孫曉梅, 喻娟娟, 高田祥, 孫旭武, 戴紹軍*

(1.上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 200234;2.東北林業(yè)大學(xué) 鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心,哈爾濱 150040)

植物葉片H2O2脅迫應(yīng)答蛋白質(zhì)組學(xué)分析

孫曉梅1, 喻娟娟2, 高田祥1, 孫旭武1, 戴紹軍1*

(1.上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 200234;2.東北林業(yè)大學(xué) 鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心,哈爾濱 150040)

植物葉片是感知外界H2O2脅迫信號(hào)的重要器官.整合分析了水稻(Oryzasativa)、小麥(Triticumaestivum)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)和柑橘(Citrusaurantium)在應(yīng)對(duì)不同程度H2O2脅迫時(shí)蛋白質(zhì)表達(dá)模式的變化特征.闡明了H2O2脅迫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)體系中的信號(hào)與代謝通路(如:光合作用、糖類與能量代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白質(zhì)合成與命運(yùn)、脅迫防御、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基礎(chǔ)代謝等)的變化及植物葉片應(yīng)答H2O2脅迫的分子調(diào)控機(jī)制.

植物; 葉片; H2O2脅迫; 蛋白質(zhì)組學(xué)

0 引 言

植物在進(jìn)行光合作用和呼吸作用時(shí),會(huì)產(chǎn)生各種活性氧分子(ROS).植物體內(nèi)ROS包括超氧陰離子自由基(O2?-)、過氧化氫(H2O2)、單線態(tài)氧(1O2)和羥自由基(OH)等,H2O2是植物細(xì)胞內(nèi)豐度較高的ROS之一.正常生理狀態(tài)下,植物體內(nèi)的ROS會(huì)保持在相對(duì)穩(wěn)定的水平,而各種脅迫條件會(huì)引起H2O2產(chǎn)生和清除失衡,導(dǎo)致H2O2在細(xì)胞內(nèi)大量積累.過量的H2O2對(duì)植物細(xì)胞造成氧化損傷[1-2].H2O2脅迫嚴(yán)重影響植物生長(zhǎng)發(fā)育,導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)量降低,品質(zhì)下降[3-5].H2O2影響脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等大分子的結(jié)構(gòu),破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性[3,6-7].H2O2可通過修飾氨基酸殘基,引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的改變(包括肽鍵斷裂、聚合和交聯(lián)等方式),從而對(duì)植物體造成氧化脅迫[8].另外,H2O2也可作為信號(hào)分子參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞防御和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生長(zhǎng)發(fā)育過程[9-10],例如,H2O2可觸發(fā)細(xì)胞程序性死亡[5,11-12].

深入研究植物應(yīng)答H2O2脅迫的分子機(jī)制對(duì)于提高作物抗性和培育耐氧化新品種具有重要意義[13-14].Desikan等[15]報(bào)道了在擬南芥中超過170個(gè)非冗余EST標(biāo)簽受到H2O2調(diào)節(jié),其中113種被誘導(dǎo),62種被抑制.研究表明,擬南芥通過光誘導(dǎo)過氧化氫酶缺失突變體產(chǎn)生H2O2,此過程中349個(gè)轉(zhuǎn)錄本上調(diào),88個(gè)轉(zhuǎn)錄本下調(diào).這些轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究初步構(gòu)建了植物H2O2脅迫應(yīng)答的分子網(wǎng)絡(luò)框架[6,13,15-16],參與體內(nèi)ROS平衡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、光合作用、能量代謝、脂質(zhì)代謝,以及蛋白質(zhì)合成與周轉(zhuǎn)的蛋白質(zhì)在H2O2應(yīng)答過程中起重要作用.然而,由于存在轉(zhuǎn)錄可變剪切、蛋白質(zhì)翻譯后修飾、蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位等調(diào)控機(jī)制,轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究并不能全面揭示植物H2O2脅迫應(yīng)答的分子機(jī)制.

