胡新宇，汪詠梅，張亮亮，徐曼

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所，江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210042)

化香果單寧/聚N,N-二甲基丙烯酰胺水凝膠的制備及細(xì)胞黏附性能

胡新宇，汪詠梅，張亮亮，徐曼

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所，江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210042)

聚N, N-二甲基丙烯酰胺(PDMAA)水凝膠的孔結(jié)構(gòu)過(guò)于致密且不可降解，限制了其在組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用。為解決這些問(wèn)題，筆者利用半互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)(semi-IPN)技術(shù)，在PDMAA網(wǎng)絡(luò)中加入化香果單寧(TA)，設(shè)計(jì)并合成了一系列新型的TA/PDMAA semi-IPN水凝膠，將“細(xì)胞黏附及可降解特性”引入水凝膠體系中。結(jié)果表明：加入1 mL TA溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%)明顯改善了凝膠的孔結(jié)構(gòu)，TA/PDMAA semi-IPN水凝膠表現(xiàn)出連續(xù)均勻的多孔結(jié)構(gòu)，孔徑分布為37.7～87.1 μm。在磷酸鹽緩沖液(PBS)中，TA/PDMAA semi-IPN水凝膠可以降解，交聯(lián)劑的含量可以調(diào)控降解速率。胞外毒性分析結(jié)果證明了TA/PDMAA semi-IPN水凝膠對(duì)COS-7細(xì)胞及CHO細(xì)胞完全無(wú)毒，細(xì)胞成活率均高于90%。引入TA顯著改善了細(xì)胞黏附情況，COS-7細(xì)胞及CHO細(xì)胞可在TA/PDMAA semi-IPN水凝膠表面較好生長(zhǎng)。TA/PDMAA semi-IPN水凝膠表現(xiàn)出較好的生物相容性，具有在組織工程領(lǐng)域應(yīng)用的潛力。

半互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)水凝膠；細(xì)胞黏附特性；多孔結(jié)構(gòu)；可降解；細(xì)胞成活率

水凝膠為具有大量親水性基團(tuán)的三維網(wǎng)絡(luò)，在水中能夠溶脹吸收自身幾十倍甚至上千倍的水分，且具有較好的保持水分能力，即使在外界壓力下水分也不會(huì)流失，可較好地模擬人體內(nèi)環(huán)境，因此，水凝膠在組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用具有較大優(yōu)勢(shì)[1]。作為組織工程材料，水凝膠必須具備良好的生物相容性、力學(xué)性能、細(xì)胞或蛋白吸附性等。合成類高分子水凝膠(如聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯等)具備較理想的機(jī)械性能、可控制的化學(xué)組成、制備過(guò)程以及分子量[2-3]，但其生物相容性較差，孔結(jié)構(gòu)過(guò)于致密，對(duì)于外部環(huán)境的響應(yīng)緩慢且缺乏生物活性[4-5]，導(dǎo)致體系不具備細(xì)胞識(shí)別信號(hào)，不適于活性物質(zhì)和細(xì)胞的負(fù)載。

植物單寧廣泛地存在于植物的葉、果實(shí)、根以及樹皮等部位中，是重要的天然多酚類活性物質(zhì)，也是天然產(chǎn)物中被研究較早、較多的一類化合物。植物單寧具有較強(qiáng)的抗氧化、抗病毒等多種生物活性，且能與蛋白質(zhì)、多糖、生物堿相結(jié)合，與金屬離子絡(luò)合，被廣泛用作抑菌劑、抗腫瘤藥物、抗氧化劑、防腐劑等[6-7]。利用半互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)(semi-IPN)技術(shù)，將植物單寧與高分子聚合物相融合，制備的凝膠材料可以有效地解決合成類高分子水凝膠存在的問(wèn)題。這類半互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)水凝膠具有連續(xù)、均勻的多孔結(jié)構(gòu)，且對(duì)水分子和其他小分子物質(zhì)具有較好的滲透性，有效地降低了對(duì)所黏附細(xì)胞的刺激[8-9]。另外，植物單寧親水性強(qiáng)，進(jìn)一步增大了凝膠網(wǎng)絡(luò)中的含水量，系統(tǒng)因此獲得一定的流體性質(zhì)，有助于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的擴(kuò)散和細(xì)胞代謝產(chǎn)物的排泄，更好地模擬生物體內(nèi)的組織器官，為細(xì)胞的滲入、生長(zhǎng)擴(kuò)散提供場(chǎng)所，為組織生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與組織代謝物提供通道[10-11]。

筆者采用半互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)技術(shù)，將化香果單寧(TA)引入到聚N, N-二甲基丙烯酰胺(PDMAA)體系中，設(shè)計(jì)、合成了一種全新的TA/PDMAA semi-IPN水凝膠，分析了加入植物單寧對(duì)凝膠的孔結(jié)構(gòu)、熱穩(wěn)定性、溶脹性能、機(jī)械性能、降解性能及胞外毒性的影響，研究了引入植物單寧對(duì)凝膠細(xì)胞黏附性能的影響。通過(guò)這些表征探索TA/PDMAA semi-IPN水凝膠，以期在組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用潛力，進(jìn)一步擴(kuò)展植物單寧的使用范圍。

