孔 瑩 段洪超 劉 洋 王 策 譚元奇

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150040；3.北京市石景山區(qū)中醫(yī)院，北京 100043）

頭穴透刺對JNK通路抑制后腦出血大鼠腦組織p-STAT3影響的研究*

孔 瑩1段洪超2劉 洋1王 策1譚元奇3△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150040；3.北京市石景山區(qū)中醫(yī)院，北京 100043）

目的針刺急性期腦出血模型大鼠百會透曲鬢穴，觀察JNK通路被抑制后其下游通路蛋白p-STAT3的表達變化及頭針對腦組織是否起到保護作用。方法選用雄性SD大鼠84只隨機分為空白組與假手術組各6只，模型組、針刺組（模型+針刺組）與SP600125（模型+抑制劑組）各24只；造自體血腦出血模型，選擇針刺百會穴透曲鬢穴的方法，在頭部一針貫穿頂額顳三區(qū)。于造模成功后針刺，在6 h，1 d，3 d，7 d 4個時間點取材，采用免疫組化分析法（IHC）觀察腦組織內(nèi)p-STAT3的陽性細胞灰度值。結果針刺百會透曲鬢穴可以減輕模型動物神經(jīng)缺損癥狀，提高評分。p-STAT3在大鼠腦出血后6 h表達開始增多，1 d表達相對最多，3 d達高峰后迅速減少，7 d仍有表達。針刺組各時間點陽性細胞灰度值均比模型組降低，具有顯著差異。針刺組與SP600125組比較差異有統(tǒng)計學意義。結論針刺百會透曲鬢穴能夠減輕大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分，并降低p-STAT3蛋白的表達，表明針刺在腦出血的治療中起到了腦保護作用。

腦出血 百會透曲鬢 p-STAT3

腦出血（ICH）是指非外傷性腦實質內(nèi)血管破裂引起的出血，ICH和蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）占所有卒中的20%。腦出血的發(fā)病率有種族差異：黑種人、西班牙人和亞洲人的發(fā)病率較高，白種人發(fā)病率較低，西方以缺血性腦卒中為主，而中國人更易發(fā)生出血性腦卒中，中國人出血性腦卒中與缺血性腦卒中的發(fā)病率相當［1］。JAK/STAT細胞內(nèi)信號轉導途徑是由JAKS蛋白家族和STATS蛋白家族組成，JAKs活化后可以募集細胞漿內(nèi)相應的信號傳導和底物STATS，從而使STATS活化，轉變?yōu)榱姿峄腟TATS，即p-STAT。p-STAT以二聚體（同源或異源）的存在方式移向核內(nèi)，作用于目的基因的啟動子，直接激活目的基因表達［2］。許多研究發(fā)現(xiàn)JAK/STAT信號轉導途徑可以誘導細胞的增殖、分化或凋亡過程，而STAT3與神經(jīng)細胞密切相關。本課題觀察JNK通路被抑制劑后，針刺百會透曲鬢穴療法對不同組大鼠p-STAT3表達的影響，探討本針刺方法對腦出血急性期后繼發(fā)性損傷的神經(jīng)保護機理及與大鼠腦組織中p-STAT3免疫組化表達的相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康清潔級雄性SD大鼠，8周齡，體質量 （300±20）g，購于哈爾濱獸醫(yī)研究所，動物許可證號：SCXK（吉）-2013-0002。飼養(yǎng)1周后開始造模，造模前給予光照周期12 h，黑暗 12 h，禁食12 h，禁水6 h。

1.2 試藥與儀器

立體定位儀，成都市儀器廠，ST-5ND-C；臺式牙鉆機，上海市齒科醫(yī)械廠，307-6型；組織包埋機，天津市久圣醫(yī)療電子儀器有限公司，JBM-A；自動脫水機，天津市航空機電公司，TSJ-1型；石蠟展片機，天津航空機電公司，ZPJ-1型；50 μL微量注射器，上海市高鴿儀器廠；1.5 寸針灸針，安迪牌；SP600125，碧云天生物；DMSO，Sigma美國中國分裝；p-STAT3免疫組化試劑盒，碧云天生物；多聚甲醛，天津博迪化工分析純；羊抗兔IgG，武漢博士德；PV-6001二步免疫組化檢測試劑，北京中衫金橋生物；PV-6002二步免疫組化檢測試劑，北京中衫金橋生物；DAB顯色試劑盒，北京中衫金橋生物。