近年來,植物葉片H2O2應(yīng)答蛋白質(zhì)組學(xué)研究為從系統(tǒng)生物學(xué)水平深入認(rèn)識(shí)植物H2O2脅迫的網(wǎng)絡(luò)協(xié)同應(yīng)答機(jī)制提供了重要信息[17].目前,小麥(Triticumaestivum)[1]、水稻(Oryzasativa)[3]、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)[18]和柑橘(Citrusaurantium)[19]等物種應(yīng)答H2O2脅迫的蛋白質(zhì)表達(dá)譜,及372種H2O2脅迫響應(yīng)蛋白質(zhì)豐度變化特征(表1)已得到[1,3,18-19].以上研究結(jié)果來自于不同的實(shí)驗(yàn)室,對(duì)蛋白質(zhì)命名和功能分類的標(biāo)準(zhǔn)各異,因此,本文作者整合分析了植物H2O2脅迫(0.6～20 mmol·L-1處理2 h～5 d)應(yīng)答蛋白質(zhì)的表達(dá)特征,旨在為解釋H2O2脅迫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)體系中的信號(hào)與代謝通路提供線索.

表1 植物H2O2脅迫應(yīng)答蛋白質(zhì)組學(xué)研究的對(duì)象與內(nèi)容

a)鑒定到的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)量;b)鑒定到的非冗余蛋白質(zhì)數(shù)量(豐度上升蛋白質(zhì)數(shù)量/豐度下降蛋白質(zhì)數(shù)量)

1 H2O2抑制植物光合作用

H2O2脅迫導(dǎo)致植物葉綠體類囊體膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,并影響光系統(tǒng)Ⅱ、光系統(tǒng)Ⅰ和碳同化作用相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)與活性,從而降低植物的光合速率.Wan等[3]研究發(fā)現(xiàn),H2O2處理后水稻葉片中凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(Ts)均下降,這表明H2O2處理導(dǎo)致氣孔關(guān)閉,減少水分蒸騰.

H2O2影響植物光反應(yīng)過程.光反應(yīng)發(fā)生在葉綠體類囊體中,通過光合色素分子吸收光能分解水,激活電子傳遞鏈和光合磷酸化過程,將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能,形成腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)和煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH).葉綠素a/b結(jié)合蛋白(CAB)能夠捕獲光能,并將激發(fā)態(tài)能量傳遞到各自的光反應(yīng)中心.Wan等[3]在H2O2處理的水稻葉片中發(fā)現(xiàn)兩種CAB豐度下降,這可能影響葉片捕獲光的能力.此外,放氧復(fù)合體(OEC)位于類囊體膜基粒片層外側(cè),是光系統(tǒng)Ⅱ的重要成員,能夠裂解水并釋放氧氣.H2O2脅迫下水稻葉片中的OEC豐度上升有利于促進(jìn)水光解放氧.

蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果表明光合電子傳遞過程也受到H2O2脅迫的影響.細(xì)胞色素b6f復(fù)合體連接PSII到PSI的電子傳遞過程,氧化質(zhì)醌,并產(chǎn)生跨膜質(zhì)子梯度,催化ATP合成.細(xì)胞色素b6是細(xì)胞色素b6f復(fù)合體的一部分,參與光誘導(dǎo)的光合電子傳遞過程,起電子載體的作用.研究發(fā)現(xiàn),在H2O2脅迫下,小麥葉片中的細(xì)胞色素b6豐度下降,這可能導(dǎo)致光合電子傳遞過程減緩,進(jìn)而抑制光合作用[1].

