梅仕良, 姜 凱, 張娜娜, 鄭亦舟, 王 杰, 周昱曦, 趙 渝*

(1.上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 200234;2.貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國)有限公司,上海 200122)

流式細胞儀檢測技術(shù)在食源性致病菌檢測中的應(yīng)用

梅仕良1, 姜 凱1, 張娜娜1, 鄭亦舟1, 王 杰1, 周昱曦2, 趙 渝1*

(1.上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 200234;2.貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國)有限公司,上海 200122)

流式細胞術(shù)是一種靈敏度高,耗時短,程序簡便的定量細胞分析分選方法,廣泛應(yīng)用于微生物檢測、環(huán)境監(jiān)測、臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域,尤其在微生物檢測中表現(xiàn)突出.流式細胞術(shù)正逐步應(yīng)用于食源性致病菌的檢測,研究并介紹了流式細胞術(shù)在幾種食源性致病菌檢測中的應(yīng)用,該方法具有廣闊的發(fā)展前景.

流式細胞術(shù); 微生物; 食源性致病菌; 快速檢測

食品安全問題主要源于食物細菌性中毒,其中大多為食源性致病菌,已成為全球公共安全問題,必須得到有效解決[1].檢測食源性致病菌的傳統(tǒng)方法包括:顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)法、平板計數(shù)法;現(xiàn)代快速檢測方法包括:免疫層析試紙條技術(shù)、基于免疫學(xué)的ELISA技術(shù)、基因芯片技術(shù)、三磷酸腺苷(ATP)生物發(fā)光技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)等[2].雖然以上檢測技術(shù)準(zhǔn)確性高,但耗時長,不能滿足現(xiàn)場快速檢測的需求[3].

流式細胞術(shù)(FCM)是一種能檢測并分析細胞或微生物顆粒理化特征的定量方法[4],可同時分析多個參數(shù),既快速高效,又可大量收集并較為全面地分析數(shù)據(jù),靈活性很強,主要應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)的細胞分析[5].流式細胞儀的工作原理是待測液顆粒依次通過檢測區(qū),被熒光染色標(biāo)記的細胞在激光照射下激發(fā)光信號,光信號轉(zhuǎn)換成電信號被計算機識別,最后由軟件分析[6].目前,這一技術(shù)正向微生物檢測,食品安全監(jiān)測領(lǐng)域發(fā)展[7].

隨著熒光染料、免疫磁珠等的發(fā)展,FCM在食源性致病菌,如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、單核增生李斯特菌等的特異性檢測中已經(jīng)取得了豐富的研究成果[8].本文作者綜述了流式細胞術(shù)在食源性致病菌檢測中的研究近況.

1 金黃色葡萄球菌檢測

金黃色葡萄球菌是很典型的一種食源性致病菌[9],由于國家衛(wèi)生部嚴格限制其在食品中的含量,需要快速有效、準(zhǔn)確度高的方法[10].檢測金黃色葡萄球菌的傳統(tǒng)方法有:平板計數(shù)法、顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)法,耗時都較長,前者需要5～7 d;現(xiàn)代快速檢測方法包括免疫磁珠富集法、ELISA技術(shù)、PCR技術(shù)、核酸探針技術(shù)等.周莉等[11]運用PCR法快速檢測食品中的金黃色葡萄球菌,檢測時間為24 h,檢出限為10 CFU/g.Kim等[12]利用免疫磁珠富集法對牛奶中的金黃色葡萄球菌進行檢測,檢測靈敏度為2.8×102CFU/mL,檢測限達到5.0 CFU/mL.董曉林等[13]利用流式細胞術(shù),建立基于適配體識別的金黃色葡萄球菌的檢測方法,對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌(O157:H7)共同進行實驗,利用羥基熒光素(FAM)熒光素標(biāo)記的特異性適配體FAM-SA17對金黃色葡萄球菌進行特異性檢測,檢測時長為40 min,該方法檢測限較高,與適配體親和力有關(guān).

2 沙門氏菌檢測

沙門氏菌是食源性致病菌中極為普遍的一種,由其引起的食物中毒事件居世界首位[14].沙門氏菌的檢測方法有多種,較為傳統(tǒng)的國標(biāo)法,需要前增菌、增菌、分離、生化試驗和血清學(xué)鑒定,整個過程需4～7 d完成,耗時較長,步驟繁雜;現(xiàn)代快速檢測方法有:PCR技術(shù)、免疫磁珠富集技術(shù)、流式細胞術(shù)等.韓四海等[14]利用熒光定量PCR方法對肉類和奶制品中沙門氏菌進行檢測,檢測靈敏度達100 CFU/mL.以上方法均有較明顯的缺點,比如技術(shù)成本較高,因此難以廣泛應(yīng)用.王周平等[15]建立了一種利用適配體識別量子點標(biāo)記結(jié)合流式細胞術(shù)檢測鼠傷寒沙門氏菌的方法,其中需要制備用于量子點標(biāo)記的適配體探針,識別元件為適配體,熒光標(biāo)記物為量子點,檢測限為103CFU/mL,檢測時長少于40 min.該方法快速、準(zhǔn)確、靈敏,為流式細胞術(shù)的應(yīng)用開辟了一個新的方向.

