鄧 宇 , 何學(xué)謙 ， 陳紅軍 ， 張 政

(西昌學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，四川 西昌 615013)

牛病毒性腹瀉病毒XC株的分離與鑒定

鄧 宇 , 何學(xué)謙 ， 陳紅軍 ， 張 政

(西昌學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，四川 西昌 615013)

將 BVDV陽性血清樣品接種MDBK細(xì)胞，結(jié)果分離出1株BVDV 。采用MDBK細(xì)胞培養(yǎng)法、直接免疫熒光、RT-PCR與TCID50等方法對分離毒株進(jìn)行鑒定分析。結(jié)果表明，分離株在MDBK細(xì)胞上盲傳至10代均未出現(xiàn)細(xì)胞病變；在直接免疫熒光試驗(yàn)中呈陽性；RT-PCR擴(kuò)增均獲得5'-UTR、Npro預(yù)期大小DNA片段；分離株滴度為10-5.9TCID50/0.2 mL。進(jìn)化分析顯示，該分離株屬于BVDV-1m。以上結(jié)果推斷，成功分離鑒定1株BVDV，該分離株為非致細(xì)胞病變型BVDV-1m，命名為BVDV-1 XC株，為研究致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

牛病毒性腹瀉病毒 ； 分離鑒定 ； 直接免疫熒光試驗(yàn) ； 非致細(xì)胞病變型

牛病毒性腹瀉病毒-1(Bovineviraldiarrheavirus-1，BVDV-1)、牛病毒性腹瀉病毒-2(Bovineviraldiarrheavirus-2，BVDV-2)屬于黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)成員[1]，與豬瘟病毒(Classicalswinefevervirus， CSFV)、邊界病毒(Borderdiseasevirus，BDV)同為一屬，存在抗原交叉反應(yīng)。這兩種病毒(BVDVs)的基因組均為單股正鏈RNA，其大小約為12.3 kb，在基因分型方面，通常根據(jù)BVDVs的5'-UTR， BVDV-1可分為BVDV-1a～BVDV-1u[2-5]，BVDV-2可分為BVDV2a～ BVDV2d[6-7]。在生物型分類方面，基于病毒接種細(xì)胞是否產(chǎn)生病變將BVDVs分為致細(xì)胞病變型(Cytopathic effects，CPE)、非致細(xì)胞病變型(Noncytopathic，NCP)兩種生物型。

本研究從西昌某牛場臨床健康的奶牛血清樣品中分離出一株BVDV毒株，將其命名為BVDV-1 XC株，生物型為NCP型。這為NCP型BVDV致病機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、標(biāo)準(zhǔn)毒株和主要試劑 MDBK細(xì)胞、BVDV 標(biāo)準(zhǔn)陽性對照毒株NADL，本實(shí)驗(yàn)室保存。病毒RNA提取試劑盒、2×PCRTaqMix等，購自天根生化科技(北京)有限公司；AMV反轉(zhuǎn)錄酶、克隆載體pMD19-T等，購自TaKaRa生物技術(shù)公司；牛血清、PBS、RPMI-1640培養(yǎng)基來自Hyclone產(chǎn)品；FITC標(biāo)記BVDVs抗體來自美國VMRD公司產(chǎn)品。

1.2 樣品來源與病毒分離 牛血清樣品于2015年9月采自四川西昌某牛場臨床健康的奶牛，將牛血清加入2倍PBS充分混勻，凍融3次，用0.22 μm濾器過濾，加入雙抗(1 000 IU(μg)/mL)，接種至基本長滿單層的MDBK，37 ℃，5%CO2吸附2 h，期間輕搖2～3次后棄上清，PBS洗滌2次，加入含10%牛血清的RPMI-1640在37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，72 h收集細(xì)胞培養(yǎng)物。盲傳至10代，每代次細(xì)胞培養(yǎng)物置-75 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 分離株的鑒定

1.3.1 RT-PCR鑒定 根據(jù)參考文獻(xiàn)[5, 11-12]，設(shè)計(jì)合成引物，建立BVDV5'-UTR RT-PCR以及NproRT-PCR檢測方法，對收集的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行檢測，克隆測序。