參與碳同化過程的多種酶的豐度也受到H2O2脅迫的影響.核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCO)是葉片中含量最豐富的蛋白質(zhì),具有羧化酶和加氧酶雙重活性,是光合作用中決定碳同化速率的關(guān)鍵酶,同時(shí)也參與植物光呼吸途徑.RuBisCO活化酶(RCA)可以催化RuBisCO從無活性狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚誀顟B(tài).蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明,在20 mmol·L-1H2O2處理4～6 h條件下,二穗短柄草葉片中RuBisCO豐度上升[18].與之相反,3～15 mmol·L-1H2O2處理5 d的小麥葉片中RuBisCO豐度下降[1].此外,在0.6～15 mmol·L-1H2O2處理6～8 h條件下,水稻和柑橘葉片中RuBisCO大亞基和RCA的豐度也發(fā)生改變[3,19].這表明,各種植物中的RuBisCO和RCA對(duì)H2O2都十分敏感,并且在不同條件下呈現(xiàn)多樣化的表達(dá)模式,從而調(diào)節(jié)碳同化速率.

2 H2O2誘導(dǎo)糖類與能量代謝動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)

糖類與能量代謝過程(糖酵解途徑、三羧酸循環(huán)等)對(duì)于植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境應(yīng)答具有重要作用.糖酵解相關(guān)酶的豐度受到H2O2的影響.在0.3～20 mmol·L-1H2O2處理2 h～5 d條件下,小麥葉片中的葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(glucose-6-phosphate isomerase)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase)和甘油醛3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase),以及水稻、小麥、二穗短柄草和柑橘葉片中的果糖二磷酸醛縮酶(fructose-bisphosphate aldolase)豐度下降[1,3,18-19].相反,在10～20 mmol·L-1H2O2處理4～8 h條件下,柑橘葉片中的烯醇化酶(EA)、二穗短柄草和柑橘葉片中的磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase)豐度上升[18-19].此外,水稻葉片中的磷酸甘油酸變位酶(phosphoglycerate mutase)在受到H2O2脅迫(0.6～3 mmol·L-1H2O2處理6 h)時(shí)豐度也上升[3].

在H2O2脅迫下,一些三羧酸循環(huán)相關(guān)酶的豐度也受到影響.檸檬酸合酶(CS)能催化來自糖酵解或其他異化反應(yīng)的乙酰CoA與草酰乙酸縮合形成檸檬酸,決定了乙酰CoA進(jìn)入三羧酸循環(huán)的速率,是三羧酸循環(huán)中的限速酶.在H2O2脅迫下,柑橘葉片中CS豐度下降,這可能影響三羧酸循環(huán)速率[19].另外,異檸檬酸脫氫酶(IDH)是三羧酸循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶,此酶能在細(xì)胞質(zhì)中生成NAPDH,后者是ROS清除系統(tǒng)中谷胱甘肽還原酶的重要輔酶.H2O2處理的二穗短柄草葉片中IDH豐度上升[18],這可能有利于加強(qiáng)三羧酸循環(huán)為植物提供能量,也能在清除ROS過程中發(fā)揮一定的作用.

此外,其他參與糖類與能量代謝的酶的豐度也受到H2O2影響.丙酮酸脫氫酶復(fù)合體催化丙酮酸氧化脫羧生成乙酰CoA,是連接糖酵解與三羧酸循環(huán)的紐帶,而丙酮酸脫氫酶(PDH)和硫胺素焦磷酸是構(gòu)成丙酮酸脫氫酶復(fù)合體必不可少的酶和輔因子.H2O2脅迫導(dǎo)致柑橘葉片中PDH豐度下降,影響丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的生成,進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)能量代謝[19].此外,在0.6～15 mmol·L-1H2O2處理6 h～5 d條件下,其他參與糖類與能量代謝過程的酶,如小麥葉片中的肉桂醇脫氫酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase)和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase),以及水稻葉片中的UDP葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase)和ADP葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase)豐度上升.此外,Wan等[3]在H2O2處理的水稻葉片發(fā)現(xiàn)ATP合成酶β亞基豐度上升,這將有利于促進(jìn)ATP合成,為抵御脅迫提供更多的能量支持.

