國內(nèi)外抗除草劑基因?qū)＠姆治?/h1>
2017-11-30 21:13:31張玉池王曉蕾徐文蓉劉琪相世剛戴偉民強勝宋小玲
雜草學(xué)報 2017年2期
張玉池+王曉蕾+徐文蓉+劉琪+相世剛+戴偉民+強勝+宋小玲
摘要：抗除草劑基因是培育抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物的基礎(chǔ)。自1983年第1例抗草甘膦基因報道以來，到目前已經(jīng)從微生物和植物中發(fā)掘出大量的抗性基因，并采用人工改造和基因融合的方法獲得了新的抗性基因。本文歸納總結(jié)了國內(nèi)外抗除草劑基因的專利，目的是為我國抗除草劑基因的發(fā)掘提供參考。經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，國際上抗除草劑基因?qū)＠?2項，發(fā)掘的基因?qū)Σ莞熟?、草丁膦、磺酰脲類、溴苯腈?，4-D、麥草畏、咪唑啉酮類、苯并呋喃類、吡啶甲酸酯類、原卟啉原氧化酶（PPO）抑制劑類、羥苯基丙酮酸加雙氧酶（HPPD）抑制劑類、芳氧苯氧丙酸酯類（包括喹禾靈）和環(huán)己烯酮類13個種類除草劑有抗性。我國有48項專利，發(fā)掘的基因?qū)Σ莞熟ⅰ⒉荻§?、咪唑啉酮類、磺酰脲?個種類除草劑有抗性，且40項屬于抗草甘膦基因。我國雖在專利數(shù)量上與國外相差不大，但在種類上遠(yuǎn)不及國外。因此，在我國抗除草劑基因的研究與開發(fā)方面面臨著挑戰(zhàn)。
關(guān)鍵詞：抗除草劑基因；專利申請；除草劑；國內(nèi)外差距；發(fā)展策略
中圖分類號：S451；D913.4 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1003-935X（2017）02-001-22
Analysis on the Patents of Herbicide Resistance Gene at Home and Abroad
ZHANG Yu-chi，WANG Xiao-lei，XU Wen-rong，LIU Qi，XIANG Shi-gang，DAI Wei-min，QIANG Sheng，SONG Xiao-ling
（Weed Research Laboratory，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）
Abstract：Herbicide resistance genes are the basis for breeding herbicide-resistant transgenic crops. Since the first case of glyphosate-resistance gene was reported in 1983，a large number of resistance genes have been isolated from microbes and plants，and new resistance genes have been obtained by means of artificial modification and gene fusion. In order to provide information for developing herbicide-resistant genesdomestically，it summarized the patent of herbicide-resistance gene at home and abroad. Through counting discovering，it was found that there were 52 herbicide-resistance gene patents at abroad，and the genes were resistant to 13 herbicides incuding glyphosate，glufosinate，sulfonylureas， bromoxynil，2，4-D，dicamba，imidazolinones，benzofuran，pyridine formate，protoporphyrin oxidase （PPO） in-hibitors，hydroxyl phenyl pyruvate plus dioxygenase （HPPD） inhibitors，aryloxy phenoxy propionates （quinoxaline） and cyclohexanediones. There are 48 herbicide-resistance gene patents in China，among which 40 belonged to glyphosate resistant gene. While the genes were resistant to 4 herbicides including the glyphosate，glufosinate，imidazolinones and sulfonylureas. Although the patent numbers had little disparity at home and abroad， but the species were far less than foreign. Therefore，herbicide-resistance gene research and development was confronted with challenges in China.
Key words：herbicide-resistance gene；patents application；herbicide；the disparity at home and abroad；development strategy
早在20世紀(jì)70年代初期國際上就開始了轉(zhuǎn)基因作物的研究，至今已經(jīng)培育出多種轉(zhuǎn)基因作物，涵蓋了大部分糧食作物及經(jīng)濟作物，如水稻、玉米、棉花、煙草、番茄、辣椒、大豆、楊樹等，目的基因大部分為抗除草劑、抗蟲、抗病和抗逆等抗性基因，其中貢獻最大的是抗除草劑基因。2016 年全球單一抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物、抗蟲/抗除草劑復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物分別占總轉(zhuǎn)基因作物種植面積的47%和41%，因此抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物的總種植面積達(dá)到了88%[1]?？钩輨┺D(zhuǎn)基因作物的種植不僅降低了雜草的防除成本，增加了作物產(chǎn)量，同時也減少了除草劑對當(dāng)茬和后茬作物的殘留藥害，降低了環(huán)境污染[2-3]。但是，由于目前釋放的抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物主要是對草甘膦的抗性，抗除草劑的單一化，使得田間雜草對草甘膦產(chǎn)生了抗藥性[4]。自從1996年在澳大利亞出現(xiàn)抗草甘膦的硬直黑麥草（Lolium rigidum）后，全球草甘膦雜草抗藥性物種逐年增加。據(jù)統(tǒng)計，到2017年已有26個國家共計37種雜草對草甘膦產(chǎn)生了抗藥性。為了避免除草劑單一化的問題，人們一直在發(fā)掘不同類型的抗除草劑基因。下面從抗除草劑基因的國際專利和我國擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的專利2個方面解析抗除草劑基因?qū)＠纳暾埱闆r，目的是為我國抗除草劑基因的發(fā)掘提供參考。endprint
1 抗除草劑基因的專利申請概況
通過查詢佰騰專利網(wǎng)站（http：//so.baiten.cn/Index/Index），整理得到了國際和國內(nèi)抗除草劑的專利申請情況。目前抗除草劑基因申請保護的國際專利主要有52項；國內(nèi)核心專利主要有48項。下面分別對國際和國內(nèi)的抗除草劑基因?qū)＠暾垹顩r進行分析。
1.1 國際專利中的抗除草劑基因
1.1.1 自然來源的抗除草劑基因 從自然界生物中獲得的抗除草劑基因主要對草甘膦、草丁膦、磺酰脲類、溴苯腈、2，4-D、麥草畏、咪唑啉酮類、苯并呋喃類、吡啶甲酸酯類、原卟啉原氧化酶（PPO）抑制劑類、羥苯基丙酮酸加雙氧酶（HPPD）抑制劑類、芳氧苯氧丙酸酯類（包括喹禾靈）和環(huán)己烯酮類共13個種類的除草劑有抗性（表1）。
抗草甘膦基因主要有3類，第一類是5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸（EPSP）合酶基因。5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）是葉綠體中的一種酶，它能催化芳香族氨基酸的合成，而草甘膦能競爭性抑制EPSPS的作用，導(dǎo)致葉綠體類囊體薄膜上的蛋白質(zhì)合成受阻，使得葉綠體的結(jié)構(gòu)受損，從而致使功能受損。具有草甘膦耐性的EPSP合酶有3個類型：Class Ⅰ、Class Ⅱ和Class Ⅲ。美國孟山都公司（Monsanto Company US）從鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium strain TA831）克隆獲得了編碼EPSP合酶的aroA基因，編碼的氨基酸能夠合成 5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（Class Ⅰ 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase），此酶與草甘膦的親和力低，產(chǎn)生對草甘膦的抗性[5]。Barry等從根癌農(nóng)桿菌CP4、無色桿菌（Achromobacter strain LBAA）、假單胞菌PG2982（Pseudomonas strain PG2982）、枯草芽孢桿菌（Bacilus subtilis）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）克隆了Class Ⅱ EPSPS基因，此類基因能夠降低作物對草甘膦的親和力，使作物對草甘膦具有更高的耐受性[6]。埃森尼克斯生物技術(shù)公司（Athenix Corporation）從肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）、根癌農(nóng)桿菌、丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae） 中克隆獲得一系列新的EPSPS基因，屬于Class Ⅲ型 ，此類基因編碼的氨基酸合成的Class Ⅲ 5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（Class Ⅲ 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase）與草甘膦的親和力低而具有耐草甘膦的特性[7]。第二類是草甘膦降解酶基因。倫敦威斯康星大學(xué)帝國化學(xué)學(xué)院[Imperial Chemical House，Millbank，London SWlP 3JF （GB）]從木糖氧化產(chǎn)堿菌（Alcaligenes xylosoxidans）和假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）中克隆出新的降解草甘膦的基因，此類基因被分別命名為SC9基因和SC11基因[8]。美國孟山都公司（Monsanto Compay US）從人蒼白桿菌（Ochrobactrum anthropi strain LBAA）中發(fā)現(xiàn)了草甘膦氧化還原酶基因（gox）。這些基因可以表達(dá)降解草甘膦的蛋白酶，使草甘膦的C—N鍵斷裂生成氨甲基磷酸 （AMPA） 和乙醛酸鹽[9]。第三類是草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（gat）。先鋒種子公司（Pioneer Hi-Bred IntⅠ.）從地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）中克隆出了gat，該基因編碼草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（glyphosate-N-acetyltransferase，GLYAT），該酶能夠?qū)Ⅳ然鶊F從CoA轉(zhuǎn)移到草甘膦的N端，使草甘膦失活[10]。
抗草丁膦基因主要有2類：第一類是具有草丁膦解毒作用的N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（PAT）基因pat。拜耳科學(xué)作物公司（Bayer Crop Science）分別從吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）和綠色鏈霉菌（Streptomyces viridochromo）中克隆獲得能編碼PAT的基因bar和pat[11]。另一類是谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）基因，此酶可以過表達(dá)谷氨酰胺，從而實現(xiàn)對草丁膦的耐性。美國馬薩諸塞州Hospital Corporation公司[The General Hospital Corporation（Boston，MA）]從突變的苜蓿（Medicago sativa）中分離出了基因gs，將此基因?qū)胨尽⒂衩?、小麥等作物中后，轉(zhuǎn)基因gs能夠表達(dá)谷氨酰胺合成酶，此酶能有效解除草丁膦的毒性，從而使作物擁有抗草丁膦的特性[12]。
此外，美國陶氏益農(nóng)公司（Dow AgroScience LLC）從藍(lán)色鏈霉菌A3中克隆出基因dsm-2（dsm-2和pat有30%的同源性，和bar有28%的同源性），其表達(dá)的DSM-2蛋白對膦絲菌素和雙丙氨酸具有耐受性，可以提高植株對草丁膦的耐性。以CSVMV或AtUbil0作為啟動子，構(gòu)建了DSM-2的質(zhì)粒載體，成功轉(zhuǎn)入了油菜、大豆及具有抗蟲性的煙草和玉米中，使其同時擁有了對草丁膦的耐性[13]。
原卟啉原氧化酶（protoporphyrinogen oxidase，PPO）是原卟啉IX生物合成的關(guān)鍵酶，是血紅素和葉綠素相同生物合成通路上最后1個共有酶，它催化原卟啉原IX氧化為高度共軛的原卟啉IX。原卟啉原氧化酶抑制劑基因（PPX）能夠防止除草劑與PPO穩(wěn)定結(jié)合，以獲得作物對原卟啉原氧化酶抑制性除草劑的抗性。美國Cibus有限責(zé)任公司（Cibus US LLC）從一些植物的突變體中發(fā)現(xiàn)了突變型原卟啉原IX（protoporphyrinogen IX，PPX）基因，包括來自于突變型擬南芥、長芒莧（Amaranthus palmeri）、水稻（Oryza sativa）、高粱（sorghum bicolor）、玉米（Zea mays）、大豆（Glycine max）、馬鈴薯（Snlanum tuberosum）、蓖麻（Ricinus communis）和油菜（B. napus）線粒體內(nèi)的PPX基因，導(dǎo)入這些基因的植株可編碼突變的PPX蛋白，從而使目的植株對PPX抑制劑類除草劑（苯并嗪酮類、氟磺胺草醚、乙氧氟草醚、三氟羧草醚和二苯醚類）有抗性[14]。德國巴斯夫公司（BASF SE）發(fā)現(xiàn)了一系列微生物來源和植物來源的野生型或變異型編碼PPO的基因，包括：莧屬（Amaranthus）的PPX2L WC、PPX2L AC、PPX2L CC R、PPX2L AC R和PPX2，擬南芥的PPX和PPOX，煙草（Nicotiana tabacum） 的ppxl和ppxll，菊苣（Cichorium intybus）的PPX1，菠菜（Spinacia oleracea）的SO-POX2和SO-POX1，高粱（Sorghum bicolor）的Hyp. Protein，以及茄屬（Solanum）的PPOX，玉蜀黍?qū)伲╖ea）的ZM BFc0091803和prpo2，衣藻屬（Chlamydomonas）的Ppx1，稻屬（Oryza）的PPOX1和Hyp.Protein，大豆屬（Glycine）的hemG和黃瓜屬（Cucumis）的 CsPPO。這些基因可使植物對PPX抑制劑類除草劑（苯并嗪酮類）除草劑具有抗性或耐性[15]。endprint
抗2，4-D 的基因主要有2種：一種基因編碼的氨基酸能夠合成甲基轉(zhuǎn)移酶，如田納西大學(xué)發(fā)現(xiàn)了抗2，4-D的基因PtJBMT3，此基因編碼的甲基轉(zhuǎn)移酶能夠使2，4-D失活[16]；另一種基因編碼的氨基酸能夠合成芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶（AAD），如美國陶氏益農(nóng)公司從細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的aad-1、aad-13和aad-12。美國陶氏益農(nóng)公司（Dow AgroSciences LLC）從鞘氨醇單胞菌（Sphingobium herbicidovorans）中克隆獲得了耐2，4-D的基因，命名為aad-1。該基因編碼的氨基酸能夠合成芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶（AAD-1），此酶可以降解 2，4-D 的側(cè)鏈和芳氧苯氧丙酸酯類除草劑的右旋異構(gòu)體。將該基因插入玉米基因組的特定位點，即事件DAS-40278-9 （pDASl 740），獲得的轉(zhuǎn)基因玉米對除草劑2，4-D和喹禾靈有抗性。該公司從鞘氨醇單胞菌中克隆獲得了另一個基因，命名為aad-13。該基因編碼的氨基酸能夠合成芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶AAD-13（Aryloxy alkanoate dioxygenase，AAD-13），此酶可降解 2，4-D類和吡啶氧乙酸類的除草劑[17]。美國陶氏益農(nóng)公司（Dow AgroSciences LLC）從食酸叢毛單胞菌（Comamonas acidovorans）中克隆出另一個基因，并命名為aad-12。該基因編碼的芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶AAD-12可催化降解2，4-D的側(cè)鏈，轉(zhuǎn)入該基因的植物不僅對除草劑2，4-D有抗性，對吡啶氧乙酸酯除草劑（氯氟吡氧乙酸、三氯吡氧乙酸等）也有抗性[18]。
羥苯基丙酮酸加雙氧酶（hydroxyphenyl pyruvate dioxygenase，HPPD）能催化植物體內(nèi)質(zhì)體醌與生育酚合成的起始反應(yīng)，即催化對羥基丙酮酸轉(zhuǎn)化為尿黑酸，這些尿黑酸經(jīng)過羧化、聚戊二烯基化和烷基化生成質(zhì)體醌和生育酚。而 HPPD抑制劑類除草劑（包括吡唑酮類、三酮類、二苯酮類、二酮腈類和異唑酮類）通過抑制HPPD，導(dǎo)致質(zhì)體醌和生育酚含量減少，植物體發(fā)生白化，并最終死亡。德國巴斯夫公司發(fā)現(xiàn)了一些來自野生型或自然突變型的擬南芥（Arabidopsis thaliana）和萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）的抗苯并呋喃類除草劑的核酸序列，這些核酸序列編碼HPPD或尿黑酸茄尼酯轉(zhuǎn)移酶（homogentisate solanesyl transferase，HST）。插入這些基因的作物可以過表達(dá)HPPD，從而獲得對HPPD抑制劑類除草劑的抗性。該公司還從弗蘭克氏菌屬（Frankia）和自然突變的植物（擬南芥和向日葵等）中發(fā)現(xiàn)了對HPPD抑制劑類除草劑（吡唑酮類、三酮類和異唑酮類）有抗性的自然突變核苷酸序列，這種序列表達(dá)的HPPD，使植物獲得對HPPD抑制劑類除草劑更強的耐受性[19]。德國拜耳公司（Bayer CropScience AG）從赤霉菌（Kordia algicida）中克隆出對HPPD抑制劑類除草劑有抗性的基因，命名為FMP27，此基因編碼的氨基酸能合成FMP27 HPPD蛋白，以FMP27基因構(gòu)建載體pSE420-FMP27e，并成功導(dǎo)入煙草中，使之具有對HPPD抑制劑類除草劑的耐性[20]。