1 材料與方法

1.1 原料和儀器

化香果單寧(TA，經(jīng)純化處理，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為78%，中國(guó)林科院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所)；N, N-二甲基丙烯酰胺(DMAA)(分析純)、N, N’-亞甲基雙丙烯酰胺(BAAm)(分析純)、過(guò)硫酸銨(APS)(分析純)、N, N, N′, N′-四甲基乙二胺(TEMED)(分析純)(上海阿拉丁試劑公司)；Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、MTT試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；COS-7細(xì)胞和CHO細(xì)胞(ATCC細(xì)胞庫(kù))。

MS304S電子天平(梅特勒-托利多集團(tuán))，恒溫磁力攪拌器、HH-6恒溫水浴鍋、鼓風(fēng)干燥箱、HY-4調(diào)速振蕩器(常州國(guó)華儀器有限公司)，BenchTop Pro臺(tái)式凍干機(jī)(美國(guó)VirTis公司)，Nicolet IS-10紅外光譜儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，Philips PW 1720 X射線衍射儀(荷蘭Philips公司)，TA Model Q600熱重分析儀(美國(guó)TA公司)，JEOLJSM-6380LV掃描電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社)，MCR101流變分析儀(奧地利Anton Paar公司)，PowerWave XS酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)，CKX31熒光顯微鏡(日本奧林巴斯株式會(huì)社)。

1.2 TA/PDMAA semi-IPN水凝膠的制備

TA/PDMAA semi-IPN水凝膠主要采用自由基交聯(lián)共聚法在水相、30℃條件下進(jìn)行制備，制備方法如圖1。具體方法為：在50 mL四口燒瓶中將1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的TA溶液、2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35% 的DMAA單體溶液及不同量的BAAm進(jìn)行混合(表1)。然后將機(jī)械攪拌槳、溫度計(jì)以及氬氣(argon gas)管插入至瓶口位置，再將此四口瓶移入0℃的冰浴中，加入1 mL體積分?jǐn)?shù)為2.5%的TEMED溶液，體系在氬氣環(huán)境中攪拌30 min，每隔10 min添加一次冰，確保體系的溫度維持在0℃左右。隨之利用注射器將1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的APS溶液逐滴緩慢加入反應(yīng)瓶中，快速攪拌3 min。將7 mL此混合液移入至玻璃模具中，密封后置于30℃恒溫水浴鍋內(nèi)。反應(yīng)24 h后，將凝膠樣品從模具中移出，置于去離子水中浸泡7 d，期間每天換4次水，確保未反應(yīng)單體、引發(fā)劑等小分子物質(zhì)充分除去，然后將樣品凍干并置于保干器中儲(chǔ)存。純PDMAA水凝膠制備方法相同，反應(yīng)物用量見表1。

圖1 TA/PDMAA semi-IPN水凝膠的制備方法Fig. 1 Scheme showing preparation of TA/PDMAA semi-IPN hydrogel

表1 制備原料用量及樣品編號(hào)Table 1 Composition of initial reaction mixtures usedfor preparation of hydrogels

注：TA溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%；DMAA溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%；APS溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%；TEMED溶液的體積分?jǐn)?shù)為2.5%。

1.3 TA/PDMAA semi-IPN水凝膠的結(jié)構(gòu)表征和性能測(cè)試

1.3.1 紅外光譜(FT-IR)表征

TA粉末和凍干的凝膠樣品在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)利用Nicolet IS-10紅外光譜儀進(jìn)行全反射紅外光譜分析。

1.3.2 X射線衍射(XRD)表征

將TA和凍干的凝膠樣品磨成粉末狀，使用Philips PW 1720 X射線衍射儀進(jìn)行X射線衍射分析。測(cè)試時(shí)使用Cu Kα射線，波長(zhǎng)0.154 nm，電壓為30 kV，電流為20 mA，掃描范圍為2θ=10°～60°，掃描速率為10°/min。

1.3.3 熱重分析(TGA)表征

將TA和凍干的凝膠樣品磨成粉末狀，使用TA Model Q600熱分析儀測(cè)定其熱性能的變化。測(cè)定參數(shù)：氮?dú)夥諊?，升溫速?0℃/min，溫度范圍35～600℃。

1.3.4 溶脹行為測(cè)試

將0.5 g干凝膠樣品分別置于去離子水或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl溶液中，在25℃條件下測(cè)定吸水溶脹情況[10]。在指定的時(shí)間點(diǎn)將凝膠撈出，用濕濾紙將凝膠表面的水分擦除，使用電子天平測(cè)定吸水率(SR)。所有測(cè)試均重復(fù)3次。

