劉蘭婷 王 玉 宋繼權(quán) 裴 颯 歐運超

·論著·

PSMA6/PSMC6/PSMA3基因多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病的相關(guān)性

劉蘭婷1王 玉2宋繼權(quán)1裴 颯1歐運超1

目的明確蛋白酶體(PSM)相關(guān)基因單核苷酸多態(tài)性與中國人群系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的相關(guān)性。方法PCR擴增101例SLE患者和143名正常對照者外周血目的基因片段,通過二代測序?qū)δ康幕蚱芜M行測序檢測蛋白酶體20 s亞單位和相關(guān)ATP酶基因的4個目標(biāo)位點PSMA6(rs2277460)，PSMA3(rs2348071)，PSMC6(rs2295826，rs2295827)的基因型及等位基因頻率。結(jié)果SLE組及對照組中rs2277460(GG,GA、AA)基因型頻率分別為97.22%,1.85%%,0.93%和96.5%，3.5%，0；rs2348071AA，AG，GG分別為30.56%、53.7%、15.74%和33.57%、50.35%、16.08%；rs2295826AA，AG，GG分別為75.93%、24.07%、0和69.23%、29.37%、1.4%；rs2295827CC、CT、TT分別為78.7%、19.45%、1.85%和76.22%、20.98%、2.8%，均無統(tǒng)計學(xué)差異(Pgt;0.05)。結(jié)論PSMA6/PSMC6/PSMA3 SNPs可能與SLE的發(fā)病無關(guān)。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡； 蛋白酶體； ATP酶； 單核苷酸基因多態(tài)性

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是一種復(fù)雜的自身免疫性疾病，以產(chǎn)生非器官特異性的自身抗體，免疫復(fù)合物沉積及多系統(tǒng)損害為特征，具有多種臨床表現(xiàn)[1]。其發(fā)病率約為(7.4～159.4)/10萬人。該疾病常進行性加重，不能根治，預(yù)后不良，是危害健康的重要公共衛(wèi)生問題，因此SLE發(fā)病機制的研究也是皮膚科疾病、代謝疾病、風(fēng)濕疾病等領(lǐng)域研究的重點和難點。

SLE是一種高度遺傳異質(zhì)性疾病，其發(fā)病機制可以涉及細(xì)胞與體液免疫多個環(huán)節(jié)的異常。有證據(jù)表明泛素化在免疫應(yīng)答的過程中發(fā)揮了重要作用[2]。在一些自身免疫性疾病及代謝性疾病中，均存在NF-kB通路的異常激活，以及前炎癥因子的轉(zhuǎn)錄異常，已知泛素化NF-kB轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要方式。其中，已證實編碼泛素蛋白連接酶的基因UBC2L3在SLE中存在基因多態(tài)性[3]。有研究報道編碼蛋白酶體的相關(guān)基因PSMA6/PSMA3/PSMC6與一些免疫性及代謝性疾病相關(guān)，例如多發(fā)性硬化(MS)、支氣管哮喘(BA)、1型糖尿病等[4]。Alireza等證實在多發(fā)性硬化的患者中，可測得循環(huán)中蛋白酶體濃度顯著升高[5]。但是目前尚沒有研究表明蛋白酶體相關(guān)的基因多態(tài)性與SLE發(fā)病之間存在相關(guān)性。本文主要研究中國地區(qū)人群泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)相關(guān)基因位點PSMA6(rs2277460)，PSMA3(rs2348071)，PSMC6(rs2295826，rs2295827)多態(tài)性與SLE的相關(guān)性，以探討UPS在SLE發(fā)病過程中可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 108例SLE女性患者資料均收集于2015年6月至2016年4月武漢大學(xué)中南醫(yī)院和武漢大學(xué)人民醫(yī)院門診和住院患者，年齡中位數(shù)為38.5歲。所有患者均符合1997年美國風(fēng)濕協(xié)會修訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。對照組143名健康體檢者來自武漢大學(xué)中南醫(yī)院體檢中心，年齡中位數(shù)為41歲，經(jīng)實驗室檢查及問卷調(diào)查排除了SLE、干燥綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、皮肌炎等自身免疫性疾病，且一，二，三級親屬中無SLE患者。所有受試者間均無血緣關(guān)系，且兩組的年齡分布無統(tǒng)計學(xué)差異(Pgt;0.05)。本次實驗通過了武漢大學(xué)中南醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，所有實驗受試者均簽署了知情同意書。