1.3.2 抗原性鑒定(直接免疫熒光試驗(yàn)) 第4代分離毒株接種至基本長滿單層的6孔板MDBK細(xì)胞，將BVDV NADL株、生理鹽水分別設(shè)為陽性對照、陰性對照。置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，根據(jù)FITC標(biāo)記BVDV抗體試劑盒的操作說明書做直接免疫熒光試驗(yàn)(FA)，于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.3.3 病毒TCID50測定 用含2%牛血清細(xì)胞培養(yǎng)基將分離毒株第5代病毒作10-1～10-8倍比稀釋，分別接種于96孔細(xì)胞板，每一稀釋度平行接4孔，200 μL/孔。同時設(shè)定4孔加入2%牛血清細(xì)胞培養(yǎng)基作為陰性對照， 37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)72 h后，參照1.3.2方法進(jìn)行染色、判定，記錄熒光呈陽性的孔數(shù)及其稀釋度，采用k?rber公式計(jì)算TCID50。

1.3.4 遺傳進(jìn)化關(guān)系分析 采用Mega5.1軟件對BVDV XC株 5′-UTR、Npro與GenBank中已公布的瘟病毒參考株相應(yīng)的序列進(jìn)行多序列比對，構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(用該軟件參數(shù)：N-J法，Kimura 2-parameter，Transitions + Transversions，Bootstrap值1 000)分別構(gòu)建5′-UTR(245 bp)、Npro(504 bp)，確定分離株與瘟病毒屬其他毒株之間進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 分離毒株細(xì)胞傳代培養(yǎng)及生物型鑒定 凍融3次的牛血清樣品接種MDBK細(xì)胞，盲傳至第8代，接種樣品細(xì)胞(圖1C)72 h后仍為NCP，與陰性對照組細(xì)胞(圖1B)生長狀態(tài)基本類似，無明顯差異，結(jié)果表明，該分離株屬于NCP生物型。標(biāo)準(zhǔn)陽性對照BVDV NADL株接種后72 h后出現(xiàn)明顯CPE(圖1A)，細(xì)胞出現(xiàn)明顯空泡、圓縮、拉網(wǎng)等現(xiàn)象。

圖1 細(xì)胞傳代培養(yǎng)結(jié)果 (200×)

2.2 分離株 RT-PCR鑒定結(jié)果 采用RT-PCR對病毒盲傳的第4代、第8代進(jìn)行5'-UTR檢測，結(jié)果均出現(xiàn)約309 bp大小的特異性片段(圖2)，克隆、測序特異性片段，NCBI Blast結(jié)果顯示，獲得的序列為BVDV-1序列。

對分離株盲傳第4代、第8代Npro基因進(jìn)行RT-PCR檢測，如圖3所示，結(jié)果均擴(kuò)增出約504 bp 大小的特異性片段，經(jīng)克隆、測序，NCBI Blast顯示，分離株為BVDV-1。

2.3 抗原性鑒定及毒力測定(TCID50) 分離株第4代感染MDBK細(xì)胞72 h后，用FA方法檢測感染細(xì)胞，結(jié)果顯示，被分離株感染的細(xì)胞、陽性對照，均出現(xiàn)特異性熒光反應(yīng)。陰性對照無熒光反應(yīng)(圖4C)。

采用所建立的FA進(jìn)行毒力測定，結(jié)果顯示，0.2 mL分離株細(xì)胞培養(yǎng)上清中含105.9TCID50。

2.4 遺傳進(jìn)化分析

2.4.1 分離株 5'-UTR進(jìn)化樹構(gòu)建 根據(jù)BVDV-1 5'-UTR序列所建立的進(jìn)化樹(圖4)顯示，分離株XC與BVDV-1m參考株ZM-95、LZ05在一個分支上。與其他BVDV-1參考株序列進(jìn)行核苷酸同源性分析發(fā)現(xiàn)，該分離株與LZ05 、ZM-95核苷酸同源最高，分別為98.4%、95.5%，其可信度也達(dá)到73.0%、80.0%。

2.4.2 分離株Npro進(jìn)化樹構(gòu)建 對BVDV-1 Npro的基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，其結(jié)果表明，BVDV XC分離株與BVDV-1m參考株ZM-95、TJ0801同在一個分支，其可信度達(dá)到99.0%(圖5)，核苷酸同源性分析表明，分離株與BVDV-1m參考株ZM-95、TJ0801同源性也是最大的，達(dá)到了94.4%、93.1%。