SR= (Wt-Wd)/Wd

式中：Wt為在特定時(shí)間點(diǎn)t時(shí)凝膠的質(zhì)量，g；Wd為干凝膠的質(zhì)量，g。

1.3.5 形貌表征

凝膠內(nèi)部孔結(jié)構(gòu)使用掃描電子顯微鏡(SEM)進(jìn)行觀察。測(cè)試前將凍干的凝膠樣品切為小塊，然后鍍金以提高導(dǎo)電率。利用Nano Measurer 1.2.5軟件(復(fù)旦大學(xué)研制)計(jì)算孔徑，至少選擇20個(gè)孔進(jìn)行平均孔徑及標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算。

1.3.6 動(dòng)態(tài)力學(xué)性能測(cè)試

用于測(cè)試的凝膠樣品厚度為2 mm，采用50 mm平行板夾具，試驗(yàn)溫度固定在25℃。為保證樣品動(dòng)態(tài)測(cè)試在線性范圍內(nèi)，首先對(duì)凝膠樣品使用MCR101流變分析儀進(jìn)行動(dòng)態(tài)應(yīng)變掃描，固定頻率為1 Hz，掃描范圍為0.05%～300%；樣品的動(dòng)態(tài)頻率掃描，在線性范圍內(nèi)固定應(yīng)變?yōu)?.5%，掃描范圍為0.1～10.0 Hz。

1.3.7 體外降解實(shí)驗(yàn)

將溶脹平衡的凝膠樣品置于pH 7.4的PBS溶液中(含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%的疊氮化鈉)，在37℃條件下進(jìn)行測(cè)試[5]。在指定的時(shí)間內(nèi)將樣品取出，用濕濾紙擦掉表面的溶液，然后稱質(zhì)量。所有測(cè)試均重復(fù)3次。剩余質(zhì)量百分率(weight remaining)采用如下公式計(jì)算：

剩余質(zhì)量百分率=Wt/W0× 100%

式中：Wt為在特定時(shí)間點(diǎn)t時(shí)凝膠的質(zhì)量，g；W0為凝膠的初始質(zhì)量，g。

1.3.8 胞外毒性評(píng)估

1)COS-7細(xì)胞和CHO細(xì)胞培養(yǎng)。從冷凍溫度為-70℃的冰箱中取出凍存的COS-7細(xì)胞和CHO細(xì)胞，在37℃水浴中迅速解凍，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)復(fù)蘇細(xì)胞。在37℃、5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞并傳代培養(yǎng)。

2)毒性評(píng)估。胞外毒性采用間接法，根據(jù)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO 10993—5進(jìn)行測(cè)試[8]。干凝膠樣品首先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液滅菌，然后使用滅菌PBS溶液淋洗數(shù)次，再將樣品置于包含血清的DMEM培養(yǎng)基中浸泡7 d，所有操作均在超凈臺(tái)中完成。

細(xì)胞毒性通過(guò)MTT法進(jìn)行測(cè)定[9]。COS-7細(xì)胞和CHO細(xì)胞接種到96孔板，接種密度為每立方厘米5×103細(xì)胞，37℃條件下培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)基從96孔板移出，加入凝膠提取液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后每孔加入50 μL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。隨后將孔內(nèi)液體移出，每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩15 min，以溶解細(xì)胞增殖所產(chǎn)生的甲臜結(jié)晶。再將培養(yǎng)板置于酶標(biāo)儀中，在570 nm處讀取吸光度。不加凝膠提取液的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

3)細(xì)胞接種。首先將凝膠樣品(直徑為10 mm，厚度為2 mm)置于體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液中滅菌30 min，然后用滅菌的PBS溶液及DMEM浸泡過(guò)夜，以除去凝膠表面及內(nèi)部的乙醇溶液。以上操作均在超凈臺(tái)中完成。再將滅菌的凝膠樣品平鋪到6孔板中，以每立方厘米1×104細(xì)胞的密度將COS-7細(xì)胞和CHO細(xì)胞接種到凝膠表面，在37℃、5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的CO2條件下分別培養(yǎng)1和4 d，培養(yǎng)基隔天換一次。

4)細(xì)胞觀察。經(jīng)過(guò)1和4 d培養(yǎng)后，使用37℃的PBS溶液將未黏附的細(xì)胞從凝膠表面淋洗下來(lái)，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的戊二醛將細(xì)胞固定。30 min后，用37℃的PBS溶液淋洗凝膠樣品3次，然后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。

2 結(jié)果與分析

2.1 FT-IR分析

圖2 TA、TPDM2和PDMAA水凝膠的紅外譜圖Fig. 2 The FT-IR spectra of TA, TPDM2 andPDMAA hydrogel

2.2 水凝膠形成機(jī)理分析

TA/PDMAA semi-IPN水凝膠的制備過(guò)程是DMAA單體在TA存在的情況下進(jìn)行自由基共聚反應(yīng)，聚合反應(yīng)的同時(shí)，TA與DMAA形成的共聚物網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行互穿。體系采用的交聯(lián)劑為常用的BAAm，引發(fā)劑APS與加速劑TEMED配對(duì)使用。反應(yīng)初始階段首先是TEMED加速APS產(chǎn)生硫酸根自由基，進(jìn)而引發(fā)單體與交聯(lián)劑進(jìn)行共聚反應(yīng)，最終形成PDMAA三維網(wǎng)絡(luò)，TA分子鏈插入此網(wǎng)絡(luò)，并與網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行物理纏繞，利用TA羥基之間以及羥基與PDMAA氨基、羰基之間的氫鍵作用(2.1 FT-IR分析部分已證實(shí))，維持整個(gè)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[18]。