1.2 儀器與試劑 5424臺式離心機(Eppendorf公司)；S1000 Thermal Cycler PCR儀(美國BIO-RAD公司)；DYY-6C電泳儀(北京六一儀器廠)；Tanon1600凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；2xTsingKe Master Mix(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)；血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，DP318；百泰克生物技術(shù)有限公司，DP6101)

1.3 實驗方法 (1)采集受試者外周靜脈血5 mL，保存于-4℃環(huán)境中。(2)采用血液DNA提取試劑盒提取DNA(苯酚-蛋白酶K法)，采用紫外分光光度法測定DNA濃度，A260/A280gt;1.8,于-20℃保存。(3)PCR擴增目的基因，引物合成見表1。以下引物由武漢邦達(dá)生物科技有限公司合成。擴增條件為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)35次，末次72℃延伸5 min。(4)瓊脂糖凝膠電泳：將擴增的產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳，以驗證擴增結(jié)果(圖1)。(5)測序：由武漢邦達(dá)生物技術(shù)有限公司對PCR產(chǎn)物進行二代測序。(6)統(tǒng)計學(xué)方法：根據(jù)二代測序結(jié)果，利用直接計數(shù)法對基因型與等位基因頻率進行統(tǒng)計，利用SPSS 17.0對實驗組及對照組基因型頻率及等位基因分布差異進行χ2檢驗，當(dāng)Plt;0.05時，兩組頻數(shù)有統(tǒng)計學(xué)差異。

圖1 rs2277460，rs2295826，rs2295827，rs2348071 (從左到右)PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖

SNP位點上游引物下游引物rs22774605＇CTTTAAACACAATCCCTGGGC3＇5＇GCATGCAAGAGCGGAAGAA3＇rs23480715＇TTTCAGTCTAAGGCAGGGATG3＇5＇CTTACACCGAGCTTCCCCAG3＇rs22958265＇TTTTGTTGTTATACATGCCACC3＇5＇GTGTTTAAGTCGCTACGTCTCAC3＇rs22958275＇GTTGTTATACATGCCACCTACTCA3＇5＇CTGTAGGGCCTTCAGATCATTT3＇

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗 分別對實驗組、對照組各基因型的頻數(shù)及理論頻數(shù)進行H-W平衡檢驗，四個位點在兩組的分布均符合H-W平衡定律(Pgt;0.05)，表明所選取的樣品符合遺傳平衡定律，可以代表總體人群。

2.2 基因型頻率及等位基因頻率(表2) PSMA6(rs2277460)GG，GA，AA基因型頻率在SLE組與對照組中分別為97.22%，1.85%，0.93%和96.50%，3.50%，0，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)，G，A等位基因頻率在SLE組與對照組中分別為98.15%，1.85%和98.25%，1.75%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05);PSMA3(rs2348071)AA，AG，GG基因型頻率在SLE組與對照組中分別為30.56%，53.70%，15.74%和33.57%，50.35%，16.08%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)，A，G等位基因頻率在SLE組與對照組中分別為57.41%，42.59%和58.74%，41.26%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05);PSMC6(rs2295826)AA，AG，GG基因型頻率在SLE組與對照組中分別為75.93%，24.07%，0和69.23%，29.37%，1.4%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)，A，G等位基因頻率在SLE組與對照組中分別為87.96%，12.04%和83.92%，16.08%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)；PSMC6(rs2295827)CC，CT，TT基因型頻率在SLE組與對照組中分別為78.70%，19.45%，1.85%和76.22%，20.98%，2.8%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)，C，T等位基因頻率在SLE組與對照組中分別為88.43%，11.57%和86.71%，13.29%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)

2.3 PSMA6(rs2277460)，PSMA3(rs2348071)，PSMC6(rs2295826，rs2295827)位點基因測序圖 為進一步驗證二代測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，隨機選擇SLE組4個位點的7各樣本進行一代測序(圖2～5)。

表2 PSMA6/PSMC6/PSMA3基因多態(tài)性在SLE患者和對照組的分布

圖2 rs2277460位點，樣品32(含G/A等位基因)的基因擴增產(chǎn)物測序圖圖3 rs2348071位點，樣品46(含A/G等位基因)的基因擴增產(chǎn)物測序圖