3 H2O2影響轉(zhuǎn)錄、翻譯與翻譯后調(diào)控

轉(zhuǎn)錄調(diào)控是植物應(yīng)答H2O2脅迫的重要策略之一.組蛋白是真核生物染色體的基本結(jié)構(gòu)蛋白,是一類小分子堿性蛋白質(zhì),它與帶負(fù)電荷的雙螺旋DNA結(jié)合成DNA-組蛋白復(fù)合物.DNA結(jié)合蛋白又稱單鏈結(jié)合蛋白(SSB),能結(jié)合于螺旋酶沿復(fù)制叉方向向前推進(jìn)產(chǎn)生的單鏈區(qū),防止新形成的單鏈DNA重新配對(duì)形成雙鏈DNA.蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),H2O2處理的小麥葉片中組蛋白豐度上升,SSB豐度下降[1].這表明H2O2脅迫影響植物DNA復(fù)制過程.此外,基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控包括pre-mRNA的剪切、編輯、運(yùn)輸、穩(wěn)定性保持和降解、翻譯等多個(gè)過程,對(duì)逆境應(yīng)答十分重要.RNA結(jié)合蛋白通過和RNA的相互作用來調(diào)節(jié)細(xì)胞功能,對(duì)轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)節(jié)起著重要作用.蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),3～15 mmol·L-1H2O2處理6 h的水稻葉片中,mRNA結(jié)合蛋白(mRNA-binding protein)豐度發(fā)生變化[3].這暗示著部分基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控受到H2O2脅迫的影響.

蛋白質(zhì)合成是植物體最重要的生命活動(dòng)之一,H2O2脅迫導(dǎo)致參與蛋白質(zhì)合成的蛋白質(zhì)豐度改變.真核起始因子(eIF)是蛋白質(zhì)翻譯起始過程中的重要成員之一.蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),H2O2處理的小麥葉片中的eIF,以及水稻葉片中的eIF4A的豐度都下降[1,3],而15 mmol·L-1H2O2處理5 d的小麥葉片中eIF上升.這表明H2O2脅迫影響了植物蛋白質(zhì)翻譯的起始.此外,延伸因子(EF)通過催化核糖體上氨基酸鏈的延伸來參與調(diào)控蛋白質(zhì)合成過程.EF-Tu在蛋白質(zhì)合成轉(zhuǎn)運(yùn)氨酰tRNA進(jìn)入核糖體A位過程中發(fā)揮作用.EF-G可以使核糖體沿mRNA移動(dòng),使下一個(gè)密碼子暴露出來供繼續(xù)翻譯.Wan等[3]在H2O2處理的水稻葉片中發(fā)現(xiàn)EF-Tu和EF-G豐度變化.另外,核糖體蛋白(Ribosomal protein)是翻譯系統(tǒng)的重要成員.Ge等[1]在H2O2處理的小麥葉片中發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白L30、40S核糖體蛋白S2和60S核糖體蛋白L37豐度上升,而核糖體蛋白L2、核糖體蛋白L12和核糖體蛋白L16豐度下降.在0.6～15 mmol·L-1H2O2處理6 h條件下,二穗短柄草葉片中30S核糖體蛋白S10豐度上升[18],水稻葉片中核糖體蛋白S5、核糖體蛋白S15和50S核糖體蛋白L12豐度下降[3].這些核糖體蛋白的變化表明,H2O2脅迫影響了葉片內(nèi)蛋白質(zhì)合成過程.