2.3 XRD分析

TPDM2與TA、PDMAA凝膠進(jìn)行對(duì)比的XRD譜圖如圖3所示。由圖3可見，TA在2θ=24.5°附近有衍射峰，表示TA中的結(jié)晶區(qū)域。與TA相比，TPDM2在2θ=24.8°附近出現(xiàn)了一個(gè)更寬更弱的彌散峰，說(shuō)明PDMAA網(wǎng)絡(luò)加入后，TA的結(jié)晶程度進(jìn)一步減少，分子間氫鍵遭到破壞[19]。

圖3 TA、TPDM2和PDMAA水凝膠的XRD譜圖Fig. 3 The XRD spectra of TA, TPDM2 andPDMAA hydrogel

2.4 熱穩(wěn)定性分析

TA、PDMAA和TPDM2水凝膠的熱重曲線如圖4所示。由圖4可見，TA在100℃之前的熱質(zhì)量損失主要為樣品中的水汽，質(zhì)量損失率為3.3%；242～376℃質(zhì)量損失率約為35.8%，主要為TA中酯鍵和側(cè)鏈的分解；376～597℃質(zhì)量損失率為75.5%，主要為TA芳環(huán)骨架的分解。PDMAA的熱質(zhì)量損失主要分為3個(gè)階段：第1階段在100℃之前，主要為材料中水汽的蒸發(fā)，質(zhì)量損失率為12.5%；第2階段為245～341℃，質(zhì)量損失率為37.1%，主要是由于氨基以氨氣的形式分解，以環(huán)化的方式形成了酰亞胺；第3階段為341～600℃，質(zhì)量損失率為86.9%，主要為環(huán)化產(chǎn)物的分解。TPDM2的熱質(zhì)量損失也分為3個(gè)階段：第1階段為34.9～100℃，質(zhì)量損失率為11.2%，主要為樣品中水汽的排出；第2階段為242～333℃，質(zhì)量損失率為30.0%；第3階段為360～600℃，質(zhì)量損失率為72.4%。后兩個(gè)階段的熱質(zhì)量損失包含一系列復(fù)雜的分解過(guò)程，包括TA骨架的分解、PDMAA分子鏈的裂解以及整個(gè)凝膠網(wǎng)絡(luò)分解為小分子。需要注意的是，TPDM2各階段的質(zhì)量損失率均低于PDMAA各階段的質(zhì)量損失率，說(shuō)明TA引入后，通過(guò)與PDMAA網(wǎng)絡(luò)纏繞形成半互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)后，凝膠體系的熱穩(wěn)定性得以提高。

圖4 TA、TPDM2和PDMAA水凝膠的熱重曲線Fig. 4 The TGA curves of TA, TPDM2 andPDMAA hydrogel

2.5 溶脹行為分析

凝膠的溶脹動(dòng)力學(xué)曲線如圖5所示。從圖5可以看出，當(dāng)BAAm使用量從72 mg降至24 mg時(shí)(表1)，吸水率隨之增加。TPDM1表現(xiàn)出最大的吸水率27.6 g/g，TPDM2為22.1 g/g，TPDM3為17.4 g/g。總的來(lái)說(shuō)，吸水率受到凝膠網(wǎng)絡(luò)交聯(lián)度的影響[20]。對(duì)于TA/PDMAA semi-IPN水凝膠而言，當(dāng)BAAm使用量從72 mg降至24 mg時(shí)，凝膠網(wǎng)絡(luò)的交聯(lián)度也隨之降低，TA和PDMAA網(wǎng)絡(luò)的纏繞變得松弛，聚合物分子鏈之間的摩擦減弱，極大地?cái)U(kuò)大了水分子的空間，吸水能力增強(qiáng)。因此，TPDM1表現(xiàn)出了最高的吸水率[21]。而當(dāng)BAAm使用量進(jìn)一步降低時(shí)，即低于24 mg時(shí)，這一趨勢(shì)將得以延續(xù)，吸水能力進(jìn)一步增強(qiáng)。

圖5 TA/PDMAA semi-IPN水凝膠的溶脹動(dòng)力學(xué)曲線Fig. 5 Swelling kinetic curves of TA/PDMAAsemi-IPN hydrogels

凝膠在去離子水中和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl溶液中的溶脹平衡吸水率如圖6所示。從圖6可以看出，凝膠在NaCl溶液中的溶脹平衡吸水率低于在去離子水中的溶脹平衡吸水率。這是因?yàn)槿芤褐宣}濃度的增加導(dǎo)致凝膠網(wǎng)絡(luò)與外部溶液的滲透壓差降低，阻止了水分子進(jìn)入凝膠網(wǎng)絡(luò)中，導(dǎo)致吸水率降低[22-23]。