圖4 rs2295826位點，樣品48(含A/G等位基因)的基因擴增產(chǎn)物測序圖圖5 rs2295827位點，樣品51(含C/T等位基因)的基因擴增產(chǎn)物測序

3 討論

SLE的發(fā)病機制目前尚未完全明確，隨著GWAS技術(shù)的發(fā)展，通過多個獨立大數(shù)據(jù)的全基因掃描的病例對照研究，為研究SLE的發(fā)病機制提供了重要線索[7]。其中I型干擾素(IFN)活化異常是一個很重要的方面。在toll樣受體介導(dǎo)下，激活NF-kB通路，進而影響前炎癥因子的轉(zhuǎn)錄[8]。Lena等[9]在SLE血清引發(fā)的皮膚炎癥反應(yīng)組織中檢測到升高的炎癥因子TNFR1、NF-kB、MCP-1等。而在炎癥反應(yīng)的過程中，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是NF-kB通路主要的調(diào)節(jié)因子[10]。

UPS在免疫反應(yīng)及自身免疫性疾病發(fā)病機制中的作用被人們作關(guān)注。UPS由泛素(Ub)、泛素活化酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2s)泛素-蛋白連接酶(E3s)、26S蛋白酶體和泛素解離酶(DUBs)等組成，是主要的非溶酶體依賴的蛋白降解途徑，其對蛋白的降解受到基因與免疫信號的共同調(diào)控[11]。泛素化是NF-kB轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的重要方式，有研究發(fā)現(xiàn)編碼泛素連接酶UbcH7的基因UBC2L3在歐洲，亞洲及非洲裔的SLE患者與正常對照組中均存在基因多態(tài)性[3],并且高表達(dá)的T基因型與抗dsDNA抗體陽性可能存在相關(guān)性，進一步的研究表明在SLE患者群體中UbcH7在mRNA和蛋白質(zhì)水平均有顯著的高表達(dá)[12]，在SLE患者體內(nèi)，過度表達(dá)的UbcH7與其底物P105(NF-kB的前體蛋白)結(jié)合，增強了P105與蛋白酶體的結(jié)合與降解，使得其亞基P50二聚體增多并進入細(xì)胞核參與免疫調(diào)控。此外，有研究表明SLE的相關(guān)基因TNFAIP3編碼的A20蛋白，為泛素酶的成分之一[13]，與SLE發(fā)病及其系統(tǒng)損害密切相關(guān)。目前關(guān)于蛋白酶體在SLE發(fā)病機制的作用研究較少，已知在SLE患者體內(nèi)同樣可以檢測到體內(nèi)可以檢測到針對泛素-蛋白酶體成分的抗體表達(dá)增強:PA28α抗體[14](PA28α為一種蛋白酶體激活蛋白)，抗Ki抗體[15](Ki抗原是蛋白酶體11S調(diào)控因子的亞單位)，且這種表達(dá)與IFN通路的異?；罨嘁恢?。Sjowall等[16]應(yīng)用26s蛋白酶體抑制劑治療兩例活動期SLE患者，經(jīng)治療后患者的病情得到明顯的緩解，其機制可能與NF-kB的抑制與基質(zhì)細(xì)胞的相互作用使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的錯誤折疊蛋白累積凋亡有關(guān)。

編碼蛋白酶體的基因主要位于14號染色體長臂，包括20s亞基的兩個a鏈(PSMA3和PSMA6)和兩個b鏈(PSMB5和PSMB11)，ATP酶(PSMC1和PSMC6)，11s非ATP酶催化劑(PSME1和PSME2)和PSMA3P假基因。有研究報道上述基因多態(tài)性與一些自身免疫性疾病及代謝性疾病相關(guān)，例如多發(fā)性硬化(MS)，支氣管哮喘(BA)，幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(JIA)等[15]。Tatjana等[17]通過研究174例JIA患者與191名健康對照者，選擇蛋白酶體相關(guān)的六個SNP位點(rs2277460，rs1048990，rs2348071，rs11543947，rs2295826，rs2295827)進行基因型及等位基因分析，發(fā)現(xiàn)位點rs2277460，rs234871，rs2295826，rs2295827可能與JIA發(fā)病和臨床表現(xiàn)相關(guān)。