圖2 分離株5′-UTR RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖3 分離株Npro RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖4 BVDV XC株5'-UTR進(jìn)化分析

圖5 BVDV XC株Npro進(jìn)化分析

3 討論

BVDVs自20世紀(jì)80年代首次在我國報(bào)道以來[11]，在我國廣泛流行，部分牛場血清陽性率高達(dá)100%[12-13]。CP型與NCP型BVDVs均可引起牛只感染，但NCP 型是當(dāng)前牛群中主要流行的生物型，唯有NCP能導(dǎo)致機(jī)體持續(xù)性感染[14]。由于本次試驗(yàn)獲得的分離株BVDV-1 XC是臨床健康牛的血清樣品分離的NCP毒株，為研究BVDVs持續(xù)性感染致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

采用熒光標(biāo)記抗體對分離株進(jìn)行抗原性檢測結(jié)果來看，在細(xì)胞漿內(nèi)可以觀察到綠色熒光，這符合BVDVs在感染細(xì)胞漿內(nèi)完成復(fù)制生物學(xué)特征[15]。采用本試驗(yàn)所建立的免疫熒光試驗(yàn)對分離株XC毒力進(jìn)行測定，結(jié)果為10-5.9TCID50/0.2 mL，但其毒力在牛體致病力如何，有待動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

BVDVs亞型分類方法主要依據(jù)病毒的5'-UTR、Npro、E2基因進(jìn)行[16-18]，近3年來流行病學(xué)研究顯示，BVDVs在我國存在不同亞型。Yifei Lang等[19](2014)也發(fā)現(xiàn)，從我國部分地區(qū)分離到的毒株存在9種亞型(BVDV-1a，-1b，-1c，-1d，-1o，-1m，-1p，-1q 與 BVDV-2a)。Mingliang Deng等[20](2015)對我國8省臨床觀察健康的奶牛、肉牛、牦牛、水牛等1 379份血清樣品遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，牛群中主要有 BVDV-1b(33.06%)， BVDV-1m (49.19%)， BVDV-1u (17.74%)等4種亞型。 陳銳等[13](2016)發(fā)現(xiàn)，新疆散養(yǎng)肉牛中主要流行BVDV-1q和BVDV-1f，內(nèi)蒙主要流行BVDV-1m，甘肅流行的是一種新的亞型BVDV-1u。從這些研究報(bào)道不難看出，BVD-1m是我國目前主要流行的一種亞型。

本試驗(yàn)為了確定分離株亞型，對分離株5'-UTR、Npro兩個基因核苷酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示，分離株XC的這兩種不同基因序列均與BVDV-1m參考株在同一分支。核苷酸同源性分析，發(fā)現(xiàn)分離與BVDV-1m參考株的同源型均高于與BVDV-1其他參考株，進(jìn)一步證實(shí)分離株XC屬于BVDV-1m亞型。

[1] Adams M, Hendrickson R, Dempsey D,etal. Tracking the changes in virus taxonomy [J]. Archives of virology, 2015, 160(5): 1 375-1 383.

[2] Liu L, Xia H, Wahlberg N,etal.classification and evolutionary insights into pestiviruses [J]. Virology, 2009, 385(2): 351-357.

[4] Mao L, Li W, Yang L,etal. Primary surveys on molecular epidemiology of bovine viral diarrhea virus 1 infecting goats in Jiangsu province, China [J]. BMC Veterinary Research, 2016, 12(1): 181.

[5] Vilcek S, Durkovic B, Kolesárová M,etal. Genetic diversity of international bovine viral diarrhoea virus (BVDV) isolates: identification of a new BVDV-1 genetic group [J]. Veterinary research, 2004, 35(5): 609-615.

[6] Scherer C, Flores E, Weiblen R,etal. Experimental infection of pregnant ewes with bovine viral diarrhea virus type-2 (BVDV-2): effects on the pregnancy and fetus [J]. Veterinary Microbiology, 2001, 79(4): 285-299.

[7] Tao J, Wang Y, Wang J,etal. Identification and genetic characterization of new bovine viral diarrhea virus genotype 2 strains in pigs isolated in China [J]. Virus genes, 2013, 46(1): 81-87.

[8] Shi H, Kan Y, Yao L,etal. Identification of Natural Infections in Sheep/Goats with HoBi‐like Pestiviruses in China [J]. Transboundary and Emerging Diseases, 2016, 63(5): 480-484.