圖6 TA/PDMAA semi-IPN水凝膠在去離子水及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl溶液中的吸水率Fig. 6 Swelling ratio in deionized water and 0.9 wt%NaCl solution of TA/PDMAA semi-IPN hydrogel

2.6 SEM形貌觀察

凍干凝膠內(nèi)部形貌的SEM圖片如圖7所示。由圖7可見，純PDMAA凝膠表現(xiàn)出致密光滑幾乎無(wú)孔的內(nèi)部形貌，而TA/PDMAA semi-IPN水凝膠則表現(xiàn)了高度連續(xù)、分布均勻的多孔結(jié)構(gòu)，說(shuō)明TA的引入使得凝膠的孔結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大變化。從TPDM1到TPDM3，凝膠的孔徑逐漸變小。其中，TPDM1具有最大孔徑，為(87.1 ± 5.5) μm；TPDM2為(62.8 ± 5.2) μm；TPDM3為(37.7 ± 6.2) μm。這一趨勢(shì)與上述討論的凝膠溶脹吸水率有關(guān)。隨BAAm用量的增加，體系的交聯(lián)度增加，導(dǎo)致凝膠含水量降低并限制了水分子的自由移動(dòng)。在冷凍干燥的過(guò)程中，這些水分被凍成了更小的冰晶，這些冰晶最終形成了小孔[24]。SEM結(jié)果表明，TA/PDMAA semi-IPN水凝膠的孔徑大小可根據(jù)BAAm用量進(jìn)行調(diào)控。

a)PDMAA水凝膠;b)TPDM1；c)TPDM2；d)TPDM3圖7 純PDMAA和TA/PDMAA semi-IPN水凝膠電鏡圖Fig. 7 The SEM images of PDMAA and TA/PDMAAsemi-IPN hydrogel

實(shí)心圖例：儲(chǔ)能模量；空心圖例：損耗模量圖8 純PDMAA及TA/PDMAA semi-IPN水凝膠的儲(chǔ)能模量和損耗模量的頻率掃描圖Fig. 8 Frequency dependence of dynamic storagemodulus and dynamic loss modulus of PDMAAand TA/PDMAA semi-IPN hydrogel

2.7 動(dòng)態(tài)力學(xué)性能分析

凝膠的儲(chǔ)能模量(G′)、損耗模量(G″)與頻率的關(guān)系如圖8所示。由圖8可見，所有樣品均表現(xiàn)出典型的凝膠流變行為：在掃描的頻率范圍內(nèi)，凝膠的儲(chǔ)能模量遠(yuǎn)高于其損耗模量，這說(shuō)明凝膠的彈性行為優(yōu)于其黏性行為，在凝膠網(wǎng)絡(luò)中占主導(dǎo)地位，所制備的凝膠表現(xiàn)出較為“堅(jiān)硬”的特性[25]。從TPDM1到TPDM3，隨BAAm使用量的增加，凝膠的儲(chǔ)能模量和損耗模量均呈現(xiàn)增大趨勢(shì)?？傮w來(lái)說(shuō)，凝膠網(wǎng)絡(luò)的交聯(lián)度和聚合物鏈的靈活度在較大程度上影響著凝膠的流變行為。當(dāng)BAAm使用量增加時(shí)，凝膠網(wǎng)絡(luò)變得更加稠密，聚合物之間的纏繞與接觸變得更為緊密，這極大地降低了聚合物鏈的靈活度，導(dǎo)致凝膠模量增加[26]。由此也可看出，BAAm使用量的增加對(duì)提高凝膠的儲(chǔ)能模量起到重要作用。

2.8 體外降解及機(jī)理分析

不同凝膠的體外降解過(guò)程如圖9所示。由圖9可見，經(jīng)70 d后，純PDMAA的凝膠剩余量近90%，說(shuō)明其在PBS溶液中較穩(wěn)定，幾乎未發(fā)生降解。TA的加入賦予了凝膠可降解的特性：TPDM1為降解速率最快的樣品，剩余質(zhì)量百分率僅為12.7%。TPDM2和TPDM3剩余質(zhì)量百分率分別為21.1%和40.2%。TA/PDMAA semi-IPN水凝膠的質(zhì)量損失主要是因?yàn)門A脫離了物理纏繞的凝膠網(wǎng)絡(luò)，溶解到溶液中。相似的降解情況也在Mandal等[27]制備的絲蛋白/聚丙烯酰胺semi-IPN水凝膠體系中觀察到。這一結(jié)果也說(shuō)明交聯(lián)度在凝膠的降解過(guò)程中起到較重要作用。TPDM1凝膠的交聯(lián)度最低，因此經(jīng)表面侵蝕后，降解速率最快；而TPDM3凝膠網(wǎng)絡(luò)的交聯(lián)度最高，TA與PDMAA網(wǎng)絡(luò)的物理纏繞最為緊密，因此降解速率最慢。