本次研究，為探究蛋白酶體相關(guān)基因SNPs與中國人群系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的相關(guān)性，我們通過觀察108例SLE患者和143名健康對照，選擇4個SNP位點(rs2277460，rs234871，rs2295826，rs2295827)，采用高通量基因分型對DNA樣本SNP位點進行分析，結(jié)果示PSMA6(rs2277460)GG，GA，AA基因型頻率和G，A等位基因在SLE實驗組和對照組中無統(tǒng)計學(xué)差異(Pgt;0.05),PSMA3(rs2348071)AA，AG，GG基因型頻率和A，G等位基因在SLE實驗組和對照組中無統(tǒng)計學(xué)差異(Pgt;0.05),PSMC6(rs2295826)AA，AG，GG基因型頻率和A，G等位基因在SLE實驗組和對照組中無統(tǒng)計學(xué)差異(Pgt;0.05),PSMC6(rs2295827)CC，CT，TT基因型頻率和C，T等位基因在SLE實驗組和對照組中無統(tǒng)計學(xué)差異(Pgt;0.05)。上述四個SNP位點可能與SLE的發(fā)病機制無關(guān)。

本實驗首次探究蛋白酶體相關(guān)基因SNPs與中國漢族人群SLE之間的關(guān)聯(lián)，PSMA6/PSMC6/PSMA3 SNPs可能不是SLE的易感基因。一方面，本實驗在編碼蛋白酶體結(jié)構(gòu)及相關(guān)酶蛋白的基因位點中僅選取了4個位點，不能排除其他SNPs在實驗組和對照組中表達(dá)有差異的可能性，另一方面，患者循環(huán)中蛋白酶體濃度升高可能與轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控有關(guān)，已知編碼泛素連接酶(UbcH7)的基因UBC2L3為SLE的易感基因，UbcH7激活NF-kB通路可能參與了這一過程。同時本研究選取的樣本量小，人種單一，選取的位點不能代表蛋白酶體的全部結(jié)構(gòu)，因此，UPS在SLE中的作用還需要通過大樣本，多基因點，多地區(qū)的研究，同時蛋白酶體轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在SLE發(fā)病中的作用也有待進一步的研究。

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(收稿：2017-06-18 修回：2017-07-31)

AssociationbetweenPSMA6/PSMA3/PSMC6genepolymorphismandsystemiclupuserythematosus

LIULanting1,WANGYu2,SONGJiquan1,PEISa1,OUYunchao1.

1.DepartmentofDermatologyZhongnanHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430071,China; 2.DepartmentofDermatology,RenminHospitalHubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,China

SONGJiquan,E-mail:songjiq@126.com

Objective: To determine the association between the polymorphisms of proteasome (PSM) related genes and systemic lupus erythematosus (SLE).MethodsThe aim gene fragment extracted from the peripheral blood DNA of 101 SLE patients and 143 healthy controls was amplified by PCR. The single nucleotide polymorphisms of PSMA6 (rs2277460)，PSMA3 (rs2348071)，PSMC6 (rs2295826，rs2295827) alleles and the genotypes of proteasome 20 s subunit and related ATPase were detected by next generation sequencing technology.ResultsThe genotype frequencies of rs2277460 GG, GA, AA in the SLE patients and healthy controls were 30.56%, 53.7%, 15.74% and 33.57%, 50.35%, 16.08%, retrospectively. The genotype frequencies of rs2295826 AA, AG, GG were 75.93%, 24.07%, 0 and 69.23%, 29.37%, 1.4%. The genotype frequencies of rs2295827 CC, CT, TT were 78.7%, 19.45%, 1.85% and 76.22, 20.98%, 2.8%, with no significant differences between the two groups (Pgt;0.05).ConclusionThere may be no association between polymorphism of PSMA6/PSMC6/PSMA3 gene with SLE.

systemic lupus erythematosus (SLE); PSM; ATP ase; single nucleotide polymorphism

湖北省自然科學(xué)基金資助項目(編號:2015CKC902)

1武漢大學(xué)中南醫(yī)院皮膚科,武漢，430071 2湖北醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院，十堰，442000

宋繼權(quán),E-mail: songjiq@126.com