除上述5類除草劑的抗性基因外，還發(fā)現(xiàn)了對其他類型除草劑有抗性的基因。美國孟山都公司（Monsanto Company）從嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia DI-6 ）中克隆獲得dmo基因，該基因編碼合成的麥草畏單加氧酶（dicamba mono-oxygenase enzyme），該酶以麥草畏為底物產(chǎn)生氧化反應(yīng)，實現(xiàn)了對麥草畏的抗性。將該基因?qū)霟煵莺嘶蛑泻罂稍鰪娖鋵湶菸返目剐裕魧?dǎo)入煙草葉綠體基因組中則會使含有基因dmo的轉(zhuǎn)基因煙草對麥草畏的抗性更強[21]。美國陶氏益農(nóng)公司（Dow AgroSciences LLC）發(fā)現(xiàn)一系列具有抗吡啶甲酸酯類除草劑的基因，包括來自擬南芥的AFB5、AFB4和SGT1b，以及AFB5的3個同源核酸序列，其中2個來自水稻（Oryza sativa），1個來自顫楊（Populus tremula×Populus tremuloides）。這些基因編碼合成的蛋白質(zhì)為吡啶甲酸酯生長素的結(jié)合物和受體，因此這些抗除草劑基因使作物對吡啶甲酸酯類除草劑具有抗性[22]。
杭州瑞豐科技公司從狗牙根（Cynodon dactylon）中克隆出了除草劑解毒基因N-Z1。該基因?qū)儆诩?xì)胞色素P450基因家族，對以下1至多種除草劑具有抗性，這些除草劑分屬于：乙酰乳酸合成酶（ALS）抑制劑類除草劑；原卟啉原氧化酶（PPO）抑制劑類除草劑；對羥苯基丙酮酸鹽雙氧化酶（HPPD）抑制劑類除草劑；光系統(tǒng)Ⅱ抑制劑型除草劑；合成生長素類除草劑等。將N-Z1的5′ 端與玉米的ubiquitin-1啟動子（ZmUbi-1）連接，同時在3′端與1個CaMV的 35S終止子連接，形成可以在植物中表達(dá)的開放閱讀框，并以此構(gòu)建 T-DNA 載體pCam1300-N-Z1，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法成功將該基因?qū)氲剿?，使其獲得對煙嘧磺隆和硝磺草酮的抗性[23]。
1.1.2 人工誘變獲得的抗除草劑基因 人工誘變也叫人工引變，是指利用物理因素（X射線、γ射線、紫外線、激光等）或化學(xué)誘變（如疊氮化鈉、乙基甲磺酸等）來處理植物，使植物發(fā)生基因突變。這種方法可提高突變率，創(chuàng)造人們需要的變異類型。
科羅拉多小麥研究基金有限公司（Colorado Wheat Research Foundation Limited）通過乙烷磺酸甲酯（EMS）誘變小麥種子，篩選出對乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）抑制劑類除草劑具有抗性的小麥突變體AF28-A、AF26-B 和AF10-D，將它們的相應(yīng)基因編碼的ACCase氨基酸序列與黑草（Buchnera cruciata）進行對比，發(fā)現(xiàn)其第2004位的丙氨酸被纈氨酸取代。用這類突變小麥通過傳統(tǒng)育種方法可獲得具有抗芳氧苯氧丙酸酯類或環(huán)己烯酮類除草劑的小麥個體[24]。endprint
維多利亞農(nóng)業(yè)服務(wù)有限公司（Agriculture Victoria Services Pty Ltd）通過疊氮化鈉（AZ）和甲基亞硝脲（MNU）對大約10 000粒水稻種子進行突變誘導(dǎo)，篩選出4株對喹禾靈具有抗性的水稻植株，通過對這4株突變體的核酸及蛋白的序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中1株水稻突變體在ACCase編碼區(qū)的羧基轉(zhuǎn)移酶區(qū)域存在1個堿基位點的突變，其第 2096 個氨基酸位點由GGC突變?yōu)锳GC，氨基酸由原來的甘氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻z氨酸。該抗性機理與抗喹禾靈的黑草相似，抗喹禾靈的黑草是第2096個氨基酸由甘氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱吮彼?。其?株抗性水稻未見此類突變，抗性機制尚不明確[25]。該公司還通過乙基甲磺酸（ethyl methane sulfonate，簡稱EMS）化學(xué)誘變大麥種子，篩選出抗咪唑啉酮類除草劑的種子，從這些抗性種子中獲得編碼乙酰乳酸合成酶（AHAS，也被稱為ALS）的核酸序列，命名為VBHT0805、VBHT0806、VBHT0802和VBHT0810，核酸比對結(jié)果顯示，這些序列與抗咪唑啉酮類除草劑基因AHAS Hvulgare AF059600完全一致或只存在1個堿基位點的變化[26]。
1.1.3 人工改造獲得的抗除草劑基因 為了提高優(yōu)化植物抗除草劑的能力，在發(fā)現(xiàn)的抗除草劑基因的基礎(chǔ)上，人們通過基因定點突變和密碼子改造方法獲得了具有對同種及多種除草劑有耐性的基因（表2）。
通過基因定點突變獲得的除草劑基因如下，美國Incima有限責(zé)任公司和美國西布斯有限責(zé)任公司（Incima US LLC和Cibus US LLC）發(fā)明了一種獲得非轉(zhuǎn)基因耐草甘膦植物的新方法。該方法利用重組寡核糖小體，在基因EPSPS編碼區(qū)定點突變，使得序列編碼的氨基酸發(fā)生1至多個改變，合成的蛋白對草甘膦等甲基甘氨酸類除草劑有抗性。最后通過基因槍法將該突變的重組寡核糖小體導(dǎo)入到植物中，獲得擁有抗甲基甘氨酸類除草劑的抗除草劑植株?，F(xiàn)已成功應(yīng)用于玉米、水稻、油菜等植物中。先正達(dá)公司（Syngenta AG）對來自大腸桿菌的Class Ⅰ EPSPS基因（aroA基因）進行人工修飾，使其編碼的氨基酸序列的第8、68、101和102位點的氨基酸有2～3個被其他氨基酸替換，這種新蛋白對草甘膦具有抗性[27]。美國孟山都公司（Monsanto Company）對抗草甘膦基因epsps進行人工修飾，獲得了抗草甘膦基因mepsps編碼的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶（mEPSPS），能產(chǎn)生芳香族氨基酸，對草甘膦具有耐受性；mepsps基因已成功導(dǎo)入了玉米中[28]。
阿格拉公司（Agragen Inc）對來自擬南芥的乙酰乳酸合酶（acetolactate synthase，ALS）基因進行人工修飾，獲得變異型的A122、P197和W574基因，它們編碼的ALS蛋白序列分別在第122位、197位和574位發(fā)生了改變，其原先的丙氨酸、脯氨酸和色氨酸被其他氨基酸取代。這種新型蛋白與磺酰脲類和咪唑啉酮類除草劑結(jié)合較弱，親和力較低。若直接以基因als本身的啟動子構(gòu)建載體導(dǎo)入植物，在無除草劑壓力的情況下，基因als不能正常表達(dá)；而以35S啟動子和TATA啟動子替代基因als本身的啟動子，構(gòu)建載體獲得的轉(zhuǎn)基因芥藍(lán)（B. oleracea）具有磺酰脲類和咪唑啉酮類除草劑抗性，且在無除草劑壓力的情況下，仍能正常表達(dá)ALS[29]。德國拜耳公司（Bayer CropScience AG）對來自擬南芥和煙草的ALS蛋白基因進行定點突變，使得ALS蛋白基因編碼的氨基酸序列上的第569位的色氨酸被亮氨酸替代，第188位的脯氨酸被絲氨酸替代。將定點突變的als基因?qū)胩鸩酥?，篩選獲得對磺酰脲、咪唑啉酮及嘧啶基（硫代）苯甲酸酯類除草劑有耐性的轉(zhuǎn)基因甜菜[30]。
巴斯夫公司對來自擬南芥的乙酰乳酸合成酶大亞基（ahasl）基因Csr1-2進行點突變，將第653位的絲氨酸殘基改為天冬氨酸（S653N），獲得了具有抗咪唑啉酮類除草劑的基因Csr1-2。改變后的乙酰乳酸合成酶不會與咪唑啉酮結(jié)合，從而保證了植物體內(nèi)正常生理功能。將Csr1-2基因?qū)氪蠖怪?，獲得抗咪唑啉酮類除草劑的轉(zhuǎn)基因大豆[31]。Gioia等從大豆（Glycine max）中克隆獲得1個新基因，命名為gm-hra，對該基因進行人工修飾，編碼的氨基酸合成的ALS具有耐磺酰脲類除草劑的特性。構(gòu)建載體PHP17752-gm-hra并導(dǎo)入大豆中，獲得耐磺酰脲類除草劑的大豆[32]。
先正達(dá)公司（Syngenta AG）對來自玉米的CYP72A1 和nsfl基因，來自水稻的CYP81A6基因進行定點突變，這些人工改造過的P450家族基因編碼的氨基酸所合成的細(xì)胞色素P450對HPPD抑制劑類除草劑有降解作用，將這些修飾后的P450基因?qū)胫参镏泻螅墒怪参矬w過表達(dá)細(xì)胞色素P450，增強對HPPD抑制劑類除草劑的耐性[33]。
通過密碼子改造獲得的抗除草劑基因如下，中國創(chuàng)世紀(jì)種業(yè)有限公司對EPSPS 蛋白MC-EPSPS 和G2-aroA （中國專利03826892.2 ）的氨基酸序列進行同源對比分析，采用蛋白質(zhì)工程和基因工程相結(jié)合的技術(shù)，在MC-EPSPS 蛋白的N 端融合了G2-aroA蛋白N 端的26 個氨基酸殘基，獲得了1個EPSPS突變體融合蛋白（MC2-EPSPS），該蛋白與草甘膦的親和力較低，從而具有草甘膦抗性。通過原核表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植物功能鑒定發(fā)現(xiàn)，MC2-EPSPS的抗草甘膦水平較MC-EPSPS 和G2-aroA 均有顯著提高[34]。 Han等根據(jù)能夠表達(dá)EPSP合酶的G2-aroA（來源于熒光假單胞菌pseudomonas fluorescens G2）基因編碼的氨基酸序列，在保證氨基酸序列不變的前提下，首先采用玉米偏好密碼子，盡量避免使用玉米稀有密碼子，對G2-aroA基因進行人工優(yōu)化改造。在此基礎(chǔ)上，去除DNA序列中造成植物基因轉(zhuǎn)錄不穩(wěn)定的核酸序列，并去除發(fā)夾結(jié)構(gòu)，得到密碼子優(yōu)化型抗草甘膦基因，將其命名為mG2-aroA，此序列與 G2-aroA有84%的同源性，而G+C含量由原來的6483%降低到62.07%。以此構(gòu)建攜帶有mG2-aroA基因的重組表達(dá)載體pS3300-UMG2，并導(dǎo)入玉米中，獲得能夠高表達(dá)G2-aroA 蛋白（屬于EPSPS酶）的轉(zhuǎn)基因玉米，從而使其具有對草甘膦的抗性[35]。endprint
此外，美國孟山都公司（Monsanto Technology LLC）人工合成了1個與來自根癌農(nóng)桿菌CP4（Agrobacterium tumefaciens CP4）的cp4-epsps具有相同功能的基因，命名為trans。該基因表達(dá)的EPSP合酶能夠降低作物對草甘膦的親和力。將其構(gòu)建載體，并成功插入甘藍(lán)型油菜（B. napus）A基因組的N4連鎖群中，獲得了抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因油菜，即MON 88302事件[36]。
1.1.4 通過基因融合獲得的抗除草劑基因 人們將不同的除草劑耐性基因融合到一起，獲得了耐多種除草劑的融合基因（表3）。先正達(dá)公司（Syngenta AG）構(gòu)建雙運載體15954，包括來源于產(chǎn)綠鏈霉菌（Streptomyces viridochromogenes）的pat基因和來自燕麥（Avena sativa）的avhppd-03基因，avhppd-03基因合成的p-HPPD對硝磺草酮有抗性，將該載體成功導(dǎo)入大豆中獲得了對草丁膦和硝磺草酮有抗性的轉(zhuǎn)基因大豆[37]。先正達(dá)公司（Syngenta AG）構(gòu)建雙運載體pDAB9582，將基因Cry1F、Cry1Ac、add-12 和pat重組在一起，即事件pDAB9582.814.19.l ： pDAB4468.04.16.l，成功導(dǎo)入到大豆中，獲得了具有抗蟲、抗除草劑能力的轉(zhuǎn)基因大豆。Cry1F，Cry1Ac基因所表達(dá)的蛋白對鱗翅類昆蟲具有抗性，可選擇性地?fù)p傷它們的中腸黏膜。aad-12基因來自食酸叢毛單胞菌（Delftia acidovorans），該基因表達(dá)的AAD-12可降解2，4-D和吡啶氧乙酸除草劑。pat基因來自產(chǎn)綠鏈霉菌（Streptomyces viridochromogenes），此基因表達(dá)的PAT蛋白，具有抗草丁膦的特性[38]。美國陶氏益農(nóng)公司（Dow AgroScience LLC）構(gòu)建載體pDAB8264，將基因aad-12、2mepsps、pat重組在一起，導(dǎo)入到大豆中，獲得了轉(zhuǎn)基因大豆pDAB8264.42.32，使其對2，4-D、草甘膦和草丁膦有抗性[39]。先正達(dá)公司（Syngenta AG）構(gòu)建雙運載體18857，內(nèi)含gs和pat基因，分別表達(dá)GS和PAT蛋白，這2種蛋白能使作物對草甘膦和草丁膦產(chǎn)生抗性，該載體已被成功導(dǎo)入多種作物中，如玉米、油菜、水稻和小麥等[40]。
1.2 我國申請的抗除草劑基因?qū)＠?/p>
雖然從整體水平看，我國在轉(zhuǎn)基因作物研究技術(shù)方面的進展與國際先進水平有一定差距，其中差距最大的，是在擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的基因方面，這也影響到我國抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物的培育；但我國除了通過從自然界的新生物個體中獲得耐除草劑基因以外，科學(xué)家還利用分子生物學(xué)手段對已有的抗性基因進行改造，例如基因突變、人工誘變、人工改造、密碼子改造、融合基因等方式獲取抗不同除草劑的基因，產(chǎn)生了不少原創(chuàng)性的研究成果。目前我國發(fā)表的抗除草劑基因主要有抗草甘膦、抗草丁膦、抗磺酰脲類、抗咪唑啉酮類4類（表4）。
1.2.1 自然來源的抗除草劑基因 國內(nèi)抗草甘膦基因主要有2類，第一類是5- 烯醇式丙酮酰莽草酸-3- 磷酸（EPSP）合酶基因。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所從草甘膦污染的土壤中分離出的運動發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis）篩選到一種新的EPSP合酶基因（ZM-EPSP合酶基因），并將該基因?qū)胧荏w生物大腸桿菌和煙草中，使所得到的遺傳工程重組生物獲得抗草甘膦的能力[41]。還從采集的草甘膦極端污染環(huán)境的土壤樣品中，采用免培養(yǎng)方法分離出群落水平總DNA，構(gòu)建群落水平總基因文庫，并篩選草甘膦抗性轉(zhuǎn)化子，對高耐受草甘膦的片段的全核苷酸序列測定，發(fā)現(xiàn)了GR 79-EPSP合酶基因，該基因在植物中表達(dá)后，所獲得的轉(zhuǎn)基因植物對草甘膦具有更強的耐受性[42]。該所還從新疆塔克拉瑪干沙漠邊緣的紅柳樹根際土壤中分離出對草甘膦具有抗性的沙漠紅細(xì)菌（Rhodobacter shamoensis）W402菌株[43]。此外，還從土壤細(xì)菌菌株K01中分離出抗草甘膦的K01aroA基因[44]。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所從苘麻（Abutilon theophrasti）中分離到的EPSPS基因序列，該序列所編碼的EPSPS對草甘膦具有較好的抗性，以此基因構(gòu)建載體pGEM-TE，借助根癌農(nóng)桿菌LBA0044介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到煙草中而獲得抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因煙草。該基因可作為功能基因用于抗草甘膦轉(zhuǎn)基因植物的培育[45]。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所從草甘膦重度污染土壤中篩選得到草甘膦抗性微生物假單胞菌（Psedomonas moraxellaceae），通過實驗驗證了它具有高抗草甘膦的能力，將假單胞菌的抗性基因轉(zhuǎn)入植物后，可使植物的抗草甘膦能力提高[46]。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)雜草研究室從麥冬（Ophiopogon japonicus）、土麥冬（Liriope spicata）和闊葉麥冬（Liriope latyphylla）中分離得到了新的抗草甘膦基因LSEPSP，并且對其進行改良得到一系列突變基因，這些基因可以用來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因抗草甘膦植物，也可作為植物細(xì)胞培育中的篩選標(biāo)記[47]。此類基因能夠降低作物對草甘膦的親和力，從而賦予對草甘膦更高的耐受性。上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院從葡萄（Vitis vinifera）冠癭病拮抗菌中篩選獲得了一株能在草甘膦中生長的水生拉恩氏菌（Rahnella aquatilis），從該細(xì)菌中分離獲得了抗草甘膦的 aroA-Ra基因[48]。從極端嗜熱菌海棲熱袍菌（Thermotoga martima）中分離出aroA-Tm基因，此基因表達(dá)的蛋白對草甘膦具有較高的耐受性[49]。東北農(nóng)業(yè)大學(xué)從黃曲霉和假絲酵母菌（Candida palmioleophila）中分離出 EPSP 合酶基因，此基因表達(dá)的EPSP合酶對草甘膦也具有抗性[50-51]。
劉柱等從被草甘膦極度污染的土壤中分離到一株極端抗草甘膦菌可變鹽單胞菌（Halomonas variabilis），該細(xì)菌的aroA基因核苷酸序列與目前已報道的編碼EPSP合酶的aroA基因幾乎沒有任何同源性，氨基酸序列與草甘膦抗性相關(guān)的美國專利所涉及的22種微生物EPSP合酶的同源性在46%以下；因此所克隆的是1個結(jié)構(gòu)新穎、功能明確并高抗草甘膦的新基因，但未申請專利[52]。中國農(nóng)科院生物技術(shù)研究所申請了抗草甘膦轉(zhuǎn)基因陸地棉BG2-7的檢測方法及側(cè)翼序列，所轉(zhuǎn)基因是擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的aroA基因[53]；還申請了一種抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆及其制備方法和應(yīng)用的專利，所轉(zhuǎn)基因也是擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的aroA基因以及草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶gat基因[54]。endprint