1.3 模型制備

首先腹腔麻醉大鼠，使其固定于立體定位儀上，頭部矢狀位切皮，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜［3］確定右側尾殼核位置，參照鄒氏法和Rosenberg BG方法［4］制作腦出血大鼠模型。暴露前囟及冠狀縫，確定了前囟Bregma 點，用牙科鉆頭在其右側旁開 3.5 mm，后 0.2 mm鉆直徑約為1.0 mm的圓孔至硬腦膜后停止。用微量注射器取自體血（斷尾）50 μL注射，注射后留針約5 min。造模過程中的數(shù)量大于84只，如有死亡，每個時間點均可以補充。待麻藥代謝后大鼠轉為清醒狀態(tài)，采取Berderson［5］評分法選擇符合標準的模型。

1.4 分組與干預

將健康雄性SD大鼠隨機選取12只：空白組6只大鼠，假手術組6只大鼠。其余造模，分為模型組、針刺組、SP600125組，此3組每組24只。空白組不作任何處理。假手術組：顱骨鉆孔，術后縫合，不注入自體血。模型組隨機選取24只大鼠，按時相分為6 h，1 d，3 d，7 d 4個時間點，每個時間點6只大鼠，于造模成功后相應時間點取材。針刺組隨機選取24只大鼠，按時相分為 6 h，1 d，3 d，7 d 4個時間點，每個時間點 6 只大鼠，于腦出血造模后6 h，1 d，3 d，7 d分別給予針刺治療。根據(jù)華興邦的大鼠穴位圖譜針刺患側百會透曲鬢穴。參照針灸技術操作規(guī)范［6］（頭針部分）操作：大鼠針刺部位用75%的酒精消毒，由中心區(qū)向外擦拭，將1.5寸針灸針迅速刺入帽狀腱膜下層，針體與皮膚呈30°角進針，每次進針0.8寸，操作者肩肘腕關節(jié)和拇指固定不動，保持毫針固定，食指第一、二節(jié)呈半屈曲狀，用拇指食指持住針柄，食指掌指關節(jié)做屈伸運動，以200r/min速度捻轉。各時間點給予針刺1次，留針30min，期間捻轉3次，每次3 min（同一人操作）。SP600125組隨機選取24只大鼠，按時相分為 6 h，1 d，3 d，7 d 4個時間點，每個時間點6只大鼠。配置的DMSO質量濃度為10mL/L，SP600125質量濃度為3g/L。使SP600125溶于DMSO溶液，取10 μL，于腦出血造模前10 min給藥，注入側腦室，造模同模型組。

1.5 標本采集與檢測

造模成功后在相應時相點，腹腔注射水合氯醛進行麻醉，麻醉后快速用多聚甲醛灌注，待大鼠雙肺呈白色，軀體如板狀后，斷頭取腦。以注射自體血針道為中心做厚度約5mm冠狀切片。部分標本將其放入4%多聚甲醛/0.1 mol/L PBS固定液中固定用于HE染色，按常規(guī)步驟進行脫水、浸蠟、包埋，最后制成厚度大約為5 μm的石蠟切片。

1.5.1 HE染色 石蠟切片，脫蠟水化，蘇木精 5 min，然后水洗。經(jīng)過20 s的鹽酸酒精分化后水洗，水洗要求充分。用弱氨水返藍，再次持續(xù)20 s。然后用水浸泡10 min后，給予伊紅染色，用酒精和二甲苯分別脫水，透明，中性樹膠封片。

1.5.2 p-STAT3的 IHC測定 首先切片常規(guī)脫蠟至水，置于3%雙氧水中充分在室溫下浸泡孵育后，熱抗原修復至自然冷卻與室溫一致，滴加一抗（適當稀釋的p-STAT3多克隆抗體 1∶200），4℃孵育過夜，用0.01 mol/L PBS沖洗。然后滴加生物素化二抗工作液30 min，再次用 0.01 mol/L PBS 沖洗，清洗后 DAB 顯色5～30 min，鏡下控制顯色時間，并用蒸餾水充分沖洗，蘇木素復染并用中性樹膠封片。

1.5.3 圖像分析 顯微鏡下，DAB顯色陽性細胞呈棕黃色或褐色，利用Motic image 3.2圖像采集系統(tǒng)采集圖像并進行分析在Motic-BA 400倍顯微鏡視野下觀察。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 排除大鼠應激反應造成的神經(jīng)功能缺損

大鼠造模蘇醒后，不排除會出現(xiàn)應激反應，所以本實驗經(jīng)過評分后篩選造模成功（成模標準：提尾倒掛大鼠患側前肢緊貼胸壁或活動時向對側傾倒，甚至不能行走）大鼠。如果是應激反應造成神經(jīng)功能的缺損，隨著時間的延長（3 d內(nèi)），大鼠癥狀會減輕，而本實驗造模成功的大鼠，神經(jīng)缺損癥狀會加重，評分增高。