圖9 純PDMAA及TA/PDMAA semi-IPN水凝膠在PBS溶液中的降解情況Fig. 9 Degradation of PDMAA and TA/PDMAAsemi-IPN hydrogel in PBS solution

2.9 體外細(xì)胞試驗(yàn)

2.9.1 胞外毒性評(píng)估

試驗(yàn)采用7 d的凝膠提取液培養(yǎng)CHO細(xì)胞和COS-7細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，細(xì)胞成活率如圖10所示。由圖10可見，經(jīng)TA/PDMAA semi-IPN水凝膠提取液培養(yǎng)的CHO細(xì)胞和COS-7細(xì)胞，其成活率均高于90%，與陰性對(duì)照接近，說(shuō)明材料無(wú)毒害，具備良好且持久的生物相容性。

圖10 純PDMAA和TA/PDMAA semi-IPN水凝膠的胞外毒性測(cè)試結(jié)果Fig. 10 Cytotoxicity test of PDMAA and TA/PDMAAsemi-IPN hydrogel

2.9.2 細(xì)胞黏附試驗(yàn)

將CHO細(xì)胞和COS-7細(xì)胞接種在TPDM2凝膠表面進(jìn)行培養(yǎng)，分別于1和4 d后使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，細(xì)胞形態(tài)如圖11所示。由圖11可見，在純PDMAA凝膠表面接種的細(xì)胞，經(jīng)1 d培養(yǎng)后，細(xì)胞呈球形并出現(xiàn)團(tuán)簇現(xiàn)象，4 d后，雖然細(xì)胞數(shù)量增多，但細(xì)胞形態(tài)仍呈現(xiàn)團(tuán)簇狀，說(shuō)明CHO細(xì)胞和COS-7細(xì)胞均不能在純PDMAA凝膠中進(jìn)行黏附和生長(zhǎng)，這可能是由純PDMAA致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及較低的吸水率所導(dǎo)致。Jaiswal等[28]也證實(shí)了這一結(jié)果。相比較而言，在TPDM2表面培養(yǎng)的細(xì)胞4 d后呈現(xiàn)出極好的形態(tài)：大部分細(xì)胞舒展地平鋪在凝膠表面，細(xì)胞體積增大，胞體伸出突起且出現(xiàn)分枝和偽足。這主要?dú)w因于兩方面：1)引入TA使得TA/PDMAA semi-IPN水凝膠具有連續(xù)、分布均勻的多孔結(jié)構(gòu)，有效地增大了凝膠內(nèi)部的比表面積，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)所需養(yǎng)分的運(yùn)送以及代謝廢物排出，為細(xì)胞提供了良好的生長(zhǎng)環(huán)境[10]；2)加入TA使材料獲得適中的親水性，這種環(huán)境可更好地模擬體內(nèi)，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供了充足的液體環(huán)境且有助于細(xì)胞黏附蛋白的綁定與運(yùn)送[11]。

圖11 COS-7細(xì)胞和CHO細(xì)胞在純PDMAA水凝膠和TA/PDMAA semi-IPN水凝膠表面的生長(zhǎng)情況Fig. 11 Phase-contrast micrographs (100×) of COS-7 cell and CHO cell cultured on surface of PDMAAhydrogel and TA/PDMAA semi-IPN hydrogel

3 結(jié) 論

采用半互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)技術(shù)，使化香果單寧與PDMAA網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行互穿，設(shè)計(jì)并合成了一種全新的TA/PDMAA semi-IPN水凝膠，TA與PDMAA網(wǎng)絡(luò)之間依靠氫鍵作用進(jìn)行物理纏繞，以維持整個(gè)三維網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性。

1)加入TA使得凝膠的內(nèi)部形態(tài)發(fā)生較大改變，相比于純PDMAA凝膠，TA/PDMAA semi-IPN水凝膠展示了連續(xù)、分布均勻的多孔形態(tài)，孔徑分布在37.7～87.1 μm范圍內(nèi)。Semi-IPN水凝膠的溶脹行為和保水能力與體系的交聯(lián)度有關(guān)。隨著BAAm使用量從24 mg提高到72 mg，凝膠的吸水率從27.6 g/g降到17.4 g/g。流變性能測(cè)試結(jié)果表明，凝膠的儲(chǔ)能模量和損耗模量隨著BAAm用量的增加而增大。

2)降解試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了TA/PDMAA semi-IPN水凝膠可在體外的PBS溶液中降解，當(dāng)BAAm使用量從24 mg升至72 mg時(shí)，降解后的剩余質(zhì)量百分率從12.7%提高至40.2%。胞外毒性測(cè)試結(jié)果證明了TA/PDMAA semi-IPN水凝膠對(duì)COS-7細(xì)胞和CHO細(xì)胞完全無(wú)毒，細(xì)胞成活率高于90%。