南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院從大腸桿菌克隆到抗草甘膦的基因argF和deoA，基因可作為目的基因?qū)胫参?，以提高轉(zhuǎn)基因植物抗草甘膦的能力。這2個基因?qū)共莞熟⒖赡芘c靶基因關(guān)系不大，其對靶基因的影響可能是間接的[55]。南通龍翔生物技術(shù)有限公司從土壤細(xì)菌中克隆到1個抗草甘膦的EPSP合酶基因，但未進行深入研究。
第二類是草甘膦降解酶基因。中山大學(xué)從苜蓿根瘤菌（Rhizobium meliloti M010）中分離出草甘膦降解酶基因（GLD），此基因可以表達(dá)C—P裂解酶，使草甘膦的C—P鍵斷裂，從而賦予對草甘膦的耐受性[56]。
1.2.2 人工誘變獲得的抗除草劑基因 除了抗草甘膦基因外，還采用人工誘變的方法獲得了抗咪唑啉酮類和磺酰脲類除草劑的基因5個，并獲得了抗性油菜和水稻。江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院篩選到了自然突變的抗咪唑啉酮類除草劑的甘藍(lán)型油菜，把突變基因的核酸序列命名為BnALS1R基因，應(yīng)用雜交、回交等植物常規(guī)育種方法將該基因?qū)肫渌麑溥蜻惓輨o抗性的油菜品種或品系，提高了目標(biāo)品種或品系對咪唑啉酮類除草劑的耐受性[57]。還以甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑突變體為材料，獲得突變體中的抗性基因，命名為 BnALS3R基因，利用構(gòu)建的植物表達(dá)載體將該基因?qū)雽酋ｋ孱惓輨o抗性的植物中，可提高轉(zhuǎn)基因植物對磺酰脲類除草劑的抗性[58]。深圳興旺生物種業(yè)有限公司利用甲磺酸乙酯（EMS）誘變水稻品種黃華占和黃絲占，篩選獲得抗咪唑啉酮類除草劑的黃絲占和黃華占突變植株。在存在咪唑啉酮類除草劑的情況下，這些突變體的乙酰乳酸合成酶（ALS）基本都保持了原有酶活性，表明突變ALS酶具有抗咪唑啉酮類除草劑的特性。核酸和蛋白序列分析結(jié)果顯示，als基因發(fā)生點突變，其編碼的ALS蛋白帶有Trp548、Ala96或Ser627突變[59]。江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院對秈稻優(yōu)良恢復(fù)系9311的EMS突變植株進行長期、不斷的篩選，發(fā)現(xiàn)了1個Gln25 、Gln113和ALa237位點發(fā)生突變的蛋白，還發(fā)現(xiàn)了1個在Gln25 、Gln113、 His367 和Ser627位點的突變，使水稻具有ALS抑制劑類除草劑的抗（耐）性，特別是對咪唑啉酮類和磺酰脲類除草劑的抗（耐）性[60]。
1.2.3 基因突變獲得的抗除草劑基因 人們通過對原有的抗除草劑基因進行人工改造、融合獲得的抗除草劑基因（表5）如下：中山大學(xué)采用基因優(yōu)化的方法獲得了多點突變的、具有較強草甘膦抗性的EPSP合成酶基因，提高了EPSP合酶的催化效率，降低了酶與草甘膦的親和力，使該酶抵御草甘膦的能力大幅度提高。其中aroAM12是其所編碼的具有草甘膦抗性的EPSP合成酶與鼠傷寒沙門氏桿菌aroA所編碼的氨基酸序列發(fā)生了7個位置的置換；aroAM13是其所編碼的具有草甘膦抗性的EPSP合成酶與大腸桿菌aroA所編碼的氨基酸序列發(fā)生了2個位置的置換[61]。2個突變基因都有望成為構(gòu)建抗草甘膦農(nóng)作物新品種的優(yōu)良材料。
中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所構(gòu)建含有水稻EPSP合酶基因的大腸桿菌組成型表達(dá)載體，并利用易錯PCR技術(shù)對大腸桿菌表達(dá)載體中的EPSP合酶進行隨機突變，再將含有EPSP合酶突變基因的大腸桿菌表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌，獲得EPSP合酶基因突變庫，篩選后獲得抗草甘膦的重組子，測序得到水稻EPSP合酶基因突變體，該突變體的EPSP合酶基因?qū)Σ莞熟⒕哂懈叨瓤剐訹62]。
杭州瑞豐生物科技有限公司從放線桿菌（Deinococcus radiodurans）R1 中分離出了Dein R1 EPSP合酶（該EPSP合酶既不屬于Class I，也不屬于Class Ⅱ，其抗性機理尚不明確）基因，編碼基因命名為G7，該基因?qū)Σ莞熟⒕哂休^高的抗性[63]。接著人工改造抗性基因G1174，獲得了高抗草甘膦的EPSP合酶基因G10[64]。該基因可用于轉(zhuǎn)基因水稻、玉米、棉花、大麥、大豆、草坪或牧草的開發(fā)。
上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院采用分子重排技術(shù)獲得了草甘膦抗性增強的來源于蘋果和葡萄的EPSP合酶多位點突變體及其編碼基因。這些突變體具有較高的草甘膦抗性和較強的與磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）親和性，這為該基因用于抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物的培育提供了可能[65-66]。
1.2.4 密碼子改造獲得的抗除草劑基因 劉堅根據(jù)變異的抗草甘膦基因2mG2-epsps編碼的氨基酸組成，利用玉米密碼子偏好性進行設(shè)計、改造后用人工合成的方法獲得了抗草甘膦基因MTP-SMG2-EPSPS。改造后人工合成的EPSP合酶基因經(jīng)鑒定在玉米中能高效表達(dá)，獲得的抗草甘膦玉米與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾染哂忻黠@的抗草甘膦的能力[67]。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所利用小麥密碼子偏好性對從極端土壤中抗性細(xì)菌中分離的GR 79-EPSPS進行人工設(shè)計，并在N段添加來自小麥RubisCO小亞基的葉綠體導(dǎo)肽，通過人工合成法獲得了改造的基因wCTP ∶ GR 79m，并將其應(yīng)用于小麥轉(zhuǎn)化時作為篩選標(biāo)記基因，獲得了抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因小麥，該轉(zhuǎn)基因小麥的抗性高于優(yōu)化前小麥的轉(zhuǎn)基因抗性[68]。
中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所對來源于土壤微生物總DNA的草甘膦抗性基因GR79和gat，按照棉花宿主偏愛密碼子表對2個基因進行核苷酸水平上的編輯，通過生物信息學(xué)工具進一步對編輯后的序列進行加工，目的是調(diào)整基因總體GC水平，優(yōu)化限制性酶切位點，去除可能抑制性負(fù)調(diào)控元件及優(yōu)化mRNA結(jié)構(gòu)提高mRNA穩(wěn)定性等。將優(yōu)化后的2個抗草甘膦基因構(gòu)建到雙價表達(dá)載體上進行同時表達(dá)，所得轉(zhuǎn)基因棉花施用草甘膦后與未進行草甘膦處理對照植株生長狀況差異不明顯，以上結(jié)果證明獲得的雙價抗草甘膦轉(zhuǎn)基因棉花具有較強的草甘膦抗性。本發(fā)明對于培育具有自主知識產(chǎn)權(quán)的高抗草甘膦棉花具有非常重要的意義[69]。
北京大北農(nóng)科技集團股份有限公司培育了同時抗草甘膦和草丁膦的轉(zhuǎn)基因玉米事件DBN9877，抗草甘膦基因是 5-烯醇丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶基因（EPSPS）是從土壤農(nóng)桿菌菌株中分離得到的，且可以通過優(yōu)化密碼子或者以其他方式改變編碼的多核苷酸；抗草丁膦基因（pat）是編碼膦絲菌素N-乙?；D(zhuǎn)移酶（PAT）的基因[70]。endprint
1.2.5 通過基因融合獲得的抗除草劑基因 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)根據(jù)CP4-EPSPS不同區(qū)域的活性分析及玉米基因組特點，對CP4-EPSPS的密碼子及編碼框進行了改造，改造后的核苷酸序列與原始的EPSPS同源性僅為88%。同時在優(yōu)化后的 EPSPS 基因5′ 端增加了1個來源于高粱的葉綠體轉(zhuǎn)運肽，將該重組基因命名為CC-M EPSPS。通過對轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因及CC-M EPSPS基因的玉米不同轉(zhuǎn)化事件的分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)CC-M EPSPS基因更容易獲得高表達(dá)的轉(zhuǎn)化事件[71]。把該基因轉(zhuǎn)入玉米中，獲得了有自主知識產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)基因抗草甘膦玉米CC-2。又克隆了高粱基因的葉綠體信號肽，將其與優(yōu)化的epsps基因連接，命名為maroACC，通過基因槍共轉(zhuǎn)化的方法把該基因轉(zhuǎn)入到具有高轉(zhuǎn)化效率的玉米自交系及雜交組合中，用草甘膦進行篩選，獲得了1個玉米優(yōu)良轉(zhuǎn)化體[72]。
創(chuàng)世紀(jì)種業(yè)有限公司從陸地棉冀棉14中克隆抗草甘膦EPSPS基因，并進行人工改造，獲得了融合的抗草甘膦mc2-epsps基因[73]；接著構(gòu)建了含2個拷貝該基因的抗性表達(dá)環(huán)形載體，導(dǎo)入該植物表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因棉花具有非常強的草甘膦抗性[74]。
北京市農(nóng)林科學(xué)院將編碼玉米葉綠體信號肽的rbcs基因與GenBank：GM718572.1的epsps基因融合，獲得了融合序列的優(yōu)化基因G23V-EPSPS，將該基因轉(zhuǎn)入玉米中獲得了具有高抗草甘膦特性的玉米品種[75]。
浙江大學(xué)人工合成了一種抗草甘膦融合蛋白編碼基因，該基因由EPSPS蛋白編碼基因和草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶或草甘膦氧化酶編碼基因構(gòu)成，EPSPS蛋白編碼基因為下列之一：CP4、aroA、G7或G10，所述草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因為gat，所述草甘膦氧化酶編碼基因為gox。該抗草甘膦蛋白可以通過不同的耐受機制賦予轉(zhuǎn)基因植物對草甘膦的高抗特性。該抗草甘膦融合蛋白可以應(yīng)用于單子葉植物和雙子葉植物的抗草甘膦方面，主要應(yīng)用于玉米、水稻、大豆、小麥和油菜[76]。還人工合成了草甘膦和草丁膦復(fù)合抗性的融合蛋白基因，抗草甘膦編碼基因為CP4、aroA、G7、G10、GOX或gat，抗草丁膦編碼基因為bar或pat，對2種除草劑都有抗性，可用于制備具有草甘膦與草丁膦復(fù)合抗性的轉(zhuǎn)基因植物[77]。
福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院構(gòu)建了可在水稻的生長發(fā)育期全程表達(dá)草甘膦抗性的載體，并且在幼穗分化期花器官組織特異性地增強表達(dá)。該載體由雙表達(dá)盒組成，其中1個表達(dá)盒由水稻幼穗分化期特異表達(dá)基因啟動子、水稻葉綠體轉(zhuǎn)運膚、抗草甘膦基因（抗草甘膦基因來源于水稻epsps的突變基因epspsM）和終止子組成；另一個表達(dá)盒由組成型啟動子、葉綠體轉(zhuǎn)運體、抗草甘膦基因以及終止子組成。利用該載體獲得的轉(zhuǎn)基因水稻，其在生長發(fā)育的所有組織器官對草甘膦有較高抗性外，還在水稻幼穗分化期提高花器官組織對草甘膦的抗性，解除草甘膦對水稻花器官的損害，保證水稻的產(chǎn)量[78]。
2 國內(nèi)外抗除草劑基因?qū)＠牟罹?/p>
通過對比國內(nèi)外抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物方面的專利，發(fā)現(xiàn)中國與國際間還是存在很大的差距的。
2.1 抗除草劑基因國際專利分析
在52項國際專利中，屬于自然來源的專利有42項，屬于人工改造的有6項，屬于融合基因的有4項。
根據(jù)抗除草劑基因的性能，可將這52項國際專利分為抗1種除草劑（簡稱單抗）和抗2種以上除草劑（簡稱多抗）2類，且單抗占82.7%，多抗占17.3%。這52項專利中的基因主要對草甘膦、草丁膦、磺酰脲類、溴苯腈、2，4-D、麥草畏、咪唑啉酮類、苯并呋喃類、吡啶甲酸酯類、原卟啉原氧化酶（PPO）抑制劑類、羥苯基丙酮酸加雙氧酶（HPPD）抑制劑類、芳氧苯氧基丙酸酯類（包括喹禾靈）和環(huán)己烯酮類共13個種類的除草劑有抗性。
在單抗的除草劑基因?qū)＠?，共?1種抗除草劑基因，且都屬于自然來源的抗除草劑基因，其中有18種來自細(xì)菌，13種來自植物，只有1種是人工改造獲得的抗性基因。
在9項多抗的除草劑基因?qū)＠?，共?種抗除草劑基因，這9種基因中有5種來自細(xì)菌，3種來自植物，1種通過人工改造獲得。從藍(lán)色鏈霉菌（A3）中獲得的DSM-2基因?qū)Σ莞熟ⅰ⒉荻§ⅰ?，4-D這3種除草劑有抗性，而且具有抗蟲的特性；從鞘氨醇單胞菌中克隆的aad-1基因具有降解2，4-D和芳氧苯氧丙酸酯（如喹禾靈）類除草劑的特性；分別從食酸叢毛單胞菌和鞘氨醇單胞菌中克隆的aad-12和aad-13基因具有抗 2，4-D和吡啶氧乙酸除草劑的特性；從植物中篩選克隆得到的PtJBMT3基因?qū)?，4-D和生長素類除草劑有耐性；編碼ALS的基因?qū)酋ｋ?、咪唑啉酮類除草劑有抗性；從小麥中克隆得到的編碼ACCase的基因?qū)Ψ佳醣窖醣狨ヮ悺h(huán)己烯酮類除草劑有抗性；從燕麥中獲得的avhppd-03基因?qū)Σ荻§ⅰ愡虿萃拖趸遣萃@3種除草劑有抗性。以及通過改造擬南芥中的als突變基因獲得的A122、P197和W574，對磺酰脲類和咪唑啉酮類除草劑有抗性。
2.2 抗除草劑基因國內(nèi)專利分析
在我國，共有48項抗除草劑基因的專利，屬于自然來源的專利有28項，屬于人工改造的專利有20項。根據(jù)抗除草劑基因的性能，可將這48項專利分為單抗和多抗2類，且單抗占91.7%，多抗占8.3%。這48項專利中的基因主要對草甘膦、草丁膦、咪唑啉酮類、磺酰脲類4種除草劑有抗性。
在單抗的除草劑基因?qū)＠校灿?9種抗除草劑基因，這19種基因有14種來自細(xì)菌，5種來自植物。且這19種基因中有14種是屬于自然來源的抗除草劑基因，5種是人工改造獲得的抗性基因。
在多抗的除草劑基因?qū)＠?，共?種抗除草劑基因，這2種基因均來自植物，且均屬于自然來源的抗除草劑基因，分別是抗多種除草劑的細(xì)胞色素P450，以及抗咪唑啉酮類和磺酰脲類除草劑的突變型基因als。endprint
3 我國抗除草劑基因的研發(fā)策略
3.1 重點開發(fā)植物來源的抗性基因
從我國抗草甘膦基因來看，19項專利是從微生物中克隆的抗草甘膦基因，2項專利是從植物中克隆的抗性基因。相對于細(xì)菌等來源的抗草甘膦基因，植物來源的進化抗性或天然抗性基因在培育抗草甘膦作物后的生態(tài)環(huán)境和食品安全風(fēng)險要低于其他生物類別的異源基因，提高民眾心理的認(rèn)可。因此今后應(yīng)該主要發(fā)展植物源的抗草甘膦基因以及其他除草劑的抗性基因。
3.2 加大滅生性除草劑草丁膦抗性基因的研發(fā)
在我國有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗除草劑基因中，尚無滅生性除草劑草丁膦的抗性基因。草丁膦和草甘膦相比，同樣屬于優(yōu)秀的滅生性除草劑，毒性低，在土壤中易于降解，對作物安全，不易飄移，活性高，用量少，環(huán)境壓力小，殺草迅速，能快速殺死多種禾本科和闊葉雜草，因此應(yīng)加大抗草丁膦基因的發(fā)掘。
3.3 加強除草劑解毒基因的發(fā)掘
細(xì)胞色素 P450s 能通過羥基化或脫烷來代謝乙酰輔酶 A羧化酶（ACCase）、乙酰乳酸合成酶（ALS）和光系統(tǒng) Ⅱ （PSⅡ）抑制劑類除草劑，達(dá)到解細(xì)胞毒性的目的。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GSTs） 也被證明參與了除草劑的解毒代謝過程。目前，對細(xì)胞色素 P450s 和 GSTs解除草劑毒性的分子機制仍然知之甚少。不過，越來越多的研究表明在自然界中任何抗性機制都是可能發(fā)生的。事實上，非靶點抗性機制更為普遍，且容易產(chǎn)生更高的抗性水平； 因此應(yīng)該加強除草劑解毒基因的發(fā)掘。目前只有1個專利是關(guān)于細(xì)胞色素P450的解毒基因。
3.4 加大人工誘變獲得的抗性基因的研究和抗性作物培育
抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物的選育首先是作為一種雜草防除對策而提出的；但抗性基因的流向和由此引發(fā)的食品安全性問題始終存在著巨大的爭議，甚至在一定程度上阻礙了轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展。而常規(guī)育種手段雖不能像轉(zhuǎn)基因技術(shù)一樣將物種之間的基因資源利用得十分充分，但卻以其自身沒有外源基因轉(zhuǎn)入而更容易被接受和推廣。目前，通過非轉(zhuǎn)基因手段培育的抗除草劑作物涉及玉米、大豆、菜豆、煙草等。所抗除草劑包括咪唑啉酮類、磺酰脲類、環(huán)己烯酮類、有機磷類、均三氮苯類和激素類等大類，其中最為突出的是抗咪唑啉酮類類除草劑的系列作物。因此利用CRISPR9等現(xiàn)代生物技術(shù)進行原位修飾改造作物基因，培育非轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物新品種更具有發(fā)展前景。
3.5 合理開發(fā)抗性基因的疊加性狀
隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，在培育新品種方面將發(fā)揮主要作用，為了改良品種的多種性狀將多目標(biāo)基因轉(zhuǎn)移到一個品種中將越來越普遍。美國已經(jīng)有能抗2種除草劑（抗草甘膦和草丁膦）并抗蟲的玉米品種的商業(yè)化種植。
隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，多抗及復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因作物的研發(fā)日益受到人們的重視，通過ISAAA的數(shù)據(jù)可以看出，目前國外已經(jīng)開發(fā)出大量的多抗及復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因作物。單一抗除草劑的作物在長期使用所抗除草劑后，田間雜草產(chǎn)生抗藥性的概率將大大增加，那么該抗除草劑作物也將失去應(yīng)用的效果。與抗單一除草劑的轉(zhuǎn)基因作物相比，具有雙抗甚至多抗除草劑以及復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因作物以輪換除草劑的使用，避免抗性雜草的產(chǎn)生。因此建議培育抗2種以上除草劑的作物，加強多抗基因的挖掘，另外還建議培育抗除草劑和抗蟲的具有復(fù)合性狀的作物，提高轉(zhuǎn)基因作物的經(jīng)濟價值和生態(tài)效益。
參考文獻：
[1]James C. Global status of Commercialized biotech/GM crops：2004—2016[R]. ISAAA in Brief-ISAAA.org，2014—2016.