蛋白質(zhì)正確折疊與加工在植物H2O2脅迫應(yīng)答過程中尤為重要.熱激蛋白(HSP)是細(xì)胞內(nèi)含量最豐富的蛋白質(zhì)之一,在蛋白質(zhì)折疊、組裝、胞內(nèi)定位、運(yùn)輸,以及防止蛋白降解,激活損傷蛋白與維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性等方面都有重要作用.HSP70和HSP90是熱激蛋白的2個(gè)主要家族,HSP70參與蛋白質(zhì)折疊、組裝以及對(duì)脅迫的應(yīng)答反應(yīng),HSP90是具有ATP酶活性的分子伴侶,能與轉(zhuǎn)錄調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)相互作用.在0.6～20 mol·L-1H2O2處理6 h條件下,二穗短柄草葉片中的HSP70以及水稻葉片中的HSP70和HSP90豐度均下降[3,18].這表明在H2O2脅迫下,HSP70與HSP90共同作用,影響蛋白質(zhì)正確折疊與加工.胞質(zhì)HSP70是HSP70的一種亞型,在正常環(huán)境下,胞質(zhì)HSP70抑制熱激因子的功能,熱激環(huán)境下,胞質(zhì)HSP70瞬時(shí)失活,熱激因子被激活,從而調(diào)控含有熱激應(yīng)答元素下游基因的表達(dá).Wan等[3]在H2O2處理的水稻葉片中發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)HSP70豐度下降.此外,其他一些參與蛋白質(zhì)折疊、組裝的蛋白質(zhì)豐度也發(fā)生變化.DnaK型分子伴侶(DnaK-type molecular chaperone BiP)也參與植物對(duì)H2O2脅迫的應(yīng)答過程.在3 mmol·L-1H2O2處理6 h水稻葉片中,DnaK豐度下降[3].肽基-脯氨酰順反異構(gòu)酶(PPTI)參與蛋白質(zhì)折疊、組裝.在20 mmol·L-1H2O2處理的二穗短柄草葉片中,PPTI在4 h時(shí)豐度上升,在6 h時(shí)豐度下降[18].這表明H2O2脅迫影響了蛋白質(zhì)的折疊與加工過程.

參與蛋白質(zhì)降解過程的蛋白質(zhì)也受到H2O2脅迫的影響.植物細(xì)胞通過特定機(jī)制識(shí)別氧化損傷的蛋白質(zhì),并將其定位到20S蛋白酶體,通過依賴泛素的方式進(jìn)行降解.蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),在10 mmol·L-1H2O2處理8 h的柑橘葉片中,20S蛋白酶體α亞基豐度下降[19].在9 mmol·L-1H2O2處理5 d的小麥葉片中,蛋白酶體β亞基豐度下降[1].這表明,長(zhǎng)時(shí)間H2O2脅迫抑制了20S蛋白酶體的作用,蛋白質(zhì)可能轉(zhuǎn)為其他不依賴于蛋白酶體的方式降解.

4 H2O2激活植物ROS清除等防御機(jī)制

H2O2脅迫導(dǎo)致植物體內(nèi)積累過量的ROS,對(duì)蛋白質(zhì)、DNA和脂類等物質(zhì)造成氧化損傷.植物體內(nèi)多種抗氧化酶系統(tǒng)對(duì)于清除過量H2O2,維持體內(nèi)ROS穩(wěn)態(tài)具有重要作用.

超氧化物歧化酶(SOD)是O2?-的主要清除者,可以催化O2?-發(fā)生歧化反應(yīng),生成H2O2和O2,是植物體內(nèi)ROS清除系統(tǒng)的第一道防線.蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),在3～20 mmol·L-1H2O2處理4 h～5 d條件下,小麥葉片中的[Cu-Zn]SOD和二穗短柄草葉片中的[Mn]SOD的豐度上升,而20 mmol·L-1H2O2處理2 h導(dǎo)致二穗短柄草葉片中[Mn]SOD的豐度下降[1,18].這表明,不同SOD家族成員在應(yīng)答H2O2脅迫過程中的作用存在差異.