2.2 各組大鼠不同時間點和不同干預方法下的神經(jīng)功評分情況

見表1。大鼠平均在術后30 min蘇醒，空白組大鼠和假手術組無神經(jīng)功能缺損，大鼠活動能力與之前無明顯差異。而造模成功后大鼠出現(xiàn)了不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀。腦出血病灶對側肢體出現(xiàn)了爬行時劃圈和與人類相似的前肢屈曲回收于腹下，后肢外展的癥狀。造模后的大鼠6 h即有上述癥狀，3 d時受損情況最為明顯，隨后逐漸減輕。針刺組與SP600125組大鼠的臨床表現(xiàn)優(yōu)于模型組大鼠，針刺組與模型組比較，6 h，1 d 評分差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），3 d，7 d評分有顯著差異 （P＜0.01）。SP600125組與模型組比較有明顯差異（P＜0.01），而針刺組與SP 600125組比較，在各時間點均有顯著差異（P＜0.01）。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損體征評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損體征評分比較（分，±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與SP600125組比較，△P＜0.01。下同。

6 h 1 d 3 d 7 d 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 2.17±0.72 2.25±0.44 2.83±0.83 1.75±0.44針刺組 24 1.53±0.48*△ 1.75±0.45*△ 2.15±0.44**△ 1.08±0.50**△SP600125 組 24 1.12±0.75**1.38±0.60**1.50±0.62**0.63±0.60**組 別 n空白組 6假手術組 6模型組 24

2.3 各組大鼠不同時間點p-STAT3的表達

見表2?？瞻捉M和假手術組大鼠腦組織神經(jīng)細胞結構及形態(tài)正常，未見p-STAT3陽性細胞表達，故未計入統(tǒng)計范圍內(nèi)。p-STAT3主要表達于細胞核和胞質中，胞質內(nèi)表達量較少。表達在大鼠腦出血1 d后增多，3 d達高峰后迅速減少，7 d仍有表達。p-STAT3在大鼠腦出血后6 h表達開始增多，1 d表達相對最多，3 d達高峰后迅速減少，7 d仍有表達。針刺組各時間點陽性細胞灰度值均比模型組降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。針刺組與SP600125組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠不同時間點p-STAT3灰度值比較（±s）

表2 各組大鼠不同時間點p-STAT3灰度值比較（±s）

6 h 1 d 3 d 7 d 2.67±0.82 2.67±0.82 2.67±0.82 2.67±0.82 3.17±0.75 3.17±0.75 3.17±0.75 3.17±0.75 8.25±0.93 45.56±5.41 32.63±4.02 17.50±1.51針刺組 24 7.33±1.75*△ 39.17±4.23*△ 28.00±1.79*△ 14.18±1.47*△SP600125 組 24 5.45±0.84**31.67±4.75**24.92±3.88**10.50±2.88**組 別 n空白組 6假手術組 6模型組 24

2.4 各組大鼠腦組織形態(tài)學觀察

光鏡下可見，空白組和假手術組標本神經(jīng)元細胞和膠質細胞飽滿，未見炎性浸潤，血管內(nèi)皮結構正常，胞內(nèi)核仁清晰，核染色質分布均勻，組腦組織結構完整。術后6 h，組織內(nèi)血腫帶出現(xiàn)，且邊界混亂不清晰，部分神經(jīng)細胞表現(xiàn)出核固縮，炎性細胞開始表現(xiàn)出浸潤，膠質細胞發(fā)生了腫脹改變，組織細胞間隙可見條索狀等不規(guī)則空泡，腦組織液化，開始出現(xiàn)壞死。1 d逐漸加重，3 d表現(xiàn)比其他時間點明顯，7 d后，血腫組織縮小，膠質細胞在增生后回縮，細胞層次混亂不清。針刺組和SP600125組較模型組損害減輕。