[2]Qiang S，Song X L，Dai W M. Opportunities and challenges for herbicide-resistant crops and their development strategies[J]. Journal of Agricultural Biotechnology，2010，18 （1）： 114-125.
[3]Duke S O. Perspectives on transgenic，herbicide-resistant crops in the United States almost 20 years after introduction[J]. Pest Management Science，2015，71（5）：652-657.
[4]Vila-Aiub M M，Balbi M C，Gundel P E，et al. Evolution of glyphosate-resistant johnsongrass （Sorghum halepense） in glyphosate-resistant soybean[J].Weed Science，2007，55（6）：566-571.
[5]Comai L. 5-Enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase resistant à linhibition， production et utilisation：EP 0115673 A2[P]. 1984-08-15.
[6]Barry G F，Kishore G M，Padgette S R，et al. Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases： US05633435[P]. 1997-05-27.
[7]Denny R B. Method and syetem for creating astronomical observing plants for automated observatories：US20060224324A1[P]. 2006-10-05.endprint
[8]Dick，Elaine Q，John R，et al. Glyphosate degrading bacteria：WO/1992/019719[P]. 1992-11-12.
[9]Barry G F. Phosphonate metabolizing plants：WO/1999/027152[P]. 2000-05-25.
[10]Castle L A，Dan S，Giver L，et al. Novel glyphosate-N-acetyltransferase（GAT） genes：WO/2003/092360[P]. 2003-11-13.
[11]Balthazor，Terry M. Process for the preparation of a glyphosate product：US04654429[P]. 1987-03-31.
[12]Takase，Masayuki，Yoshida，et al. Herbicidal composition：EP86117038.9[P]. 1987-08-19.
[13]Lira J M，Wright T R，Hey T D，et al. Constructs for expressing herbicide tolerance genes，related plants，and related trait combinations：WO/2009/152359[P]. 2009-12-17.
[14]Gocal G F W，Beetham P R，de Schopke A，et al. Mutated protoporphyrinogenix oxidase（PPX） genes：US20120122223A1[P]. 2012-05-17.
[15]Gocal G F W，Beetham P R，De Schopke A，et al. Mutated protoporphyrinogenix oxidase（PPX） genes：EP2600710[P]. 2013-06-12.
[16]Chen F，Zhao A，Gregory. Novel herbicide resistance gene：US20130109075A1[P]. 2013-05-02.
[17]Lira J M，Snodderley E，Robinson A E，et al. Uses and detection of herbicide resistance genes for resistance to aryloxyalkanoate herbicides：US09062284B2[P]. 2015-06-23.
[18]Wright T，Lira J M，Walsh T A，et al. Novel herbicide resistance genes：EP2484767A1[P]. 2012-08-08.
[19]Albert H，Bermudez E R，Castle L A，et al. Compositions and methods comprising sequences having hydroxyphenylpyruvate dioxygenase （HPPD） activity：US09187761B2[P]. 2015-11-17.
[20]Albert H，Bermudez E R，Castle L A，et al. Compositions and methods comprising sequences having hydroxyphenylpyruvate dioxygenase （HPPD） activity：US09187761B2[P]. 2015-11-17.
[21]Clemente T E，Dumitru R，F(xiàn)eng P C C，et al. Modified DMO enzyme and methods of its use：US07884261B2[P]. 2011-02-08.
[22]Walsh T A，Hicks G，Honma M，et al. Resistance to auxinic herbicides：US8071847[P]. 2011.
[23]Shen Z C，Lin Z Y. Herbicide resistant gene and use thereof： WO/2012/068966[P]. 2012-05-31.
[24]Haley S，Ostlie M，Valdez V A，et al. Acetyl co-enzyme a carboxylase herbicide resistant plants：WO/2012/106321[P]. 2012-08-09.
[25]Hinga M，Griffin S，Moon M S，et al. Methods and compositions to produce rice resistant to accase inhibitors：WO/2013/016210[P]. 2013-01-31.
[26]Hain R，Johann G，Donn G. USe of als inhibitor herbicides for control of unwanted vegetation in ALS inhibitor herbicide tolerant beta vulgaris plants：WO/2012/049266[P]. 2012-04-19.endprint
[27]Alibhai M F，Cajacob C，F(xiàn)eng P C C，et al. Glyphosate resistant class I 5-endolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase （EPSPS）：US20100197498A1[P]. 2010-08-05.
[28]Hoffman T，Parkhurst D M，Zhou N，et al. Stacked herbicide tolerance event 8264.42.32.1，related transgenic soybean lines，and detection thereof：WO/2013/010094[P]. 2013-01-17.
[29]Kaijalainen S，Koivu K，Kuvshinov V，et al. Herbicide resistant camelina sativa：WO/2010/147636[P]. 2010-12-23.
[30]Kinney A J，Stecca K L，Meyer K. Soybean event DP-305423-1 and compositions and methods for the identification and/or detection thereof：US08609935B2[P]. 2013-12-17.
[31]Sathasivan K， Murai N. Mutant acetolactate synthase gene from Arabidopsis thaliana for conferring imidazolinone resistance to crop plants：US06225105[P]. 2001-05-01.
[32]Gioia P. Herbicidal composition comprising and aminophosphate or aminophosphonate salt and a betaine：US20080103047A1[P]. 2008-05-01.
[33]Gocal G F W，Knuth M E，Beetham P R. EPSPS mutants：US08268622B2[P]. 2012-09-18.
[34]Cui H，Liang Y，et al. Tonoplast sodium-hydrogen anti-protein nhx2 of thellungiella halophila and coding gene and use thereof：WO/2014/172825[P].2014-10-30.
[35]Han G，Jiang F，Deng D，et al. Synthetic glyphosate-resistant gene and use thereof： WO/2013/152624A1[P]. 2013-10-17.
[36]Brown A J，Byrne J F，Cole R H，et al. Transgenic Brassica event MON 88302 and methods of use thereof：US8816156[P]. 2014.
[37]Hipskind J，Burgin K，Jain R，et al. Soybean event syht0h2 and compositions and methods for detection thereof：US20140201860A1[P]. 2014.
[38]Cui Y C，Hoffman T，Parkhurst D M，et al. Insect resistant and herbicide tolerant breeding stack of soybean event PDAB9582.814.19.1 and PDAB4468.04.16.1：EP2736322A1[P]. 2014-06-04.
[39]Cui Y，Hoffman T，Zhou N，et al. Stacked herbicide tolerance event 8264.44.06.1，related transgenic soybean lines，and detection thereof：US09540655B2[P]. 2017-01-10.
[40]Unkefer P J，Knight T J，Anderson P S. Transgenic plants with enhanced growth characteristics：EP2334166A2[P]. 2011-06-22.
[41]Chen M，Lin M，Dun B Q，et al. EPSP synthase gene for Zymomonasmobilis glyphosate and application therefor： CN 2005.
[42]林 敏，劉 柱. 可變鹽單胞菌高抗草苷膦的EPSP合酶及其編碼序列：CN1664095[P]. 2005-09-07.
[43]張 維，王 琳，吳 港，等. 耐輻射沙漠紅細(xì)菌及其應(yīng)用：CN103911318A[P]. 2014-07-09.
[44]陸 偉，燕永亮，戰(zhàn)崳華，等. 一種高耐受草甘膦的EPSP合酶及其應(yīng)用：CN105543188A[P]. 2016-05-04.
[45]程海剛. 抗草甘膦基因（EPSPS）的克隆與功能驗證[D]. 烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.endprint
[46]王國英，曹高燚，劉允軍. 一種高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼基因和應(yīng)用：CN103484438A[P]. 2014-01-01.
[47]強 勝，毛嬋娟，陳世國，等. 一種具有草甘膦耐性的基因及其應(yīng)用：CN103436547A[P]. 2013-12-11.
[48]彭日荷，姚泉洪，熊愛生，等. 水生拉恩氏菌的EPSP合酶基因AroA-Ra多位點突變體：CN102559708A[P]. 2012-07-11.
[49]王麗娟，姚泉洪，彭日荷. 源于海棲熱袍菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因及其應(yīng)用：CN105087611A[P]. 2015-11-25.
[50]陶 波，金龍國，于海濤，等. 一種源自黃曲霉的抗草甘膦相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用：CN105586324A[P]. 2016-05-18.
[51]陶 波，邱麗娟，邵百惠，等. 一種源自假絲酵母的抗草甘膦相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用：CN105505895A[P]. 2016-04-20.
[52]劉 柱. 可變鹽單胞菌中草甘膦抗性EPSP合酶新基因克隆、大腸桿菌表達(dá)及其抗性機制的研究[D]. 成都：四川大學(xué)，2004.
[53]王志興，王旭靜，唐巧玲，等. 耐草甘膦轉(zhuǎn)基因陸地棉BG2-7的檢測方法及側(cè)翼序列：CN106191218A[P]. 2016-12-07.
[54]邱麗娟，郭兵福，郭 勇，等. 一種抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆及其制備方法與應(yīng)用：CN105505981A[P]. 2016-04-20.
[55]趙團結(jié)，費云燕，蓋鈞鎰. 腸桿菌耐草甘膦基因argF、編碼蛋白及其應(yīng)用：CN105177029A[P]. 2015-12-23.
[56]徐培林，步懷宇，何 鳴，等. 草甘膦降解酶基因和含該基因的載體：CN1392261[P]. 2003-01-22.
[57]胡茂龍，浦惠明，戚存扣 等. 抗咪唑啉酮類除草劑的甘藍(lán)型油菜突變基因及其應(yīng)用：CN101935667A[P]. 2011-01-05.
[58]胡茂龍，浦惠明，龍衛(wèi)華 等. 一種甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因及其應(yīng)用：CN103266118A[P]. 2013-08-28.
[59]陳竹鋒，王承旭，柳 威，等.水稻抗除草劑蛋白及其在植物育種中的應(yīng)用：CN102586215A[P]. 2012-07-18.
[60]張保龍，陳天子，凌溪鐵，等. 一種ALS突變型基因及其在抗除草劑方面的應(yīng)用：CN105779479A[P]. 2016-07-20.
[61]Xu P L，Bu H Y，He M，et al. Glyphosate degrading enzyme gene and carrier containing said gene： 1392261[P]. 2003-01-22.
[62]朱 禎，周 敏. 一種水稻EPSP合酶突變體及其編碼基因、獲得方法與應(yīng)用：CN1810962[P]. 2006-08-02.
[63]Shen Z C. Glyphosate-resistant gene and application thereof： CN101619318A[P]. 2010-11-15.
[64]沈志成，林朝陽，徐曉麗，等. 高抗草甘膦突變基因及其改良方法和應(yīng)用：CN102146371A[P]. 2011-08-10.
[65]田永生，許 晶，姚泉洪，等. 來源于蘋果的EPSP合酶多位點突變體及其編碼基因與應(yīng)用：CN103205404A[P]. 2013-07-17.
[66]田永生，許 晶，姚泉洪，等. 草甘膦抗性提高的葡萄EPSPS突變體的制備及其應(yīng)用：CN104232600A[P]. 2014-12-24.
[67]劉 堅. 抗草甘膦基因MTP-SMG2-EPSPS及其在培育抗草甘膦玉米中的應(yīng)用：CN103409445A[P]. 2013-11-27.
[68]夏蘭琴，王根平，林敏，等. 抗草甘膦基因、專用表達(dá)載體及其在獲得抗草甘膦轉(zhuǎn)基因小麥中的應(yīng)用：CN104004777A[P]. 2014-08-27.
[69]郭三堆，孫 豹，張 銳，等. 一種含有草甘膦抗性基因的表達(dá)載體及其應(yīng)用：CN103981199A[P]. 2014-08-13.
[70]康越景，郭明欣，劉海利，等. 用于檢測除草劑耐受性玉米植物DBN9877的核酸序列及其檢測方法：CN104878090A[P]. 2015-09-02.
[71]賴錦盛，趙海銘，宋偉彬. 一種高粱抗草甘膦5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）及其應(yīng)用：CN102911950A[P]. 2013-02-06.
[72]賴錦盛，趙海銘，宋偉彬，等. 轉(zhuǎn)maroACC基因抗除草劑玉米 CC-2的側(cè)翼序列及其應(yīng)用：CN105331725A[P]. 2016-02-17.
[73]Cui H，He Y，Wang J，et al. Cotton plant event a2-6 and primer and method for use in detection thereof： WO/2013/170399[P]. 2013-11-21.
[74]王建勝，崔洪志，何云蔚. 抗草甘膦棉花事件以及用于其檢測的引物和方法：CN106244587A[P]. 2016-12-21.
[75]張曉東，江 穎，張立全，等. 抗草甘膦篩選標(biāo)記基因及其在玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的應(yīng)用：CN105886521A[P]. 2016-08-24.
[76]Shen Z C，Lin C Y，et al. High resistance to glyphosate mutant gene and its improved method and application：WO/2012/097720[P]. 2012-07-26.
[77]張先文，王東芳，沈志成. 一種具有草甘膦和草丁膦復(fù)合抗性的融合基因、編碼蛋白及其應(yīng)用：CN106318958A[P]. 2017-01-11.