此外,參與清除H2O2的過氧化物酶(peroxidase,POD)、過氧化物氧還蛋白/硫氧還蛋白(peroxiredoxin/thioredoxin,Prx/Trx)、抗壞血酸-谷胱甘肽(ascorbic acid-glutathione,AsA-GSH)循環(huán)以及谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)途徑在不同植物應(yīng)答H2O2脅迫過程中豐度發(fā)生變化.POD是一種由多基因家族編碼含血紅素的糖蛋白,它能夠利用多種電子供體(如酚類化合物、木質(zhì)素前體、生長(zhǎng)素以及次級(jí)代謝產(chǎn)物等)來催化H2O2的還原反應(yīng),是清除H2O2的重要保護(hù)酶.蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明,3～15 mmol·L-1H2O2處理5 d的小麥葉片中POD豐度下降[1],這可能抑制了POD途徑.此外,Prx可以利用巰基催化機(jī)制還原H2O2,而Trx則有助于還原態(tài)Prx的再生.在3 mmol·L-1H2O2處理5 d的小麥葉片中Prx和Trx豐度均下降,這將導(dǎo)致H2O2積累,損傷植物細(xì)胞[1].AsA-GSH循環(huán)作為重要的抗氧化途徑參與細(xì)胞質(zhì)、線粒體、葉綠體和過氧化物酶體中的H2O2清除.其中,抗壞血酸過氧化物酶(APX)以AsA為電子受體催化H2O2還原生成H2O和單脫氫抗壞血酸.0.6～15 mmol·L-1H2O2處理6 h水稻葉片中APX的豐度,以及20 mmol·L-1H2O2處理4 h的二穗短柄草葉片中APX的豐度都下降[1,3].此外,GST能緩解ROS造成的氧化損傷,在保護(hù)植物免受氧化損傷過程中具有重要作用.研究表明,在0.6～15 mmol·L-1H2O2處理6 h～5 d條件下,水稻和小麥葉片中GST豐度上升,而10～20 mmol·L-1H2O2處理6～8 h導(dǎo)致二穗短柄草和柑橘葉片中GST豐度下降[1,3,18-19].這些ROS清除途徑的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)對(duì)于植物應(yīng)對(duì)H2O2脅迫具有重要意義.

此外,晚期胚胎富集蛋白(LEA)作為防御相關(guān)蛋白質(zhì)在植物應(yīng)答H2O2脅迫過程中發(fā)揮重要作用.研究表明,在15 mmol·L-1H2O2處理5 h條件下,小麥葉片中LEA豐度上升,而3 mmol·L-1H2O2處理5 h時(shí)的小麥葉片中LEA豐度下降[1].這為L(zhǎng)EA在植物應(yīng)答H2O2脅迫過程中的重要作用提供了新的證據(jù).

5 G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路參與脅迫信號(hào)感知與傳遞

G蛋白是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中具有重要作用的分子開關(guān).小G蛋白具有與G蛋白相似的功能,參與多種應(yīng)答脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程.植物中G蛋白/小G蛋白參與感知脅迫信號(hào),并以下游Ca2+作為第二信使,調(diào)控蛋白質(zhì)可逆磷酸化,將信號(hào)傳遞并放大,從而調(diào)控基因表達(dá)和各種細(xì)胞代謝通路.蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),Ca2+信號(hào)通路相關(guān)的G蛋白和小G蛋白在H2O2脅迫下發(fā)生變化.在0.6～15 mmol·L-1H2O2處理6 h條件下,水稻葉片中G蛋白和小G蛋白豐度均上升,在15 mmol·L-1H2O2處理5 d條件下,小麥葉片中G蛋白豐度上升[1,3].這兩者豐度上升暗示著G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路受到H2O2脅迫的誘導(dǎo).

