液酸化法或者弱酸性的有機(jī)酸溶液作為提取劑提取花青素.生菜中花青素提取量隨pH值不同而變化,酸度的增加有利于色素的提取,但酸度太高,會(huì)降低色素的提取率,因此將提取劑的pH值調(diào)節(jié)在合適的范圍(2.5～3)內(nèi),可獲得較高的色素提取率,得到色澤鮮艷的生菜天然色素.本實(shí)驗(yàn)采用質(zhì)量濃度為0.05 g/mL的檸檬酸溶液作為提取溶劑,達(dá)到生菜最佳提取效果,與之相符[6-9].

浸提時(shí)間的延長(zhǎng)雖然有利于色素的提取,但較高溫度下的長(zhǎng)時(shí)間浸提將引起甘薯色素的降解,反而降低總的提取效率.實(shí)驗(yàn)表明,在70 ℃浸提2 h,可獲得較高的提取率.此浸提時(shí)間與樊婷等[7]以檸檬酸-乙醇為提取劑提取紫甘薯花青素中適宜浸提時(shí)間相同.

色素的提取率隨溫度的升高而增加,但浸提溫度超過(guò)70 ℃時(shí),對(duì)提高色素提取率的影響并不十分顯著,且有可能破壞花青素的基本結(jié)構(gòu)而影響其穩(wěn)定性,此溫度與樊婷等[7]以檸檬酸-乙醇為提取劑提取紫甘薯花青素中適宜浸提時(shí)間相同,比畢云楓等[6]提取紫甘薯花青素的最適浸提溫度(60 ℃)略高;這可能與材料種類和提取劑不一樣有關(guān).

本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn),在恒溫水浴中利用檸檬酸浸提法提取紫晶生菜中花青素,得到最優(yōu)工藝參數(shù)為:提取劑質(zhì)量濃度0.06 g/mL、浸提溫度70 ℃、固液比1/70、浸提時(shí)間2 h、濾渣提取2次.該提取方法操作簡(jiǎn)便,提取率高,成本低,且提取的花青素更具使用安全性.

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(責(zé)任編輯:顧浩然,郁 慧)

Optimizationoftechniqueforextractinganthocyaninsfromlettuce(Lactucasativa)

Yu Zhengyu, Liang Guifeng, Zhou Longyu, Xu Chenxi, Wang Quanhua, Cai Xiaofeng*

(Development Center of Plant Germplasm Resources,College of Life and Environmental Sciences,Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China)

We investigated the effects of extraction mass concentration,liquid-to-solid rate,temperature,and extraction time and frequency on the extraction rate of anthocyanin from purple lettuce by using citric acid solution as the extraction agent.Then,the orthogonal test of four factors and three levels were performed with the maximum absorption wavelength for 520 nm,and absorbance as response value.The effects of extraction temperature,extraction time,extract mass concentration and solid-liquid ratio on the extraction rate of anthocyanin were discussed through orthogonal test,and the optimum technique for extracting lettuce was obtained.The result showed the optimal extraction condition was as follows:citric acid mass concentration 0.06 g/mL,extraction temperature 70 ℃,ratio of material-liquid 1/70,extraction time 2 h,and extraction 2 times.

lettuce; citric acid; extraction; anthocyanins; extraction process

S 636.2

A

1000-5137(2017)05-0641-06

2017-08-23

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金(31501754);上海市協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目(ZF1205);上海植物種質(zhì)資源工程技術(shù)研究中心項(xiàng)目(17DZ2252700)

郁征宇(1993-),男,碩士研究生,主要從事蔬菜遺傳育種及分子生物學(xué)方面的研究.E-mail:1027506153@qq.com

導(dǎo)師簡(jiǎn)介: 蔡曉鋒(1986-),男,博士,講師,主要從事蔬菜遺傳育種及分子生物學(xué)方面的研究.E-mail:cxf0012@163.com

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