[78]蘇 軍，王 鋒，胡太蛟，等. 一種雙表達(dá)盒高抗草甘膦載體及其在水稻上的應(yīng)用：CN105861541A[P]. 2016-08-17.endprint
猜你喜歡
封閉式除草劑什么時間噴最合適今日農(nóng)業(yè)(2019年15期)2019-01-03 12:11:33 如何正確選擇使用農(nóng)藥及除草劑現(xiàn)代園藝(2017年19期)2018-01-19 02:50:21 體育旅游產(chǎn)業(yè)的特征及發(fā)展策略探討商(2016年27期)2016-10-17 07:16:17 在線視頻用戶付費的商業(yè)模式研究今傳媒(2016年9期)2016-10-15 22:52:08 形成合作意識，促進學(xué)生體育競技能力發(fā)展考試周刊(2016年79期)2016-10-13 22:45:40 淺談我國電視真人秀節(jié)目存在的問題及發(fā)展策略新聞世界(2016年10期)2016-10-11 20:09:12 專利申請審批流程圖河南科技(2016年8期)2016-09-03 08:08:22 專利申請三步曲發(fā)明與創(chuàng)新(2016年5期)2016-08-21 13:42:50 玉米田除草劑的那些事營銷界(2015年23期)2015-02-28 22:06:18 加拿大：擬修訂除草劑Pyroxasulfone的最大殘留限量中國質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)報(2013年8期)2013-03-11 19:54:07
張玉池+王曉蕾+徐文蓉+劉琪+相世剛+戴偉民+強勝+宋小玲
摘要：抗除草劑基因是培育抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物的基礎(chǔ)。自1983年第1例抗草甘膦基因報道以來，到目前已經(jīng)從微生物和植物中發(fā)掘出大量的抗性基因，并采用人工改造和基因融合的方法獲得了新的抗性基因。本文歸納總結(jié)了國內(nèi)外抗除草劑基因的專利，目的是為我國抗除草劑基因的發(fā)掘提供參考。經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，國際上抗除草劑基因?qū)＠?2項，發(fā)掘的基因?qū)Σ莞熟?、草丁膦、磺酰脲類、溴苯腈?，4-D、麥草畏、咪唑啉酮類、苯并呋喃類、吡啶甲酸酯類、原卟啉原氧化酶（PPO）抑制劑類、羥苯基丙酮酸加雙氧酶（HPPD）抑制劑類、芳氧苯氧丙酸酯類（包括喹禾靈）和環(huán)己烯酮類13個種類除草劑有抗性。我國有48項專利，發(fā)掘的基因?qū)Σ莞熟ⅰ⒉荻§?、咪唑啉酮類、磺酰脲?個種類除草劑有抗性，且40項屬于抗草甘膦基因。我國雖在專利數(shù)量上與國外相差不大，但在種類上遠(yuǎn)不及國外。因此，在我國抗除草劑基因的研究與開發(fā)方面面臨著挑戰(zhàn)。
關(guān)鍵詞：抗除草劑基因；專利申請；除草劑；國內(nèi)外差距；發(fā)展策略
中圖分類號：S451；D913.4 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1003-935X（2017）02-001-22
Analysis on the Patents of Herbicide Resistance Gene at Home and Abroad
ZHANG Yu-chi，WANG Xiao-lei，XU Wen-rong，LIU Qi，XIANG Shi-gang，DAI Wei-min，QIANG Sheng，SONG Xiao-ling
（Weed Research Laboratory，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）
Abstract：Herbicide resistance genes are the basis for breeding herbicide-resistant transgenic crops. Since the first case of glyphosate-resistance gene was reported in 1983，a large number of resistance genes have been isolated from microbes and plants，and new resistance genes have been obtained by means of artificial modification and gene fusion. In order to provide information for developing herbicide-resistant genesdomestically，it summarized the patent of herbicide-resistance gene at home and abroad. Through counting discovering，it was found that there were 52 herbicide-resistance gene patents at abroad，and the genes were resistant to 13 herbicides incuding glyphosate，glufosinate，sulfonylureas， bromoxynil，2，4-D，dicamba，imidazolinones，benzofuran，pyridine formate，protoporphyrin oxidase （PPO） in-hibitors，hydroxyl phenyl pyruvate plus dioxygenase （HPPD） inhibitors，aryloxy phenoxy propionates （quinoxaline） and cyclohexanediones. There are 48 herbicide-resistance gene patents in China，among which 40 belonged to glyphosate resistant gene. While the genes were resistant to 4 herbicides including the glyphosate，glufosinate，imidazolinones and sulfonylureas. Although the patent numbers had little disparity at home and abroad， but the species were far less than foreign. Therefore，herbicide-resistance gene research and development was confronted with challenges in China.
Key words：herbicide-resistance gene；patents application；herbicide；the disparity at home and abroad；development strategy
早在20世紀(jì)70年代初期國際上就開始了轉(zhuǎn)基因作物的研究，至今已經(jīng)培育出多種轉(zhuǎn)基因作物，涵蓋了大部分糧食作物及經(jīng)濟作物，如水稻、玉米、棉花、煙草、番茄、辣椒、大豆、楊樹等，目的基因大部分為抗除草劑、抗蟲、抗病和抗逆等抗性基因，其中貢獻最大的是抗除草劑基因。2016 年全球單一抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物、抗蟲/抗除草劑復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物分別占總轉(zhuǎn)基因作物種植面積的47%和41%，因此抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物的總種植面積達(dá)到了88%[1]?？钩輨┺D(zhuǎn)基因作物的種植不僅降低了雜草的防除成本，增加了作物產(chǎn)量，同時也減少了除草劑對當(dāng)茬和后茬作物的殘留藥害，降低了環(huán)境污染[2-3]。但是，由于目前釋放的抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物主要是對草甘膦的抗性，抗除草劑的單一化，使得田間雜草對草甘膦產(chǎn)生了抗藥性[4]。自從1996年在澳大利亞出現(xiàn)抗草甘膦的硬直黑麥草（Lolium rigidum）后，全球草甘膦雜草抗藥性物種逐年增加。據(jù)統(tǒng)計，到2017年已有26個國家共計37種雜草對草甘膦產(chǎn)生了抗藥性。為了避免除草劑單一化的問題，人們一直在發(fā)掘不同類型的抗除草劑基因。下面從抗除草劑基因的國際專利和我國擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的專利2個方面解析抗除草劑基因?qū)＠纳暾埱闆r，目的是為我國抗除草劑基因的發(fā)掘提供參考。endprint
1 抗除草劑基因的專利申請概況
通過查詢佰騰專利網(wǎng)站（http：//so.baiten.cn/Index/Index），整理得到了國際和國內(nèi)抗除草劑的專利申請情況。目前抗除草劑基因申請保護的國際專利主要有52項；國內(nèi)核心專利主要有48項。下面分別對國際和國內(nèi)的抗除草劑基因?qū)＠暾垹顩r進行分析。
1.1 國際專利中的抗除草劑基因
1.1.1 自然來源的抗除草劑基因 從自然界生物中獲得的抗除草劑基因主要對草甘膦、草丁膦、磺酰脲類、溴苯腈、2，4-D、麥草畏、咪唑啉酮類、苯并呋喃類、吡啶甲酸酯類、原卟啉原氧化酶（PPO）抑制劑類、羥苯基丙酮酸加雙氧酶（HPPD）抑制劑類、芳氧苯氧丙酸酯類（包括喹禾靈）和環(huán)己烯酮類共13個種類的除草劑有抗性（表1）。
抗草甘膦基因主要有3類，第一類是5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸（EPSP）合酶基因。5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）是葉綠體中的一種酶，它能催化芳香族氨基酸的合成，而草甘膦能競爭性抑制EPSPS的作用，導(dǎo)致葉綠體類囊體薄膜上的蛋白質(zhì)合成受阻，使得葉綠體的結(jié)構(gòu)受損，從而致使功能受損。具有草甘膦耐性的EPSP合酶有3個類型：Class Ⅰ、Class Ⅱ和Class Ⅲ。美國孟山都公司（Monsanto Company US）從鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium strain TA831）克隆獲得了編碼EPSP合酶的aroA基因，編碼的氨基酸能夠合成 5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（Class Ⅰ 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase），此酶與草甘膦的親和力低，產(chǎn)生對草甘膦的抗性[5]。Barry等從根癌農(nóng)桿菌CP4、無色桿菌（Achromobacter strain LBAA）、假單胞菌PG2982（Pseudomonas strain PG2982）、枯草芽孢桿菌（Bacilus subtilis）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）克隆了Class Ⅱ EPSPS基因，此類基因能夠降低作物對草甘膦的親和力，使作物對草甘膦具有更高的耐受性[6]。埃森尼克斯生物技術(shù)公司（Athenix Corporation）從肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）、根癌農(nóng)桿菌、丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae） 中克隆獲得一系列新的EPSPS基因，屬于Class Ⅲ型 ，此類基因編碼的氨基酸合成的Class Ⅲ 5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（Class Ⅲ 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase）與草甘膦的親和力低而具有耐草甘膦的特性[7]。第二類是草甘膦降解酶基因。倫敦威斯康星大學(xué)帝國化學(xué)學(xué)院[Imperial Chemical House，Millbank，London SWlP 3JF （GB）]從木糖氧化產(chǎn)堿菌（Alcaligenes xylosoxidans）和假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）中克隆出新的降解草甘膦的基因，此類基因被分別命名為SC9基因和SC11基因[8]。美國孟山都公司（Monsanto Compay US）從人蒼白桿菌（Ochrobactrum anthropi strain LBAA）中發(fā)現(xiàn)了草甘膦氧化還原酶基因（gox）。這些基因可以表達(dá)降解草甘膦的蛋白酶，使草甘膦的C—N鍵斷裂生成氨甲基磷酸 （AMPA） 和乙醛酸鹽[9]。第三類是草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（gat）。先鋒種子公司（Pioneer Hi-Bred IntⅠ.）從地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）中克隆出了gat，該基因編碼草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（glyphosate-N-acetyltransferase，GLYAT），該酶能夠?qū)Ⅳ然鶊F從CoA轉(zhuǎn)移到草甘膦的N端，使草甘膦失活[10]。
抗草丁膦基因主要有2類：第一類是具有草丁膦解毒作用的N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（PAT）基因pat。拜耳科學(xué)作物公司（Bayer Crop Science）分別從吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）和綠色鏈霉菌（Streptomyces viridochromo）中克隆獲得能編碼PAT的基因bar和pat[11]。另一類是谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）基因，此酶可以過表達(dá)谷氨酰胺，從而實現(xiàn)對草丁膦的耐性。美國馬薩諸塞州Hospital Corporation公司[The General Hospital Corporation（Boston，MA）]從突變的苜蓿（Medicago sativa）中分離出了基因gs，將此基因?qū)胨尽⒂衩?、小麥等作物中后，轉(zhuǎn)基因gs能夠表達(dá)谷氨酰胺合成酶，此酶能有效解除草丁膦的毒性，從而使作物擁有抗草丁膦的特性[12]。
此外，美國陶氏益農(nóng)公司（Dow AgroScience LLC）從藍(lán)色鏈霉菌A3中克隆出基因dsm-2（dsm-2和pat有30%的同源性，和bar有28%的同源性），其表達(dá)的DSM-2蛋白對膦絲菌素和雙丙氨酸具有耐受性，可以提高植株對草丁膦的耐性。以CSVMV或AtUbil0作為啟動子，構(gòu)建了DSM-2的質(zhì)粒載體，成功轉(zhuǎn)入了油菜、大豆及具有抗蟲性的煙草和玉米中，使其同時擁有了對草丁膦的耐性[13]。
原卟啉原氧化酶（protoporphyrinogen oxidase，PPO）是原卟啉IX生物合成的關(guān)鍵酶，是血紅素和葉綠素相同生物合成通路上最后1個共有酶，它催化原卟啉原IX氧化為高度共軛的原卟啉IX。原卟啉原氧化酶抑制劑基因（PPX）能夠防止除草劑與PPO穩(wěn)定結(jié)合，以獲得作物對原卟啉原氧化酶抑制性除草劑的抗性。美國Cibus有限責(zé)任公司（Cibus US LLC）從一些植物的突變體中發(fā)現(xiàn)了突變型原卟啉原IX（protoporphyrinogen IX，PPX）基因，包括來自于突變型擬南芥、長芒莧（Amaranthus palmeri）、水稻（Oryza sativa）、高粱（sorghum bicolor）、玉米（Zea mays）、大豆（Glycine max）、馬鈴薯（Snlanum tuberosum）、蓖麻（Ricinus communis）和油菜（B. napus）線粒體內(nèi)的PPX基因，導(dǎo)入這些基因的植株可編碼突變的PPX蛋白，從而使目的植株對PPX抑制劑類除草劑（苯并嗪酮類、氟磺胺草醚、乙氧氟草醚、三氟羧草醚和二苯醚類）有抗性[14]。德國巴斯夫公司（BASF SE）發(fā)現(xiàn)了一系列微生物來源和植物來源的野生型或變異型編碼PPO的基因，包括：莧屬（Amaranthus）的PPX2L WC、PPX2L AC、PPX2L CC R、PPX2L AC R和PPX2，擬南芥的PPX和PPOX，煙草（Nicotiana tabacum） 的ppxl和ppxll，菊苣（Cichorium intybus）的PPX1，菠菜（Spinacia oleracea）的SO-POX2和SO-POX1，高粱（Sorghum bicolor）的Hyp. Protein，以及茄屬（Solanum）的PPOX，玉蜀黍?qū)伲╖ea）的ZM BFc0091803和prpo2，衣藻屬（Chlamydomonas）的Ppx1，稻屬（Oryza）的PPOX1和Hyp.Protein，大豆屬（Glycine）的hemG和黃瓜屬（Cucumis）的 CsPPO。這些基因可使植物對PPX抑制劑類除草劑（苯并嗪酮類）除草劑具有抗性或耐性[15]。endprint
抗2，4-D 的基因主要有2種：一種基因編碼的氨基酸能夠合成甲基轉(zhuǎn)移酶，如田納西大學(xué)發(fā)現(xiàn)了抗2，4-D的基因PtJBMT3，此基因編碼的甲基轉(zhuǎn)移酶能夠使2，4-D失活[16]；另一種基因編碼的氨基酸能夠合成芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶（AAD），如美國陶氏益農(nóng)公司從細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的aad-1、aad-13和aad-12。美國陶氏益農(nóng)公司（Dow AgroSciences LLC）從鞘氨醇單胞菌（Sphingobium herbicidovorans）中克隆獲得了耐2，4-D的基因，命名為aad-1。該基因編碼的氨基酸能夠合成芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶（AAD-1），此酶可以降解 2，4-D 的側(cè)鏈和芳氧苯氧丙酸酯類除草劑的右旋異構(gòu)體。將該基因插入玉米基因組的特定位點，即事件DAS-40278-9 （pDASl 740），獲得的轉(zhuǎn)基因玉米對除草劑2，4-D和喹禾靈有抗性。該公司從鞘氨醇單胞菌中克隆獲得了另一個基因，命名為aad-13。該基因編碼的氨基酸能夠合成芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶AAD-13（Aryloxy alkanoate dioxygenase，AAD-13），此酶可降解 2，4-D類和吡啶氧乙酸類的除草劑[17]。美國陶氏益農(nóng)公司（Dow AgroSciences LLC）從食酸叢毛單胞菌（Comamonas acidovorans）中克隆出另一個基因，并命名為aad-12。該基因編碼的芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶AAD-12可催化降解2，4-D的側(cè)鏈，轉(zhuǎn)入該基因的植物不僅對除草劑2，4-D有抗性，對吡啶氧乙酸酯除草劑（氯氟吡氧乙酸、三氯吡氧乙酸等）也有抗性[18]。