蛋白質(zhì)可逆磷酸化在植物脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的開閉與信號(hào)級(jí)聯(lián)放大過程中具有重要作用.蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),參與調(diào)控蛋白質(zhì)可逆磷酸化過程的核苷二磷酸激酶(NDPK)和14-3-3蛋白都受到H2O2脅迫的影響.NDPK作為一種重要的蛋白激酶,可以利用ATP來維持細(xì)胞內(nèi)CTP、GTP與UTP的正常水平,也參與由H2O2介導(dǎo)的有絲分裂源激活蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑.在3 mmol·L-1H2O2處理5 d條件下,小麥葉片中NDPK豐度下降[1].此外,在3～15 mmol·L-1H2O2處理5 d條件下,小麥葉片中磷酸酶2豐度下降[1].這些變化表明,蛋白質(zhì)可逆磷酸化過程受到影響.14-3-3蛋白參與G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路中下游事件的調(diào)節(jié)過程,如通過調(diào)控信號(hào)通路中的蛋白質(zhì)(如:蛋白激酶、磷酸酶、磷脂酶等)的可逆磷酸化調(diào)控基因表達(dá),或者通過改變蛋白質(zhì)(如:谷胱甘肽還原酶、乙烯合成酶、細(xì)胞色素P450蛋白)參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄激活和脅迫防御等過程來參與H2O2脅迫應(yīng)答.蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明,在20 mmol·L-1H2O2處理2 h條件下,二穗短柄草葉片中的14-3-3蛋白豐度下降,而H2O2處理4 h時(shí),二穗短柄草葉片中的14-3-3蛋白豐度上升[18].由此可見,14-3-3蛋白在植物應(yīng)對(duì)H2O2脅迫過程中具有重要意義.

6 H2O2脅迫影響植物氨基酸代謝

谷氨酰胺合成酶(GS)是催化氨轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C(jī)含氮物的主要酶,能將游離氨轉(zhuǎn)變?yōu)轷０坊鶊F(tuán),催化谷氨酸和氨形成谷氨酰胺.蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),在15 mmol·L-1H2O2處理6 h的水稻葉片中GS豐度上升,而H2O2處理5 d的小麥葉片中GS豐度下降[1,3].這表明短時(shí)間脅迫下GS豐度上升,啟動(dòng)積極應(yīng)答模式,而長(zhǎng)時(shí)間H2O2脅迫可能會(huì)抑制GS表達(dá).半胱氨酸合成酶(CS)參與半胱氨酸的合成,將土壤中的硫同化為半胱氨酸.在0.6～15 mmol·L-1H2O2處理6 h的水稻葉片中CS豐度上升[3].此外,S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)能合成S-腺苷甲硫氨酸,S-腺苷甲硫氨酸是一種參與甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的輔酶,也是合成谷胱甘肽的轉(zhuǎn)硫過程和合成多胺的轉(zhuǎn)氨丙基過程的前體分子,并且還與多種酶的活性有關(guān).蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果表明,3～15 mmol·L-1H2O2處理6 h條件的水稻葉片中SAMS豐度上升[3].這兩種氨基酸合成酶豐度上升表明植物通過加強(qiáng)氨基酸的合成與代謝應(yīng)對(duì)H2O2脅迫.另外,其他氨基酸代謝也受到H2O2的影響.天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AAT)催化谷氨酸鹽與草酰乙酸反應(yīng)生成天冬氨酸與氧化戊二酸.在10 mmol·L-1H2O2處理8 h條件下,柑橘葉片中AAT豐度下降[19].這表明天冬氨酸的合成過程可能受到H2O2的影響.支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(BCAT)催化支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)發(fā)生可逆的轉(zhuǎn)氨基作用形成相應(yīng)的酮酸,再經(jīng)支鏈氨基酸脫氫酶催化進(jìn)行不可逆的氧化脫羧反應(yīng).異亮氨酸降解為丙酰CoA和乙酰CoA;纈氨酸降解為琥珀酰CoA;分別參加成糖和成酮反應(yīng),進(jìn)入三羧酸循環(huán).蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果表明,9～15 mmol·L-1H2O2處理5 d條件的小麥葉片中BCAT豐度上升,這暗示著支鏈氨基酸代謝受到H2O2脅迫的影響[1].