3 討 論

JNK家族是促分裂原活化蛋白激酶家族的成員之一，JNK信號通路可被細胞因子、生長因子、應激等多種因素激活，在細胞增殖與分化、細胞凋亡、應激反應等多種細胞調控方面起著至關重要的作用［7］。其主要作用是參與了細胞的凋亡過程。SP600125通過可逆性競爭ATP抑制JNK磷酸化，選擇性抑制JNK-1、2、3，從而起到抑制JNK信號轉導通路的作用［8］。同時，SP600125參與了抑制細胞活化和分化，并且影響炎癥基因的表達，Bennett等通過實驗證實SP600125具有抑制細胞凋亡的發(fā)生和對細胞免疫調節(jié)起到良性作用［9］。STAT3作為JNK下游的JAK/STAT3信號轉導通路蛋白，參與了細胞的增殖，分化，凋亡等多個生理病理過程［10］，有研究顯示大鼠在腦出血和腦缺血時，JAK/STAT3信號通路可立即被引發(fā)激活，而抑制本條通路的激活可以通過減少神經(jīng)元死亡而起到腦保護作用［11-12］。本實驗選取百會透曲鬢穴進行針刺，此兩穴是治療中風效果較為理想的經(jīng)驗效穴，現(xiàn)代研究證明［13-17］可以減輕水腫程度、影響自噬相關蛋白，抑制或減輕炎性反應，抑制細胞凋亡，從而保護了受損的神經(jīng)，起到對腦的良性調節(jié)作用。古代醫(yī)學認為百會位于頭巔頂部，屬督脈，是手足三陽、足厥陰、督脈諸經(jīng)之會，功能祛風、醒腦、宣閉、開竅、泄熱，且是為諸陽之會，百脈之宗。其穴位解剖位置在淺表皮膚層布有枕動、靜脈吻合網(wǎng)及額神經(jīng)和枕大神經(jīng)，腦內(nèi)深層布有大腦皮質運動區(qū)、旁中央小葉和動靜脈網(wǎng)，針刺百會穴通過神經(jīng)體液調節(jié)可以達到改善神經(jīng)缺損癥狀［18-19］。曲鬢位于足少陽經(jīng)，是足太陽和足少陽之會，其解剖位置在顳肌中，有顳淺動、靜脈，耳顳神經(jīng)顳支分布。此種針刺方法跨過了頂、額、顳3區(qū)，同時督脈、足太陽、足少陽3經(jīng)貫穿，這一穴區(qū)經(jīng)脈從頭至足縱貫全身，起到統(tǒng)調一身之陽氣、醒腦開竅的功能。在百會至曲鬢穴區(qū)進行透刺，其現(xiàn)代解剖位置同樣與本病相符合，再施以快速捻轉手法，可以鼓動頭部經(jīng)氣的運行，通達全身經(jīng)絡系統(tǒng)。

從本實驗觀察到腦出血造模成功后，p-STAT3的表達即開始升高，針刺組p-STAT3的表達同樣升高，但是低于模型組，且與抑制劑的作用方向一致，表明本針刺方法抑制了p-STAT3的表達，起到了腦保護作用，為臨床中醫(yī)治療腦出血提供了實驗基礎。

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Study of Penetration Acupuncture on p-STAT3 of Cerebral Hemorrhage Rats′Brain Tissues after JNK Pathway Inhibition

KONG Ying，DUAN Hongchao，LIU Yang，et al. Heilongjiang University of Chinese Medicine，Heilongjiang，Harbin 150001，China.

Objective：To observe the expression variation of JNK pathway′s downstream of molecule-p-STAT3，after JNK pathway inhibition by acupuncture penetrating Baihui（GV20） and Qubin（GB7） on acute cerebral hemorrhage model rats，and to observe whether acupuncture had protection on brain tissues.Methods：84 male SD rats were randomly divided into 5 groups： blank groups，sham operation group，the model group，acupuncture group（model and acupuncture group） and inhibitor group（SP600125）.Each group had 24 rats.The mode rats of autologous blood cerebral hemorrhage were made，and after modeling success，they were acupunctured through the three parts of frontal，parietal and temporal with one needle by the method of acupuncture penetrating Baihui（GV20） and Qubin（GB7）.After successful modeling，acupuncture was taken at four points： 6 h，3 d and 7 d，and the gray value of p-STAT3 positive cells in brain tissue was observed by immunohistochemistry （IHC）.Results：Acupuncture penetrating Baihui（GV20）and Qubin （GB7）could reduce the nerve defect symptoms and improve the score of model animals.The expression of p-STAT3 began to increase in the six hours after intracerebral hemorrhage in rats，and the expression was the most in the first day，and decreased rapidly after reaching the peak on the third day，and still expressed on the seventh day.The gray value of the positive cells in the acupuncture group was lower than that in the model group at each time point，and the difference was significant.There was statistical significance between acupuncture group and SP600125 group.Conclusion：Acupuncture penetrating Baihui（GV20） and Qubin（GB7） can reduce the degree of neurologic impairment and reduce the expression of p-STAT3 protein in rats，which indicates that acupuncture plays a neuroprotective role in the treatment of intracerebral hemorrhage.

Cerebral hemorrhage；Acupuncture penetrating Baihui（GV20） and Qubin（GB7）；p-STAT3

R245.3

A

1004-745X（2017）11-1895-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.11.005

黑龍江中醫(yī)藥大學博士創(chuàng)新基金 （2017bs05）；黑龍江省教育廳科學技術研究項目（12531633）；黑龍江省博士后資助項目（LBH-Z12249）；黑龍江省中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院科研基金資助面上項目（YM-201701）

△通信作者（電子郵箱：damwaongi123@aliyun.com）

2017-07-24）