羥苯基丙酮酸加雙氧酶（hydroxyphenyl pyruvate dioxygenase，HPPD）能催化植物體內(nèi)質(zhì)體醌與生育酚合成的起始反應(yīng)，即催化對羥基丙酮酸轉(zhuǎn)化為尿黑酸，這些尿黑酸經(jīng)過羧化、聚戊二烯基化和烷基化生成質(zhì)體醌和生育酚。而 HPPD抑制劑類除草劑（包括吡唑酮類、三酮類、二苯酮類、二酮腈類和異唑酮類）通過抑制HPPD，導(dǎo)致質(zhì)體醌和生育酚含量減少，植物體發(fā)生白化，并最終死亡。德國巴斯夫公司發(fā)現(xiàn)了一些來自野生型或自然突變型的擬南芥（Arabidopsis thaliana）和萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）的抗苯并呋喃類除草劑的核酸序列，這些核酸序列編碼HPPD或尿黑酸茄尼酯轉(zhuǎn)移酶（homogentisate solanesyl transferase，HST）。插入這些基因的作物可以過表達(dá)HPPD，從而獲得對HPPD抑制劑類除草劑的抗性。該公司還從弗蘭克氏菌屬（Frankia）和自然突變的植物（擬南芥和向日葵等）中發(fā)現(xiàn)了對HPPD抑制劑類除草劑（吡唑酮類、三酮類和異唑酮類）有抗性的自然突變核苷酸序列，這種序列表達(dá)的HPPD，使植物獲得對HPPD抑制劑類除草劑更強的耐受性[19]。德國拜耳公司（Bayer CropScience AG）從赤霉菌（Kordia algicida）中克隆出對HPPD抑制劑類除草劑有抗性的基因，命名為FMP27，此基因編碼的氨基酸能合成FMP27 HPPD蛋白，以FMP27基因構(gòu)建載體pSE420-FMP27e，并成功導(dǎo)入煙草中，使之具有對HPPD抑制劑類除草劑的耐性[20]。
除上述5類除草劑的抗性基因外，還發(fā)現(xiàn)了對其他類型除草劑有抗性的基因。美國孟山都公司（Monsanto Company）從嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia DI-6 ）中克隆獲得dmo基因，該基因編碼合成的麥草畏單加氧酶（dicamba mono-oxygenase enzyme），該酶以麥草畏為底物產(chǎn)生氧化反應(yīng)，實現(xiàn)了對麥草畏的抗性。將該基因?qū)霟煵莺嘶蛑泻罂稍鰪娖鋵湶菸返目剐裕魧?dǎo)入煙草葉綠體基因組中則會使含有基因dmo的轉(zhuǎn)基因煙草對麥草畏的抗性更強[21]。美國陶氏益農(nóng)公司（Dow AgroSciences LLC）發(fā)現(xiàn)一系列具有抗吡啶甲酸酯類除草劑的基因，包括來自擬南芥的AFB5、AFB4和SGT1b，以及AFB5的3個同源核酸序列，其中2個來自水稻（Oryza sativa），1個來自顫楊（Populus tremula×Populus tremuloides）。這些基因編碼合成的蛋白質(zhì)為吡啶甲酸酯生長素的結(jié)合物和受體，因此這些抗除草劑基因使作物對吡啶甲酸酯類除草劑具有抗性[22]。
杭州瑞豐科技公司從狗牙根（Cynodon dactylon）中克隆出了除草劑解毒基因N-Z1。該基因?qū)儆诩?xì)胞色素P450基因家族，對以下1至多種除草劑具有抗性，這些除草劑分屬于：乙酰乳酸合成酶（ALS）抑制劑類除草劑；原卟啉原氧化酶（PPO）抑制劑類除草劑；對羥苯基丙酮酸鹽雙氧化酶（HPPD）抑制劑類除草劑；光系統(tǒng)Ⅱ抑制劑型除草劑；合成生長素類除草劑等。將N-Z1的5′ 端與玉米的ubiquitin-1啟動子（ZmUbi-1）連接，同時在3′端與1個CaMV的 35S終止子連接，形成可以在植物中表達(dá)的開放閱讀框，并以此構(gòu)建 T-DNA 載體pCam1300-N-Z1，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法成功將該基因?qū)氲剿?，使其獲得對煙嘧磺隆和硝磺草酮的抗性[23]。
1.1.2 人工誘變獲得的抗除草劑基因 人工誘變也叫人工引變，是指利用物理因素（X射線、γ射線、紫外線、激光等）或化學(xué)誘變（如疊氮化鈉、乙基甲磺酸等）來處理植物，使植物發(fā)生基因突變。這種方法可提高突變率，創(chuàng)造人們需要的變異類型。
科羅拉多小麥研究基金有限公司（Colorado Wheat Research Foundation Limited）通過乙烷磺酸甲酯（EMS）誘變小麥種子，篩選出對乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）抑制劑類除草劑具有抗性的小麥突變體AF28-A、AF26-B 和AF10-D，將它們的相應(yīng)基因編碼的ACCase氨基酸序列與黑草（Buchnera cruciata）進行對比，發(fā)現(xiàn)其第2004位的丙氨酸被纈氨酸取代。用這類突變小麥通過傳統(tǒng)育種方法可獲得具有抗芳氧苯氧丙酸酯類或環(huán)己烯酮類除草劑的小麥個體[24]。endprint
維多利亞農(nóng)業(yè)服務(wù)有限公司（Agriculture Victoria Services Pty Ltd）通過疊氮化鈉（AZ）和甲基亞硝脲（MNU）對大約10 000粒水稻種子進行突變誘導(dǎo)，篩選出4株對喹禾靈具有抗性的水稻植株，通過對這4株突變體的核酸及蛋白的序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中1株水稻突變體在ACCase編碼區(qū)的羧基轉(zhuǎn)移酶區(qū)域存在1個堿基位點的突變，其第 2096 個氨基酸位點由GGC突變?yōu)锳GC，氨基酸由原來的甘氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻z氨酸。該抗性機理與抗喹禾靈的黑草相似，抗喹禾靈的黑草是第2096個氨基酸由甘氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱吮彼?。其?株抗性水稻未見此類突變，抗性機制尚不明確[25]。該公司還通過乙基甲磺酸（ethyl methane sulfonate，簡稱EMS）化學(xué)誘變大麥種子，篩選出抗咪唑啉酮類除草劑的種子，從這些抗性種子中獲得編碼乙酰乳酸合成酶（AHAS，也被稱為ALS）的核酸序列，命名為VBHT0805、VBHT0806、VBHT0802和VBHT0810，核酸比對結(jié)果顯示，這些序列與抗咪唑啉酮類除草劑基因AHAS Hvulgare AF059600完全一致或只存在1個堿基位點的變化[26]。
1.1.3 人工改造獲得的抗除草劑基因 為了提高優(yōu)化植物抗除草劑的能力，在發(fā)現(xiàn)的抗除草劑基因的基礎(chǔ)上，人們通過基因定點突變和密碼子改造方法獲得了具有對同種及多種除草劑有耐性的基因（表2）。
通過基因定點突變獲得的除草劑基因如下，美國Incima有限責(zé)任公司和美國西布斯有限責(zé)任公司（Incima US LLC和Cibus US LLC）發(fā)明了一種獲得非轉(zhuǎn)基因耐草甘膦植物的新方法。該方法利用重組寡核糖小體，在基因EPSPS編碼區(qū)定點突變，使得序列編碼的氨基酸發(fā)生1至多個改變，合成的蛋白對草甘膦等甲基甘氨酸類除草劑有抗性。最后通過基因槍法將該突變的重組寡核糖小體導(dǎo)入到植物中，獲得擁有抗甲基甘氨酸類除草劑的抗除草劑植株?，F(xiàn)已成功應(yīng)用于玉米、水稻、油菜等植物中。先正達(dá)公司（Syngenta AG）對來自大腸桿菌的Class Ⅰ EPSPS基因（aroA基因）進行人工修飾，使其編碼的氨基酸序列的第8、68、101和102位點的氨基酸有2～3個被其他氨基酸替換，這種新蛋白對草甘膦具有抗性[27]。美國孟山都公司（Monsanto Company）對抗草甘膦基因epsps進行人工修飾，獲得了抗草甘膦基因mepsps編碼的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶（mEPSPS），能產(chǎn)生芳香族氨基酸，對草甘膦具有耐受性；mepsps基因已成功導(dǎo)入了玉米中[28]。
阿格拉公司（Agragen Inc）對來自擬南芥的乙酰乳酸合酶（acetolactate synthase，ALS）基因進行人工修飾，獲得變異型的A122、P197和W574基因，它們編碼的ALS蛋白序列分別在第122位、197位和574位發(fā)生了改變，其原先的丙氨酸、脯氨酸和色氨酸被其他氨基酸取代。這種新型蛋白與磺酰脲類和咪唑啉酮類除草劑結(jié)合較弱，親和力較低。若直接以基因als本身的啟動子構(gòu)建載體導(dǎo)入植物，在無除草劑壓力的情況下，基因als不能正常表達(dá)；而以35S啟動子和TATA啟動子替代基因als本身的啟動子，構(gòu)建載體獲得的轉(zhuǎn)基因芥藍(lán)（B. oleracea）具有磺酰脲類和咪唑啉酮類除草劑抗性，且在無除草劑壓力的情況下，仍能正常表達(dá)ALS[29]。德國拜耳公司（Bayer CropScience AG）對來自擬南芥和煙草的ALS蛋白基因進行定點突變，使得ALS蛋白基因編碼的氨基酸序列上的第569位的色氨酸被亮氨酸替代，第188位的脯氨酸被絲氨酸替代。將定點突變的als基因?qū)胩鸩酥?，篩選獲得對磺酰脲、咪唑啉酮及嘧啶基（硫代）苯甲酸酯類除草劑有耐性的轉(zhuǎn)基因甜菜[30]。
巴斯夫公司對來自擬南芥的乙酰乳酸合成酶大亞基（ahasl）基因Csr1-2進行點突變，將第653位的絲氨酸殘基改為天冬氨酸（S653N），獲得了具有抗咪唑啉酮類除草劑的基因Csr1-2。改變后的乙酰乳酸合成酶不會與咪唑啉酮結(jié)合，從而保證了植物體內(nèi)正常生理功能。將Csr1-2基因?qū)氪蠖怪?，獲得抗咪唑啉酮類除草劑的轉(zhuǎn)基因大豆[31]。Gioia等從大豆（Glycine max）中克隆獲得1個新基因，命名為gm-hra，對該基因進行人工修飾，編碼的氨基酸合成的ALS具有耐磺酰脲類除草劑的特性。構(gòu)建載體PHP17752-gm-hra并導(dǎo)入大豆中，獲得耐磺酰脲類除草劑的大豆[32]。
先正達(dá)公司（Syngenta AG）對來自玉米的CYP72A1 和nsfl基因，來自水稻的CYP81A6基因進行定點突變，這些人工改造過的P450家族基因編碼的氨基酸所合成的細(xì)胞色素P450對HPPD抑制劑類除草劑有降解作用，將這些修飾后的P450基因?qū)胫参镏泻螅墒怪参矬w過表達(dá)細(xì)胞色素P450，增強對HPPD抑制劑類除草劑的耐性[33]。
通過密碼子改造獲得的抗除草劑基因如下，中國創(chuàng)世紀(jì)種業(yè)有限公司對EPSPS 蛋白MC-EPSPS 和G2-aroA （中國專利03826892.2 ）的氨基酸序列進行同源對比分析，采用蛋白質(zhì)工程和基因工程相結(jié)合的技術(shù)，在MC-EPSPS 蛋白的N 端融合了G2-aroA蛋白N 端的26 個氨基酸殘基，獲得了1個EPSPS突變體融合蛋白（MC2-EPSPS），該蛋白與草甘膦的親和力較低，從而具有草甘膦抗性。通過原核表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植物功能鑒定發(fā)現(xiàn)，MC2-EPSPS的抗草甘膦水平較MC-EPSPS 和G2-aroA 均有顯著提高[34]。 Han等根據(jù)能夠表達(dá)EPSP合酶的G2-aroA（來源于熒光假單胞菌pseudomonas fluorescens G2）基因編碼的氨基酸序列，在保證氨基酸序列不變的前提下，首先采用玉米偏好密碼子，盡量避免使用玉米稀有密碼子，對G2-aroA基因進行人工優(yōu)化改造。在此基礎(chǔ)上，去除DNA序列中造成植物基因轉(zhuǎn)錄不穩(wěn)定的核酸序列，并去除發(fā)夾結(jié)構(gòu)，得到密碼子優(yōu)化型抗草甘膦基因，將其命名為mG2-aroA，此序列與 G2-aroA有84%的同源性，而G+C含量由原來的6483%降低到62.07%。以此構(gòu)建攜帶有mG2-aroA基因的重組表達(dá)載體pS3300-UMG2，并導(dǎo)入玉米中，獲得能夠高表達(dá)G2-aroA 蛋白（屬于EPSPS酶）的轉(zhuǎn)基因玉米，從而使其具有對草甘膦的抗性[35]。endprint
此外，美國孟山都公司（Monsanto Technology LLC）人工合成了1個與來自根癌農(nóng)桿菌CP4（Agrobacterium tumefaciens CP4）的cp4-epsps具有相同功能的基因，命名為trans。該基因表達(dá)的EPSP合酶能夠降低作物對草甘膦的親和力。將其構(gòu)建載體，并成功插入甘藍(lán)型油菜（B. napus）A基因組的N4連鎖群中，獲得了抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因油菜，即MON 88302事件[36]。
1.1.4 通過基因融合獲得的抗除草劑基因 人們將不同的除草劑耐性基因融合到一起，獲得了耐多種除草劑的融合基因（表3）。先正達(dá)公司（Syngenta AG）構(gòu)建雙運載體15954，包括來源于產(chǎn)綠鏈霉菌（Streptomyces viridochromogenes）的pat基因和來自燕麥（Avena sativa）的avhppd-03基因，avhppd-03基因合成的p-HPPD對硝磺草酮有抗性，將該載體成功導(dǎo)入大豆中獲得了對草丁膦和硝磺草酮有抗性的轉(zhuǎn)基因大豆[37]。先正達(dá)公司（Syngenta AG）構(gòu)建雙運載體pDAB9582，將基因Cry1F、Cry1Ac、add-12 和pat重組在一起，即事件pDAB9582.814.19.l ： pDAB4468.04.16.l，成功導(dǎo)入到大豆中，獲得了具有抗蟲、抗除草劑能力的轉(zhuǎn)基因大豆。Cry1F，Cry1Ac基因所表達(dá)的蛋白對鱗翅類昆蟲具有抗性，可選擇性地?fù)p傷它們的中腸黏膜。aad-12基因來自食酸叢毛單胞菌（Delftia acidovorans），該基因表達(dá)的AAD-12可降解2，4-D和吡啶氧乙酸除草劑。pat基因來自產(chǎn)綠鏈霉菌（Streptomyces viridochromogenes），此基因表達(dá)的PAT蛋白，具有抗草丁膦的特性[38]。美國陶氏益農(nóng)公司（Dow AgroScience LLC）構(gòu)建載體pDAB8264，將基因aad-12、2mepsps、pat重組在一起，導(dǎo)入到大豆中，獲得了轉(zhuǎn)基因大豆pDAB8264.42.32，使其對2，4-D、草甘膦和草丁膦有抗性[39]。先正達(dá)公司（Syngenta AG）構(gòu)建雙運載體18857，內(nèi)含gs和pat基因，分別表達(dá)GS和PAT蛋白，這2種蛋白能使作物對草甘膦和草丁膦產(chǎn)生抗性，該載體已被成功導(dǎo)入多種作物中，如玉米、油菜、水稻和小麥等[40]。
1.2 我國申請的抗除草劑基因?qū)＠?/p>
雖然從整體水平看，我國在轉(zhuǎn)基因作物研究技術(shù)方面的進展與國際先進水平有一定差距，其中差距最大的，是在擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的基因方面，這也影響到我國抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物的培育；但我國除了通過從自然界的新生物個體中獲得耐除草劑基因以外，科學(xué)家還利用分子生物學(xué)手段對已有的抗性基因進行改造，例如基因突變、人工誘變、人工改造、密碼子改造、融合基因等方式獲取抗不同除草劑的基因，產(chǎn)生了不少原創(chuàng)性的研究成果。目前我國發(fā)表的抗除草劑基因主要有抗草甘膦、抗草丁膦、抗磺酰脲類、抗咪唑啉酮類4類（表4）。
1.2.1 自然來源的抗除草劑基因 國內(nèi)抗草甘膦基因主要有2類，第一類是5- 烯醇式丙酮酰莽草酸-3- 磷酸（EPSP）合酶基因。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所從草甘膦污染的土壤中分離出的運動發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis）篩選到一種新的EPSP合酶基因（ZM-EPSP合酶基因），并將該基因?qū)胧荏w生物大腸桿菌和煙草中，使所得到的遺傳工程重組生物獲得抗草甘膦的能力[41]。還從采集的草甘膦極端污染環(huán)境的土壤樣品中，采用免培養(yǎng)方法分離出群落水平總DNA，構(gòu)建群落水平總基因文庫，并篩選草甘膦抗性轉(zhuǎn)化子，對高耐受草甘膦的片段的全核苷酸序列測定，發(fā)現(xiàn)了GR 79-EPSP合酶基因，該基因在植物中表達(dá)后，所獲得的轉(zhuǎn)基因植物對草甘膦具有更強的耐受性[42]。該所還從新疆塔克拉瑪干沙漠邊緣的紅柳樹根際土壤中分離出對草甘膦具有抗性的沙漠紅細(xì)菌（Rhodobacter shamoensis）W402菌株[43]。此外，還從土壤細(xì)菌菌株K01中分離出抗草甘膦的K01aroA基因[44]。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所從苘麻（Abutilon theophrasti）中分離到的EPSPS基因序列，該序列所編碼的EPSPS對草甘膦具有較好的抗性，以此基因構(gòu)建載體pGEM-TE，借助根癌農(nóng)桿菌LBA0044介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到煙草中而獲得抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因煙草。該基因可作為功能基因用于抗草甘膦轉(zhuǎn)基因植物的培育[45]。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所從草甘膦重度污染土壤中篩選得到草甘膦抗性微生物假單胞菌（Psedomonas moraxellaceae），通過實驗驗證了它具有高抗草甘膦的能力，將假單胞菌的抗性基因轉(zhuǎn)入植物后，可使植物的抗草甘膦能力提高[46]。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)雜草研究室從麥冬（Ophiopogon japonicus）、土麥冬（Liriope spicata）和闊葉麥冬（Liriope latyphylla）中分離得到了新的抗草甘膦基因LSEPSP，并且對其進行改良得到一系列突變基因，這些基因可以用來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因抗草甘膦植物，也可作為植物細(xì)胞培育中的篩選標(biāo)記[47]。此類基因能夠降低作物對草甘膦的親和力，從而賦予對草甘膦更高的耐受性。上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院從葡萄（Vitis vinifera）冠癭病拮抗菌中篩選獲得了一株能在草甘膦中生長的水生拉恩氏菌（Rahnella aquatilis），從該細(xì)菌中分離獲得了抗草甘膦的 aroA-Ra基因[48]。從極端嗜熱菌海棲熱袍菌（Thermotoga martima）中分離出aroA-Tm基因，此基因表達(dá)的蛋白對草甘膦具有較高的耐受性[49]。東北農(nóng)業(yè)大學(xué)從黃曲霉和假絲酵母菌（Candida palmioleophila）中分離出 EPSP 合酶基因，此基因表達(dá)的EPSP合酶對草甘膦也具有抗性[50-51]。
劉柱等從被草甘膦極度污染的土壤中分離到一株極端抗草甘膦菌可變鹽單胞菌（Halomonas variabilis），該細(xì)菌的aroA基因核苷酸序列與目前已報道的編碼EPSP合酶的aroA基因幾乎沒有任何同源性，氨基酸序列與草甘膦抗性相關(guān)的美國專利所涉及的22種微生物EPSP合酶的同源性在46%以下；因此所克隆的是1個結(jié)構(gòu)新穎、功能明確并高抗草甘膦的新基因，但未申請專利[52]。中國農(nóng)科院生物技術(shù)研究所申請了抗草甘膦轉(zhuǎn)基因陸地棉BG2-7的檢測方法及側(cè)翼序列，所轉(zhuǎn)基因是擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的aroA基因[53]；還申請了一種抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆及其制備方法和應(yīng)用的專利，所轉(zhuǎn)基因也是擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的aroA基因以及草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶gat基因[54]。endprint