7 結(jié)論與展望

植物葉片是感知H2O2信號(hào)的重要器官,研究葉片對(duì)H2O2的應(yīng)答機(jī)制具有重要意義.蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果為解析植物葉片H2O2應(yīng)答的分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制提供了新的重要線索(圖1),主要包括:(1)利用G蛋白/小G蛋白介導(dǎo)的多種信號(hào)通路與NDPK和14-3-3蛋白共同調(diào)控目標(biāo)蛋白質(zhì)可逆磷酸化過程感知并傳遞H2O2信號(hào);(2)通過調(diào)節(jié)抗氧化酶系統(tǒng)以及合成其他防御物質(zhì)降低體內(nèi)過量ROS造成的傷害;(3)通過調(diào)整糖類與能量代謝調(diào)節(jié)體內(nèi)能量供應(yīng)水平;(4)通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白質(zhì)翻譯與翻譯后修飾等多個(gè)水平的調(diào)控來調(diào)節(jié)基因表達(dá)與蛋白質(zhì)功能;(5)調(diào)整光反應(yīng)和碳同化相關(guān)酶的豐度,抵御H2O2對(duì)光合作用的抑制;(6)通過調(diào)節(jié)參與氨基酸代謝降低H2O2對(duì)植物造成的傷害.

目前,由于受到蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法的限制,植物葉片H2O2應(yīng)答蛋白質(zhì)組學(xué)研究仍存在以下幾點(diǎn)不足:(1)研究對(duì)象局限于水稻、小麥、二穗短柄草和柑橘等幾個(gè)物種;(2)缺乏對(duì)H2O2應(yīng)答低豐度蛋白質(zhì)的分析,也缺乏受H2O2影響的蛋白質(zhì)氧化還原位點(diǎn)的分析;(3)缺乏對(duì)H2O2應(yīng)答蛋白質(zhì)的分子遺傳學(xué)分析.因此,今后需利用修飾組學(xué)技術(shù)精準(zhǔn)分析蛋白質(zhì)應(yīng)答H2O2的氨基酸位點(diǎn),并利用生化與分子生物學(xué)技術(shù)深入分析蛋白質(zhì)功能.

圖1 蛋白質(zhì)組學(xué)研究揭示的植物葉片H2O2脅迫應(yīng)答機(jī)制

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(責(zé)任編輯:顧浩然,馮珍珍)

H2O2-responsiveproteomicsinplantleaves

Sun Xiaomei1, Yu Juanjuan2, Gao Tianxiang1, Sun Xuwu1, Dai Shaojun1*

(1.Development Center of Plant Germplasm Resources,College of Life and Environmental Sciences,Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China;2.Alkali Soil Natural Environmental Science Center,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China)

Plant leaves are important organ for sensing H2O2signals.This paper analyzes the diverse prote in patterns in plants such asOryzasativa,Triticumaestivum,BrachypodiumdistachyonandCitrusaurantiumunder various H2O2stress conditions.The change of signaling and metabolic pathways (such as photosynthesis,carbohydrate and energy metabolism,transcriptional regulation,protein synthesis and fate,stress and defense,signal transduction,basal metabolism,etc.) when the leaves put in H2O2-responsive networks were clarified.And the molecular regulatory mechanism of response to H2O2stress in plant leaves was expounded as well.

plant; leaf; H2O2-responsive; proteomics

Q 946.1

A

1000-5137(2017)05-0713-07

2017-09-14

上海市科委地方院校能力建設(shè)項(xiàng)目(14390502700);上海高?！皷|方學(xué)者”特聘教授項(xiàng)目(2011);上海植物種質(zhì)資源工程技術(shù)研究中心項(xiàng)目(17DZ2252700)

孫曉梅(1993-),女,碩士研究生,主要從事植物逆境蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究.E-mail:1243695179@qq.com

導(dǎo)師簡(jiǎn)介: 戴紹軍(1972-),男,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事植物蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究.E-mail:daishaojun@hotmail.com

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