3 大腸桿菌檢測

大腸桿菌是人類腸道的正常寄居菌,也存在于多種食物和飲用水中[16].大腸桿菌的常見檢測方法為多管發(fā)酵法和濾膜法,這兩種方法能夠檢測大部分食品樣品,但存在明顯的缺點,如檢測周期較長,操作過程繁雜,不能滿足快速檢測大腸桿菌的需求.流式細胞術(shù)在大腸桿菌檢測中早有應(yīng)用,王寧等[17]利用流式細胞術(shù)對經(jīng)過前處理的牛乳中的大腸桿菌進行檢測,利用經(jīng)碘化丙啶(PI)染色的特異性熒光抗體,對大腸桿菌進行特異性捕獲,檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠[18],檢測用時60 min,檢測限為103CFU/mL.Xue等[19]基于16S rRNA探針,利用流式細胞術(shù)檢測大腸桿菌,在大量其他菌存在情況下檢測到少許大腸桿菌細胞,所得結(jié)果準(zhǔn)確可靠,檢測時間相較傳統(tǒng)方法短.檢測限達到103CFU/mL.由此可見,流式細胞術(shù)可用于快速檢測食品中的大腸桿菌.

4 單核增生李斯特菌

單增李斯特菌在生活中多處存在,是常見的食源性致病菌,也是唯一能引起人體疾病的李斯特菌[20-21].其檢測方法有包括傳統(tǒng)檢測方法、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法等.傳統(tǒng)檢測方法過程繁雜,步驟多,耗時長,無法做到快速檢測單增李斯特菌[22].聞一名等[23]利用免疫磁珠結(jié)合選擇性培養(yǎng)基的方法檢測牛奶樣品中的單增李斯特菌,檢測時間為30 h,檢測限為0.7 CFU/mL,該法具有較高的檢測靈敏度,但檢測時間過長.Rodriquez-Lazaro等[24]用實時熒光PCR法檢測肉中的單增李斯特菌,檢測時間為27 h,檢測限為0.08～0.16 CFU/g,此法前期富集時間過長,因此也不符合快速檢測要求.黃生權(quán)等[25]利用流式細胞術(shù)對經(jīng)過核酸染料染色的單增李斯特菌進行檢測,此方法檢測限低(1.2×104cell/mL),同時也縮短了增菌時間,省略了復(fù)雜的增菌過程.Kyoko等[26]將免疫磁與流式細胞術(shù)結(jié)合檢測食品中的單增李斯特菌,檢測限達102～108CFU/mL,完成檢測的時間僅為1 min,很符合快速檢測單增李斯特菌的要求[27],今后流式細胞術(shù)在單增李斯特菌檢測中的應(yīng)用將會更加廣泛[28].表1為所敘述的幾種食源性致病菌的流式細胞術(shù)檢測參數(shù).

表1 幾種食源性致病菌的流式細胞術(shù)檢測相關(guān)參數(shù)

圖1 流式檢測技術(shù)流程簡圖

流式細胞儀技術(shù)檢測食源性致病菌流程圖如圖1所示.

5 結(jié)論與展望

因食源性致病菌導(dǎo)致的食物中毒事件頻繁發(fā)生,應(yīng)在第一時間內(nèi)快速檢測食源性致病菌[29].傳統(tǒng)以及其他現(xiàn)代快速檢測方法在檢測過程中表現(xiàn)出眾多不足[30],如重復(fù)性不夠好,分析某些化合物不夠清晰,對試劑有較高選擇性[31].流式細胞術(shù)表現(xiàn)出耗時短,低檢測限,高靈敏度等優(yōu)點[32].但是在流式細胞術(shù)發(fā)展過程中,也會產(chǎn)生一些不足[33],包括科研人員技術(shù)素質(zhì)要求,儀器設(shè)備的要求與價格,檢測樣品的廣度[34],以及現(xiàn)在還未應(yīng)用到各基層領(lǐng)域的檢測當(dāng)中等問題[35].如今,流式細胞術(shù)在各大領(lǐng)域如醫(yī)學(xué)臨床,食品安全微生物,藥物學(xué)等有眾多發(fā)現(xiàn)與研究成果[37].在檢測食源性致病菌領(lǐng)域尚且不夠成熟[38],對于其他方向,此為較新領(lǐng)域[39],未來流式細胞術(shù)用于食源性致病菌的檢測會更加快速,定量更加準(zhǔn)確,范圍越來越廣,具有很大的前景與發(fā)展空間[40].

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(責(zé)任編輯：顧浩然,馮珍珍)

ApplicationofFlowCytometrytechniqueindetectionoffoodbornepathogens

Mei Shiliang1, Jiang Kai1, Zhang Nana1, Zheng Yizhou1, Wang Jie1, Zhou Yuxi2, Zhao Yu1*

(1.Development Center of Plant Germplasm Resources,College of Life and Environmental Sciences,Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China;2.Beckman Coulter Trading (China) Limited,Shanghai 200122,China)

Flow Cytometry technique is a quantitative cell analysis method with characteristics such as high sensitivity,time-saving,simple procedure,which is widely applied in microbial detection,environmental monitoring,clinical medicine and other fields,especially in microbial detection.Flow Cytometry is being gradually applied in the detection of foodborne pathogens.This study introduced the application situation of Flow Cytometry technique on several foodborne pathogenic bacteria.It shows the technology has many advantages and a vast development future.

Flow Cytometry; microorganism; foodborne pathogens; quick analysis

Q 93-338

A

1000-5137(2017)05-0757-05

2017-08-31

上海市2017年度“科技創(chuàng)新行動計劃”(1714220300);上海植物種質(zhì)資源工程技術(shù)研究中心項目(17DZ2252700)

梅仕良(1994-),男,碩士研究生,主要從事食品微生物及應(yīng)用方面的研究.E-mail:18297309020@163.com

導(dǎo)師簡介: 趙 渝(1973-),男,博士,副教授,主要從事食品質(zhì)量安全控制方面的研究.E-mail:zhaoyu@shnu.edu.cn

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