南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院從大腸桿菌克隆到抗草甘膦的基因argF和deoA，基因可作為目的基因?qū)胫参?，以提高轉(zhuǎn)基因植物抗草甘膦的能力。這2個基因?qū)共莞熟⒖赡芘c靶基因關(guān)系不大，其對靶基因的影響可能是間接的[55]。南通龍翔生物技術(shù)有限公司從土壤細(xì)菌中克隆到1個抗草甘膦的EPSP合酶基因，但未進行深入研究。
第二類是草甘膦降解酶基因。中山大學(xué)從苜蓿根瘤菌（Rhizobium meliloti M010）中分離出草甘膦降解酶基因（GLD），此基因可以表達(dá)C—P裂解酶，使草甘膦的C—P鍵斷裂，從而賦予對草甘膦的耐受性[56]。
1.2.2 人工誘變獲得的抗除草劑基因 除了抗草甘膦基因外，還采用人工誘變的方法獲得了抗咪唑啉酮類和磺酰脲類除草劑的基因5個，并獲得了抗性油菜和水稻。江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院篩選到了自然突變的抗咪唑啉酮類除草劑的甘藍(lán)型油菜，把突變基因的核酸序列命名為BnALS1R基因，應(yīng)用雜交、回交等植物常規(guī)育種方法將該基因?qū)肫渌麑溥蜻惓輨o抗性的油菜品種或品系，提高了目標(biāo)品種或品系對咪唑啉酮類除草劑的耐受性[57]。還以甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑突變體為材料，獲得突變體中的抗性基因，命名為 BnALS3R基因，利用構(gòu)建的植物表達(dá)載體將該基因?qū)雽酋ｋ孱惓輨o抗性的植物中，可提高轉(zhuǎn)基因植物對磺酰脲類除草劑的抗性[58]。深圳興旺生物種業(yè)有限公司利用甲磺酸乙酯（EMS）誘變水稻品種黃華占和黃絲占，篩選獲得抗咪唑啉酮類除草劑的黃絲占和黃華占突變植株。在存在咪唑啉酮類除草劑的情況下，這些突變體的乙酰乳酸合成酶（ALS）基本都保持了原有酶活性，表明突變ALS酶具有抗咪唑啉酮類除草劑的特性。核酸和蛋白序列分析結(jié)果顯示，als基因發(fā)生點突變，其編碼的ALS蛋白帶有Trp548、Ala96或Ser627突變[59]。江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院對秈稻優(yōu)良恢復(fù)系9311的EMS突變植株進行長期、不斷的篩選，發(fā)現(xiàn)了1個Gln25 、Gln113和ALa237位點發(fā)生突變的蛋白，還發(fā)現(xiàn)了1個在Gln25 、Gln113、 His367 和Ser627位點的突變，使水稻具有ALS抑制劑類除草劑的抗（耐）性，特別是對咪唑啉酮類和磺酰脲類除草劑的抗（耐）性[60]。
1.2.3 基因突變獲得的抗除草劑基因 人們通過對原有的抗除草劑基因進行人工改造、融合獲得的抗除草劑基因（表5）如下：中山大學(xué)采用基因優(yōu)化的方法獲得了多點突變的、具有較強草甘膦抗性的EPSP合成酶基因，提高了EPSP合酶的催化效率，降低了酶與草甘膦的親和力，使該酶抵御草甘膦的能力大幅度提高。其中aroAM12是其所編碼的具有草甘膦抗性的EPSP合成酶與鼠傷寒沙門氏桿菌aroA所編碼的氨基酸序列發(fā)生了7個位置的置換；aroAM13是其所編碼的具有草甘膦抗性的EPSP合成酶與大腸桿菌aroA所編碼的氨基酸序列發(fā)生了2個位置的置換[61]。2個突變基因都有望成為構(gòu)建抗草甘膦農(nóng)作物新品種的優(yōu)良材料。
中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所構(gòu)建含有水稻EPSP合酶基因的大腸桿菌組成型表達(dá)載體，并利用易錯PCR技術(shù)對大腸桿菌表達(dá)載體中的EPSP合酶進行隨機突變，再將含有EPSP合酶突變基因的大腸桿菌表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌，獲得EPSP合酶基因突變庫，篩選后獲得抗草甘膦的重組子，測序得到水稻EPSP合酶基因突變體，該突變體的EPSP合酶基因?qū)Σ莞熟⒕哂懈叨瓤剐訹62]。
杭州瑞豐生物科技有限公司從放線桿菌（Deinococcus radiodurans）R1 中分離出了Dein R1 EPSP合酶（該EPSP合酶既不屬于Class I，也不屬于Class Ⅱ，其抗性機理尚不明確）基因，編碼基因命名為G7，該基因?qū)Σ莞熟⒕哂休^高的抗性[63]。接著人工改造抗性基因G1174，獲得了高抗草甘膦的EPSP合酶基因G10[64]。該基因可用于轉(zhuǎn)基因水稻、玉米、棉花、大麥、大豆、草坪或牧草的開發(fā)。
上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院采用分子重排技術(shù)獲得了草甘膦抗性增強的來源于蘋果和葡萄的EPSP合酶多位點突變體及其編碼基因。這些突變體具有較高的草甘膦抗性和較強的與磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）親和性，這為該基因用于抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物的培育提供了可能[65-66]。
1.2.4 密碼子改造獲得的抗除草劑基因 劉堅根據(jù)變異的抗草甘膦基因2mG2-epsps編碼的氨基酸組成，利用玉米密碼子偏好性進行設(shè)計、改造后用人工合成的方法獲得了抗草甘膦基因MTP-SMG2-EPSPS。改造后人工合成的EPSP合酶基因經(jīng)鑒定在玉米中能高效表達(dá)，獲得的抗草甘膦玉米與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾染哂忻黠@的抗草甘膦的能力[67]。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所利用小麥密碼子偏好性對從極端土壤中抗性細(xì)菌中分離的GR 79-EPSPS進行人工設(shè)計，并在N段添加來自小麥RubisCO小亞基的葉綠體導(dǎo)肽，通過人工合成法獲得了改造的基因wCTP ∶ GR 79m，并將其應(yīng)用于小麥轉(zhuǎn)化時作為篩選標(biāo)記基因，獲得了抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因小麥，該轉(zhuǎn)基因小麥的抗性高于優(yōu)化前小麥的轉(zhuǎn)基因抗性[68]。
中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所對來源于土壤微生物總DNA的草甘膦抗性基因GR79和gat，按照棉花宿主偏愛密碼子表對2個基因進行核苷酸水平上的編輯，通過生物信息學(xué)工具進一步對編輯后的序列進行加工，目的是調(diào)整基因總體GC水平，優(yōu)化限制性酶切位點，去除可能抑制性負(fù)調(diào)控元件及優(yōu)化mRNA結(jié)構(gòu)提高mRNA穩(wěn)定性等。將優(yōu)化后的2個抗草甘膦基因構(gòu)建到雙價表達(dá)載體上進行同時表達(dá)，所得轉(zhuǎn)基因棉花施用草甘膦后與未進行草甘膦處理對照植株生長狀況差異不明顯，以上結(jié)果證明獲得的雙價抗草甘膦轉(zhuǎn)基因棉花具有較強的草甘膦抗性。本發(fā)明對于培育具有自主知識產(chǎn)權(quán)的高抗草甘膦棉花具有非常重要的意義[69]。
北京大北農(nóng)科技集團股份有限公司培育了同時抗草甘膦和草丁膦的轉(zhuǎn)基因玉米事件DBN9877，抗草甘膦基因是 5-烯醇丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶基因（EPSPS）是從土壤農(nóng)桿菌菌株中分離得到的，且可以通過優(yōu)化密碼子或者以其他方式改變編碼的多核苷酸；抗草丁膦基因（pat）是編碼膦絲菌素N-乙?；D(zhuǎn)移酶（PAT）的基因[70]。endprint
1.2.5 通過基因融合獲得的抗除草劑基因 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)根據(jù)CP4-EPSPS不同區(qū)域的活性分析及玉米基因組特點，對CP4-EPSPS的密碼子及編碼框進行了改造，改造后的核苷酸序列與原始的EPSPS同源性僅為88%。同時在優(yōu)化后的 EPSPS 基因5′ 端增加了1個來源于高粱的葉綠體轉(zhuǎn)運肽，將該重組基因命名為CC-M EPSPS。通過對轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因及CC-M EPSPS基因的玉米不同轉(zhuǎn)化事件的分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)CC-M EPSPS基因更容易獲得高表達(dá)的轉(zhuǎn)化事件[71]。把該基因轉(zhuǎn)入玉米中，獲得了有自主知識產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)基因抗草甘膦玉米CC-2。又克隆了高粱基因的葉綠體信號肽，將其與優(yōu)化的epsps基因連接，命名為maroACC，通過基因槍共轉(zhuǎn)化的方法把該基因轉(zhuǎn)入到具有高轉(zhuǎn)化效率的玉米自交系及雜交組合中，用草甘膦進行篩選，獲得了1個玉米優(yōu)良轉(zhuǎn)化體[72]。
創(chuàng)世紀(jì)種業(yè)有限公司從陸地棉冀棉14中克隆抗草甘膦EPSPS基因，并進行人工改造，獲得了融合的抗草甘膦mc2-epsps基因[73]；接著構(gòu)建了含2個拷貝該基因的抗性表達(dá)環(huán)形載體，導(dǎo)入該植物表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因棉花具有非常強的草甘膦抗性[74]。
北京市農(nóng)林科學(xué)院將編碼玉米葉綠體信號肽的rbcs基因與GenBank：GM718572.1的epsps基因融合，獲得了融合序列的優(yōu)化基因G23V-EPSPS，將該基因轉(zhuǎn)入玉米中獲得了具有高抗草甘膦特性的玉米品種[75]。
浙江大學(xué)人工合成了一種抗草甘膦融合蛋白編碼基因，該基因由EPSPS蛋白編碼基因和草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶或草甘膦氧化酶編碼基因構(gòu)成，EPSPS蛋白編碼基因為下列之一：CP4、aroA、G7或G10，所述草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因為gat，所述草甘膦氧化酶編碼基因為gox。該抗草甘膦蛋白可以通過不同的耐受機制賦予轉(zhuǎn)基因植物對草甘膦的高抗特性。該抗草甘膦融合蛋白可以應(yīng)用于單子葉植物和雙子葉植物的抗草甘膦方面，主要應(yīng)用于玉米、水稻、大豆、小麥和油菜[76]。還人工合成了草甘膦和草丁膦復(fù)合抗性的融合蛋白基因，抗草甘膦編碼基因為CP4、aroA、G7、G10、GOX或gat，抗草丁膦編碼基因為bar或pat，對2種除草劑都有抗性，可用于制備具有草甘膦與草丁膦復(fù)合抗性的轉(zhuǎn)基因植物[77]。
福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院構(gòu)建了可在水稻的生長發(fā)育期全程表達(dá)草甘膦抗性的載體，并且在幼穗分化期花器官組織特異性地增強表達(dá)。該載體由雙表達(dá)盒組成，其中1個表達(dá)盒由水稻幼穗分化期特異表達(dá)基因啟動子、水稻葉綠體轉(zhuǎn)運膚、抗草甘膦基因（抗草甘膦基因來源于水稻epsps的突變基因epspsM）和終止子組成；另一個表達(dá)盒由組成型啟動子、葉綠體轉(zhuǎn)運體、抗草甘膦基因以及終止子組成。利用該載體獲得的轉(zhuǎn)基因水稻，其在生長發(fā)育的所有組織器官對草甘膦有較高抗性外，還在水稻幼穗分化期提高花器官組織對草甘膦的抗性，解除草甘膦對水稻花器官的損害，保證水稻的產(chǎn)量[78]。
2 國內(nèi)外抗除草劑基因?qū)＠牟罹?/p>
通過對比國內(nèi)外抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物方面的專利，發(fā)現(xiàn)中國與國際間還是存在很大的差距的。
2.1 抗除草劑基因國際專利分析
在52項國際專利中，屬于自然來源的專利有42項，屬于人工改造的有6項，屬于融合基因的有4項。
根據(jù)抗除草劑基因的性能，可將這52項國際專利分為抗1種除草劑（簡稱單抗）和抗2種以上除草劑（簡稱多抗）2類，且單抗占82.7%，多抗占17.3%。這52項專利中的基因主要對草甘膦、草丁膦、磺酰脲類、溴苯腈、2，4-D、麥草畏、咪唑啉酮類、苯并呋喃類、吡啶甲酸酯類、原卟啉原氧化酶（PPO）抑制劑類、羥苯基丙酮酸加雙氧酶（HPPD）抑制劑類、芳氧苯氧基丙酸酯類（包括喹禾靈）和環(huán)己烯酮類共13個種類的除草劑有抗性。
在單抗的除草劑基因?qū)＠?，共?1種抗除草劑基因，且都屬于自然來源的抗除草劑基因，其中有18種來自細(xì)菌，13種來自植物，只有1種是人工改造獲得的抗性基因。
在9項多抗的除草劑基因?qū)＠?，共?種抗除草劑基因，這9種基因中有5種來自細(xì)菌，3種來自植物，1種通過人工改造獲得。從藍(lán)色鏈霉菌（A3）中獲得的DSM-2基因?qū)Σ莞熟ⅰ⒉荻§ⅰ?，4-D這3種除草劑有抗性，而且具有抗蟲的特性；從鞘氨醇單胞菌中克隆的aad-1基因具有降解2，4-D和芳氧苯氧丙酸酯（如喹禾靈）類除草劑的特性；分別從食酸叢毛單胞菌和鞘氨醇單胞菌中克隆的aad-12和aad-13基因具有抗 2，4-D和吡啶氧乙酸除草劑的特性；從植物中篩選克隆得到的PtJBMT3基因?qū)?，4-D和生長素類除草劑有耐性；編碼ALS的基因?qū)酋ｋ?、咪唑啉酮類除草劑有抗性；從小麥中克隆得到的編碼ACCase的基因?qū)Ψ佳醣窖醣狨ヮ悺h(huán)己烯酮類除草劑有抗性；從燕麥中獲得的avhppd-03基因?qū)Σ荻§ⅰ愡虿萃拖趸遣萃@3種除草劑有抗性。以及通過改造擬南芥中的als突變基因獲得的A122、P197和W574，對磺酰脲類和咪唑啉酮類除草劑有抗性。
2.2 抗除草劑基因國內(nèi)專利分析
在我國，共有48項抗除草劑基因的專利，屬于自然來源的專利有28項，屬于人工改造的專利有20項。根據(jù)抗除草劑基因的性能，可將這48項專利分為單抗和多抗2類，且單抗占91.7%，多抗占8.3%。這48項專利中的基因主要對草甘膦、草丁膦、咪唑啉酮類、磺酰脲類4種除草劑有抗性。
在單抗的除草劑基因?qū)＠校灿?9種抗除草劑基因，這19種基因有14種來自細(xì)菌，5種來自植物。且這19種基因中有14種是屬于自然來源的抗除草劑基因，5種是人工改造獲得的抗性基因。
在多抗的除草劑基因?qū)＠?，共?種抗除草劑基因，這2種基因均來自植物，且均屬于自然來源的抗除草劑基因，分別是抗多種除草劑的細(xì)胞色素P450，以及抗咪唑啉酮類和磺酰脲類除草劑的突變型基因als。endprint
3 我國抗除草劑基因的研發(fā)策略
3.1 重點開發(fā)植物來源的抗性基因
從我國抗草甘膦基因來看，19項專利是從微生物中克隆的抗草甘膦基因，2項專利是從植物中克隆的抗性基因。相對于細(xì)菌等來源的抗草甘膦基因，植物來源的進化抗性或天然抗性基因在培育抗草甘膦作物后的生態(tài)環(huán)境和食品安全風(fēng)險要低于其他生物類別的異源基因，提高民眾心理的認(rèn)可。因此今后應(yīng)該主要發(fā)展植物源的抗草甘膦基因以及其他除草劑的抗性基因。
3.2 加大滅生性除草劑草丁膦抗性基因的研發(fā)
在我國有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗除草劑基因中，尚無滅生性除草劑草丁膦的抗性基因。草丁膦和草甘膦相比，同樣屬于優(yōu)秀的滅生性除草劑，毒性低，在土壤中易于降解，對作物安全，不易飄移，活性高，用量少，環(huán)境壓力小，殺草迅速，能快速殺死多種禾本科和闊葉雜草，因此應(yīng)加大抗草丁膦基因的發(fā)掘。
3.3 加強除草劑解毒基因的發(fā)掘
細(xì)胞色素 P450s 能通過羥基化或脫烷來代謝乙酰輔酶 A羧化酶（ACCase）、乙酰乳酸合成酶（ALS）和光系統(tǒng) Ⅱ （PSⅡ）抑制劑類除草劑，達(dá)到解細(xì)胞毒性的目的。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GSTs） 也被證明參與了除草劑的解毒代謝過程。目前，對細(xì)胞色素 P450s 和 GSTs解除草劑毒性的分子機制仍然知之甚少。不過，越來越多的研究表明在自然界中任何抗性機制都是可能發(fā)生的。事實上，非靶點抗性機制更為普遍，且容易產(chǎn)生更高的抗性水平； 因此應(yīng)該加強除草劑解毒基因的發(fā)掘。目前只有1個專利是關(guān)于細(xì)胞色素P450的解毒基因。
3.4 加大人工誘變獲得的抗性基因的研究和抗性作物培育
抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物的選育首先是作為一種雜草防除對策而提出的；但抗性基因的流向和由此引發(fā)的食品安全性問題始終存在著巨大的爭議，甚至在一定程度上阻礙了轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展。而常規(guī)育種手段雖不能像轉(zhuǎn)基因技術(shù)一樣將物種之間的基因資源利用得十分充分，但卻以其自身沒有外源基因轉(zhuǎn)入而更容易被接受和推廣。目前，通過非轉(zhuǎn)基因手段培育的抗除草劑作物涉及玉米、大豆、菜豆、煙草等。所抗除草劑包括咪唑啉酮類、磺酰脲類、環(huán)己烯酮類、有機磷類、均三氮苯類和激素類等大類，其中最為突出的是抗咪唑啉酮類類除草劑的系列作物。因此利用CRISPR9等現(xiàn)代生物技術(shù)進行原位修飾改造作物基因，培育非轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物新品種更具有發(fā)展前景。
3.5 合理開發(fā)抗性基因的疊加性狀
隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，在培育新品種方面將發(fā)揮主要作用，為了改良品種的多種性狀將多目標(biāo)基因轉(zhuǎn)移到一個品種中將越來越普遍。美國已經(jīng)有能抗2種除草劑（抗草甘膦和草丁膦）并抗蟲的玉米品種的商業(yè)化種植。
隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，多抗及復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因作物的研發(fā)日益受到人們的重視，通過ISAAA的數(shù)據(jù)可以看出，目前國外已經(jīng)開發(fā)出大量的多抗及復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因作物。單一抗除草劑的作物在長期使用所抗除草劑后，田間雜草產(chǎn)生抗藥性的概率將大大增加，那么該抗除草劑作物也將失去應(yīng)用的效果。與抗單一除草劑的轉(zhuǎn)基因作物相比，具有雙抗甚至多抗除草劑以及復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因作物以輪換除草劑的使用，避免抗性雜草的產(chǎn)生。因此建議培育抗2種以上除草劑的作物，加強多抗基因的挖掘，另外還建議培育抗除草劑和抗蟲的具有復(fù)合性狀的作物，提高轉(zhuǎn)基因作物的經(jīng)濟價值和生態(tài)效益。
參考文獻：
[1]James C. Global status of Commercialized biotech/GM crops：2004—2016[R]. ISAAA in Brief-ISAAA.org，2014—2016.