3)通過(guò)在凝膠表面培養(yǎng)COS-7細(xì)胞和CHO細(xì)胞，證明引入TA膠使TA/PDMAA semi-IPN水凝膠具備了細(xì)胞黏附性能，COS-7細(xì)胞和CHO細(xì)胞能夠較好地在凝膠表面黏附生長(zhǎng)，這一結(jié)果與TA/PDMAA semi-IPN水凝膠分布連續(xù)、孔徑可控的多孔結(jié)構(gòu)及適度的親水性密不可分。

這些表征結(jié)果可為TA/PDMAA semi-IPN水凝膠在組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)，也為植物單寧更加廣泛、有效的利用探索一條新途徑。

[1]楊琳, 管曉燕, 陳黎明, 等. 智能水凝膠在骨類硬組織再生和修復(fù)中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)組織工程研究, 2016,20(3):430-434.

YANG L, GUAN X Y, CHEN L M, et al. Application of intelligent hydrogels in bone regeneration and repair[J]. Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research, 2016, 20(3):430-434.

[2]劉水蓮, 宿烽, 李速明. 合成水凝膠材料在組織工程中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)材料進(jìn)展, 2016, 35(3):227-232.

LIU S L, SU F, LI S M. Applications of synthetic hydrogels in tissue engineering[J]. Materials China, 2016, 35(3):227-232.

[3]孫靜, 衛(wèi)丹, 楊棵, 等. 微尺度水凝膠與組織工程[J]. 高分子通報(bào), 2016(5):103-109.

SUN J, WEI D, YANG K, et al. Microengineered hydrogels for tissue engineering[J]. Chinese Polymer Bulletin, 2016(5):103-109.

[4]張丁文, 劉燕飛, 亓鵬, 等. 智能水凝膠在組織工程中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)組織工程研究, 2014, 18(12):1944-1950.

ZHANG D W, LIU Y F, QI P, et al. Application of intelligent hydrogel in the tissue engineering[J]. Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research, 2014, 18(12):1944-1950.

[5]TAN H, MARRA K G. Injectable, biodegradable hydrogels for tissue engineering applications[J]. Materials, 2010, 3(3):1746-1767.

[6]傅長(zhǎng)明, 黃科林, 王則奮, 等. 植物單寧的性質(zhì)及應(yīng)用[J]. 企業(yè)科技與發(fā)展, 2010(22):57-60.

FU C M, HUANG K L, WANG Z F, et al. The properties and applications of vegetable tannin[J]. Enterprise Science and Technology amp; Development, 2010(22):57-60.

[7]SHIN M, RYU J H, PARK J P, et al. DNA/tannic acid hybrid gel exhibiting biodegradability, extensibility, tissue adhesiveness, and hemostatic ability[J]. Advanced Functional Materials, 2015, 25(8):1270-1278.

[8]HOO S P, LOH Q L, YUE Z, et al. Preparation of a soft and interconnected macroporous hydroxypropyl cellulose methacrylate scaffold for adipose tissue engineering[J].Journal of Materials Chemistry B, 2013, 1(24):3107-3117.

[9]RADHAKUMARY C, NANDKUMAR A M, NAIR P D. Hyaluronic acid-g-poly(HEMA) copolymer with potential implications for lung tissue engineering[J]. Carbohydrate Polymers, 2011, 85(2):439-445.

[10]HU X Y, FENG L D, XIE A M, et al. Synthesis and characterization of a novel hydrogel:salecan/polyacrylamide semi-IPN hydrogel with adesirable pore structure[J]. Journal of Materials Chemistry B, 2014, 2(23):3646-3658.

[11]LIU X, WU C, JIAO Y, et al. Chitosan-halloysite nanotubes nanocomposite scaffolds for tissue engineering[J]. Journal of Materials Chemistry B, 2013, 1(15):2078-2089.

[12]REN P F, YANG H C, LIANG H Q, et al. Highly stable, protein-resistant surfaces via the layer-by-layer assembly of poly(sulfobetaine methacrylate) and tannic acid[J]. Langmuir:the ACS Journal of Surfaces and Colloids, 2015, 31(21):5851-5858.

[13]MADY M M, MOHAMMED W A, EL-GUENDY N M, et al. Interaction of DNA and polyethylenimine:fourier-transform infrared (FTIR) and differential scanning calorimetry (DSC) studies[J]. International Journal of Physical Sciences, 2011, 6(32):7328-7334.

[14]HU X, FENG L, WEI W, et al. Synthesis and characterization of a novel semi-IPN hydrogel based on salecan and poly(N, N-dimethylacrylamide-co-2-hydroxyethyl methacrylate)[J]. Carbohydrate Polymers, 2014, 105:135-144.

[15]LUO J, LAI J P, ZHANG N, et al. Tannic acid induced self-assembly of three-dimensional grapheme with good adsorption and antibacterial properties[J]. ACS Sustainable Chemistry amp; Engineering, 2016, 4(3):1404-1413.

[16]SAHINER N, SAGBAS S, AKTAS N. Single step natural poly(tannic acid) particle preparation as multitalented biomaterial[J]. Materials Science amp; Engineering C, Materials for Biological Applications, 2015, 49:824-834.