[2]Qiang S，Song X L，Dai W M. Opportunities and challenges for herbicide-resistant crops and their development strategies[J]. Journal of Agricultural Biotechnology，2010，18 （1）： 114-125.
[3]Duke S O. Perspectives on transgenic，herbicide-resistant crops in the United States almost 20 years after introduction[J]. Pest Management Science，2015，71（5）：652-657.
[4]Vila-Aiub M M，Balbi M C，Gundel P E，et al. Evolution of glyphosate-resistant johnsongrass （Sorghum halepense） in glyphosate-resistant soybean[J].Weed Science，2007，55（6）：566-571.
[5]Comai L. 5-Enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase resistant à linhibition， production et utilisation：EP 0115673 A2[P]. 1984-08-15.
[6]Barry G F，Kishore G M，Padgette S R，et al. Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases： US05633435[P]. 1997-05-27.
[7]Denny R B. Method and syetem for creating astronomical observing plants for automated observatories：US20060224324A1[P]. 2006-10-05.endprint
[8]Dick，Elaine Q，John R，et al. Glyphosate degrading bacteria：WO/1992/019719[P]. 1992-11-12.
[9]Barry G F. Phosphonate metabolizing plants：WO/1999/027152[P]. 2000-05-25.
[10]Castle L A，Dan S，Giver L，et al. Novel glyphosate-N-acetyltransferase（GAT） genes：WO/2003/092360[P]. 2003-11-13.
[11]Balthazor，Terry M. Process for the preparation of a glyphosate product：US04654429[P]. 1987-03-31.
[12]Takase，Masayuki，Yoshida，et al. Herbicidal composition：EP86117038.9[P]. 1987-08-19.
[13]Lira J M，Wright T R，Hey T D，et al. Constructs for expressing herbicide tolerance genes，related plants，and related trait combinations：WO/2009/152359[P]. 2009-12-17.
[14]Gocal G F W，Beetham P R，de Schopke A，et al. Mutated protoporphyrinogenix oxidase（PPX） genes：US20120122223A1[P]. 2012-05-17.
[15]Gocal G F W，Beetham P R，De Schopke A，et al. Mutated protoporphyrinogenix oxidase（PPX） genes：EP2600710[P]. 2013-06-12.
[16]Chen F，Zhao A，Gregory. Novel herbicide resistance gene：US20130109075A1[P]. 2013-05-02.
[17]Lira J M，Snodderley E，Robinson A E，et al. Uses and detection of herbicide resistance genes for resistance to aryloxyalkanoate herbicides：US09062284B2[P]. 2015-06-23.
[18]Wright T，Lira J M，Walsh T A，et al. Novel herbicide resistance genes：EP2484767A1[P]. 2012-08-08.
[19]Albert H，Bermudez E R，Castle L A，et al. Compositions and methods comprising sequences having hydroxyphenylpyruvate dioxygenase （HPPD） activity：US09187761B2[P]. 2015-11-17.
[20]Albert H，Bermudez E R，Castle L A，et al. Compositions and methods comprising sequences having hydroxyphenylpyruvate dioxygenase （HPPD） activity：US09187761B2[P]. 2015-11-17.
[21]Clemente T E，Dumitru R，F(xiàn)eng P C C，et al. Modified DMO enzyme and methods of its use：US07884261B2[P]. 2011-02-08.
[22]Walsh T A，Hicks G，Honma M，et al. Resistance to auxinic herbicides：US8071847[P]. 2011.
[23]Shen Z C，Lin Z Y. Herbicide resistant gene and use thereof： WO/2012/068966[P]. 2012-05-31.
[24]Haley S，Ostlie M，Valdez V A，et al. Acetyl co-enzyme a carboxylase herbicide resistant plants：WO/2012/106321[P]. 2012-08-09.
[25]Hinga M，Griffin S，Moon M S，et al. Methods and compositions to produce rice resistant to accase inhibitors：WO/2013/016210[P]. 2013-01-31.
[26]Hain R，Johann G，Donn G. USe of als inhibitor herbicides for control of unwanted vegetation in ALS inhibitor herbicide tolerant beta vulgaris plants：WO/2012/049266[P]. 2012-04-19.endprint
[27]Alibhai M F，Cajacob C，F(xiàn)eng P C C，et al. Glyphosate resistant class I 5-endolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase （EPSPS）：US20100197498A1[P]. 2010-08-05.
[28]Hoffman T，Parkhurst D M，Zhou N，et al. Stacked herbicide tolerance event 8264.42.32.1，related transgenic soybean lines，and detection thereof：WO/2013/010094[P]. 2013-01-17.
[29]Kaijalainen S，Koivu K，Kuvshinov V，et al. Herbicide resistant camelina sativa：WO/2010/147636[P]. 2010-12-23.
[30]Kinney A J，Stecca K L，Meyer K. Soybean event DP-305423-1 and compositions and methods for the identification and/or detection thereof：US08609935B2[P]. 2013-12-17.
[31]Sathasivan K， Murai N. Mutant acetolactate synthase gene from Arabidopsis thaliana for conferring imidazolinone resistance to crop plants：US06225105[P]. 2001-05-01.
[32]Gioia P. Herbicidal composition comprising and aminophosphate or aminophosphonate salt and a betaine：US20080103047A1[P]. 2008-05-01.
[33]Gocal G F W，Knuth M E，Beetham P R. EPSPS mutants：US08268622B2[P]. 2012-09-18.
[34]Cui H，Liang Y，et al. Tonoplast sodium-hydrogen anti-protein nhx2 of thellungiella halophila and coding gene and use thereof：WO/2014/172825[P].2014-10-30.
[35]Han G，Jiang F，Deng D，et al. Synthetic glyphosate-resistant gene and use thereof： WO/2013/152624A1[P]. 2013-10-17.
[36]Brown A J，Byrne J F，Cole R H，et al. Transgenic Brassica event MON 88302 and methods of use thereof：US8816156[P]. 2014.
[37]Hipskind J，Burgin K，Jain R，et al. Soybean event syht0h2 and compositions and methods for detection thereof：US20140201860A1[P]. 2014.
[38]Cui Y C，Hoffman T，Parkhurst D M，et al. Insect resistant and herbicide tolerant breeding stack of soybean event PDAB9582.814.19.1 and PDAB4468.04.16.1：EP2736322A1[P]. 2014-06-04.
[39]Cui Y，Hoffman T，Zhou N，et al. Stacked herbicide tolerance event 8264.44.06.1，related transgenic soybean lines，and detection thereof：US09540655B2[P]. 2017-01-10.
[40]Unkefer P J，Knight T J，Anderson P S. Transgenic plants with enhanced growth characteristics：EP2334166A2[P]. 2011-06-22.
[41]Chen M，Lin M，Dun B Q，et al. EPSP synthase gene for Zymomonasmobilis glyphosate and application therefor： CN 2005.
[42]林 敏，劉 柱. 可變鹽單胞菌高抗草苷膦的EPSP合酶及其編碼序列：CN1664095[P]. 2005-09-07.
[43]張 維，王 琳，吳 港，等. 耐輻射沙漠紅細(xì)菌及其應(yīng)用：CN103911318A[P]. 2014-07-09.
[44]陸 偉，燕永亮，戰(zhàn)崳華，等. 一種高耐受草甘膦的EPSP合酶及其應(yīng)用：CN105543188A[P]. 2016-05-04.
[45]程海剛. 抗草甘膦基因（EPSPS）的克隆與功能驗證[D]. 烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.endprint
[46]王國英，曹高燚，劉允軍. 一種高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼基因和應(yīng)用：CN103484438A[P]. 2014-01-01.
[47]強 勝，毛嬋娟，陳世國，等. 一種具有草甘膦耐性的基因及其應(yīng)用：CN103436547A[P]. 2013-12-11.
[48]彭日荷，姚泉洪，熊愛生，等. 水生拉恩氏菌的EPSP合酶基因AroA-Ra多位點突變體：CN102559708A[P]. 2012-07-11.
[49]王麗娟，姚泉洪，彭日荷. 源于海棲熱袍菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因及其應(yīng)用：CN105087611A[P]. 2015-11-25.
[50]陶 波，金龍國，于海濤，等. 一種源自黃曲霉的抗草甘膦相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用：CN105586324A[P]. 2016-05-18.
[51]陶 波，邱麗娟，邵百惠，等. 一種源自假絲酵母的抗草甘膦相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用：CN105505895A[P]. 2016-04-20.
[52]劉 柱. 可變鹽單胞菌中草甘膦抗性EPSP合酶新基因克隆、大腸桿菌表達(dá)及其抗性機制的研究[D]. 成都：四川大學(xué)，2004.
[53]王志興，王旭靜，唐巧玲，等. 耐草甘膦轉(zhuǎn)基因陸地棉BG2-7的檢測方法及側(cè)翼序列：CN106191218A[P]. 2016-12-07.
[54]邱麗娟，郭兵福，郭 勇，等. 一種抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆及其制備方法與應(yīng)用：CN105505981A[P]. 2016-04-20.
[55]趙團結(jié)，費云燕，蓋鈞鎰. 腸桿菌耐草甘膦基因argF、編碼蛋白及其應(yīng)用：CN105177029A[P]. 2015-12-23.
[56]徐培林，步懷宇，何 鳴，等. 草甘膦降解酶基因和含該基因的載體：CN1392261[P]. 2003-01-22.
[57]胡茂龍，浦惠明，戚存扣 等. 抗咪唑啉酮類除草劑的甘藍(lán)型油菜突變基因及其應(yīng)用：CN101935667A[P]. 2011-01-05.
[58]胡茂龍，浦惠明，龍衛(wèi)華 等. 一種甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因及其應(yīng)用：CN103266118A[P]. 2013-08-28.
[59]陳竹鋒，王承旭，柳 威，等.水稻抗除草劑蛋白及其在植物育種中的應(yīng)用：CN102586215A[P]. 2012-07-18.
[60]張保龍，陳天子，凌溪鐵，等. 一種ALS突變型基因及其在抗除草劑方面的應(yīng)用：CN105779479A[P]. 2016-07-20.
[61]Xu P L，Bu H Y，He M，et al. Glyphosate degrading enzyme gene and carrier containing said gene： 1392261[P]. 2003-01-22.
[62]朱 禎，周 敏. 一種水稻EPSP合酶突變體及其編碼基因、獲得方法與應(yīng)用：CN1810962[P]. 2006-08-02.
[63]Shen Z C. Glyphosate-resistant gene and application thereof： CN101619318A[P]. 2010-11-15.
[64]沈志成，林朝陽，徐曉麗，等. 高抗草甘膦突變基因及其改良方法和應(yīng)用：CN102146371A[P]. 2011-08-10.
[65]田永生，許 晶，姚泉洪，等. 來源于蘋果的EPSP合酶多位點突變體及其編碼基因與應(yīng)用：CN103205404A[P]. 2013-07-17.
[66]田永生，許 晶，姚泉洪，等. 草甘膦抗性提高的葡萄EPSPS突變體的制備及其應(yīng)用：CN104232600A[P]. 2014-12-24.
[67]劉 堅. 抗草甘膦基因MTP-SMG2-EPSPS及其在培育抗草甘膦玉米中的應(yīng)用：CN103409445A[P]. 2013-11-27.
[68]夏蘭琴，王根平，林敏，等. 抗草甘膦基因、專用表達(dá)載體及其在獲得抗草甘膦轉(zhuǎn)基因小麥中的應(yīng)用：CN104004777A[P]. 2014-08-27.
[69]郭三堆，孫 豹，張 銳，等. 一種含有草甘膦抗性基因的表達(dá)載體及其應(yīng)用：CN103981199A[P]. 2014-08-13.
[70]康越景，郭明欣，劉海利，等. 用于檢測除草劑耐受性玉米植物DBN9877的核酸序列及其檢測方法：CN104878090A[P]. 2015-09-02.
[71]賴錦盛，趙海銘，宋偉彬. 一種高粱抗草甘膦5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）及其應(yīng)用：CN102911950A[P]. 2013-02-06.
[72]賴錦盛，趙海銘，宋偉彬，等. 轉(zhuǎn)maroACC基因抗除草劑玉米 CC-2的側(cè)翼序列及其應(yīng)用：CN105331725A[P]. 2016-02-17.
[73]Cui H，He Y，Wang J，et al. Cotton plant event a2-6 and primer and method for use in detection thereof： WO/2013/170399[P]. 2013-11-21.
[74]王建勝，崔洪志，何云蔚. 抗草甘膦棉花事件以及用于其檢測的引物和方法：CN106244587A[P]. 2016-12-21.
[75]張曉東，江 穎，張立全，等. 抗草甘膦篩選標(biāo)記基因及其在玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的應(yīng)用：CN105886521A[P]. 2016-08-24.
[76]Shen Z C，Lin C Y，et al. High resistance to glyphosate mutant gene and its improved method and application：WO/2012/097720[P]. 2012-07-26.
[77]張先文，王東芳，沈志成. 一種具有草甘膦和草丁膦復(fù)合抗性的融合基因、編碼蛋白及其應(yīng)用：CN106318958A[P]. 2017-01-11.
[78]蘇 軍，王 鋒，胡太蛟，等. 一種雙表達(dá)盒高抗草甘膦載體及其在水稻上的應(yīng)用：CN105861541A[P]. 2016-08-17.endprint
猜你喜歡
今日農(nóng)業(yè)(2019年15期)2019-01-03 12:11:33
現(xiàn)代園藝(2017年19期)2018-01-19 02:50:21
商(2016年27期)2016-10-17 07:16:17
今傳媒(2016年9期)2016-10-15 22:52:08
考試周刊(2016年79期)2016-10-13 22:45:40
新聞世界(2016年10期)2016-10-11 20:09:12
河南科技(2016年8期)2016-09-03 08:08:22
發(fā)明與創(chuàng)新(2016年5期)2016-08-21 13:42:50
營銷界(2015年23期)2015-02-28 22:06:18
中國質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)報(2013年8期)2013-03-11 19:54:07