[18]LYU S, LIU M, NI B, et al. A novel pH-and thermo-sensitive PVP/CMC semi-IPN hydrogel:swelling, phase behaviour, and drug release study[J]. Journal of Polymer Science Part B Polymer Physics, 2010, 48(15):1749-1756.

[19]LEE J W, KIM S Y, KIM S S, et al. Synthesis and characteristics of interpenetrating polymer network hydrogel composed of chitosan and poly(acrylic acid)[J]. Journal of Applied Polymer Science, 1999, 73(1):113-120.

[20]LOPES C M A, FELISBERTI M I. Mechanical behaviour and biocompatibility of poly(1-vinyl-2-pyrrolidinone)-gelatin IPN hydrogels[J]. Biomaterials, 2003, 24(7):1279-1284.

[21]DRAGAN E S, APOPEI D F. Synthesis and swelling behavior of pH-sensitive semi-interpenetrating polymer network composite hydrogels based on native and modified potatoes starch as potential sorbent for cationic dyes[J]. Chemical Engineering Journal, 2011, 178(1):252-263.

[22]HU X, WANG Y, ZHANG L, et al. Redox/pH dual stimuli-responsive degradable Salecan-g-SS-poly(IA-co-HEMA) hydrogel for release of doxorubicin[J]. Carbohydrate Polymers, 2017, 155:242-251.

[23]DRAGAN E S, PERJU M M, DINU M V. Preparation and characterization of IPN composite hydrogels based on polyacrylamide and chitosan and their interaction with ionic dyes[J]. Carbohydrate Polymers, 2012, 88(1):270-281.

[24]LI M, WU Z, ZHANG C, et al. Study on porous silk fibroin materials. Ⅱ. Preparation and characteristics of spongy porous silk fibroin materials[J]. Journal of Applied Polymer Science, 2001, 79(12):2192-2199.

[25]CHEN Y Q, CHEN L B, BAI H, et al. Graphene oxide-chitosan composite hydrogels as broad-spectrum adsorbents for water purification[J]. Journal of Materials Chemistry A, 2013, 1(6):1992-2001.

[26]NIE W, YUAN X, ZHAO J, et al. Rapidlyinsituforming chitosan/ε-polylysine hydrogels for adhesive sealants and hemostatic materials[J]. Carbohydrate Polymers, 2013, 96(1):342-348.

[27]MANDAL B B, KAPOOR S, KUNDU S C. Silk fibroin/polyacrylamide semi-interpenetrating network hydrogels for controlled drug release[J]. Biomaterials, 2009, 30(14):2826-2836.

[28]JAISWAL M, KOUL V, DINDA A K, et al. Cell adhesion and proliferation studies on semi-interpenetrating polymeric networks (semi-IPNs) of polyacrylamide and gelatin[J]. Journal of Biomedical Materials Research Part B Applied Biomaterials, 2011, 98(2):342-350.

PreparationandcelladhesionpropertyofTA/PDMAAsemi-IPNhydrogels

HU Xinyu, WANG Yongmei, ZHANG Liangliang, XU Man

(Jiangsu Province Biomass Energy and Materials Laboratory, Institute of Chemical Industry of Forestry Products,CAF, Nanjing 210042, China)

Due to the dense pore structure, the pure poly(N, N-Dimethylacrylamide) (PDMAA) hydrogel was non-degradable which restricts its application in tissue engineering. To solve this problem, a series of novel semi-interpenetrating polymer network (semi-IPN) hydrogels containing TA and PDMAA were designed and synthesized by radical polymerization and semi-IPN technology. The introduction of TA into the PDMAA network endowed the system with enhanced cell adhesion and degradation properties. The results of SEM showed that the addition of 1 mL of TA solution into the PDMAA hydrogel achieved substantial change in the final morphology. The TA/PDMAA semi-IPN hydrogel had a well-interconnected porous structure with tunable pore size ranging from 37.7 μm to 87.1 μm. The TA/PDMAA semi-IPN hydrogels was degradable in phosphate buffered saline (PBS) solution. The degradation rate could be tuned by modulating the content of cross-linker. The results of cytotoxicity tests demonstrated that the TA/PDMAA semi-IPN hydrogels were non-toxic to COS-7 cells and CHO cells, and the cell viability all exceeded 90%. The introduction of TA into the PDMAA network improved the cell adhesion properties, and COS-7 cells and CHO cells could grow well on the surface of TA/PDMAA semi-IPN hydrogels. The TA/PDMAA semi-IPN hydrogels exhibited good biocompatibility and had potential for tissue engineering application.

semi-IPN hydrogels; cell adhesion; porous structure; degradation property; cell viability

2017-03-23

2017-05-27

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFD0600806)；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(JSBEM-S-201609)。

胡新宇，男，助理研究員，博士，研究方向?yàn)楣δ芨叻肿幽z材料。E-mail:huxinyulhs@163.com

TQ351.3

A

2096-1359(2017)06-0037-08