[9] 鄧宇, 藺濤, 張榮, 等. 豬源牛病毒性腹瀉病毒套式 PCR 檢測方法的建立 [J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2012, 32(005): 654-657.

[10] Kim S G, Anderson R R, Jin Z Y,etal. Genotyping and phylogenetic analysis of bovine viral diarrhea virus isolates from BVDV infected alpacas in North America [J]. Veterinary microbiology, 2009, 136(3): 209-216.

[11] 李佑民, 劉振潤. 吉林省某奶牛場暴發(fā)牛病毒性腹瀉——粘膜病及其病毒分離的初步研究 [J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報(bào), 1981,1( 3): 62-64.

[12] 王淑娟, 王華, 宋曉暉, 等. 牛病毒性腹瀉/黏膜病的診斷流行病學(xué)調(diào)查及防控 [J]. 中國獸醫(yī)雜志, 2014,51(3): 38-40.

[13] 陳銳, 范學(xué)政, 朱元源, 等. 西部散養(yǎng)肉牛病毒性腹瀉病毒流行及遺傳變異 [J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 49(13): 2 634-2 641.

[14] Peterhans E, Bachofen C, Stalder H,etal. Cytopathic bovine viral diarrhea viruses (BVDV): emerging pestiviruses doomed to extinction [J]. Veterinary research, 2010, 41(6): 44.

[15] 王新華, 劉守仁, 張榮興, 等. 牛病毒性腹瀉病毒侵染宿主細(xì)胞的電鏡觀察 [J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2002, 33(5): 501-503.

[16] Ridpath J, Bolin S, Dubovi E. Segregation of bovine viral diarrhea virus into genotypes [J]. Virology, 1994, 205(1): 66-74.

[17] Booth R E, Thomas C J, El-Attar L M,etal.A phylogenetic analysis of Bovine Viral Diarrhoea Virus (BVDV) isolates from six different regions of the UK and links to animal movement data [J]. Veterinary research, 2013, 44(1): 43.

[18] Tajima M, Frey H-R, Yamato O,etal. Prevalence of genotypes 1 and 2 of bovine viral diarrhea virus in Lower Saxony, Germany [J]. Virus research, 2001, 76(1): 31-42.

[19] Lang Y, Gao S, Du J,etal. Polymorphic genetic characterization of E2 gene of bovine viral diarrhea virus in China [J]. Veterinary microbiology, 2014, 174(3): 554-559.

[20] Deng M, Ji S, Fei W,etal. Prevalence study and genetic typing of bovine viral diarrhea virus (BVDV) in four bovine species in China [J]. PloS one, 2015, 10(4): e 0121718.

IsolationandIdentificationofBovineViralDiarrheaVirusXCStrain

DENG Yu , HE Xue-qian , CHEN Hong-jun , ZHANG Zheng

(School of Animal Sicience, Xichang Colleg, Xichang 615013，China)

A BVDV positive sample was propagated in MDBK cells and a BVDV strain was isolated. In this study, cell culture, direct immunofluorescence assay, RT-PCR and TCID50were applied to identify the isolate, and the bioinformatics software was used to analyze the genetic characteristics. Our results indicated that the strain did not cause cytopathic effect(CPE)until the tenth passage on MDBK cells. This isolate infected MDBK cells and showed strong fluorescent signal by the immunofluorescence assay. DNA fragment of 310 bp and 504 bp were amplified by PCR from 5'-UTR and Nproof this isolate. Virus titer of the isolate was 10-5.9TCID50/0.2mL. The homology comparison and phylogenetic analysis of 5'-UTR and Nprobetween BVDV-1 XC strain and representative BVDVs showed that the isolate was in the same group with BVDV-1m. BVDV-1 XC strain is successfully isolated and belongs to BVDV-1m and has noncytopathic effect.

Bovine viral diarrhea virus ; isolation and identification ; direct immune-fluorescence assay ; noncytopathic

S852.65+3

A

0529-6005(2017)10-0038-04

2017-04-07

四川省教育廳自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目(18ZA0523)；四川省科技廳科技支撐項(xiàng)目(2014NZ0113)；攀西動物疫病檢測與防控四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(341B)

鄧宇(1978-)，男，副教授，博士，主要從事獸醫(yī)微生物及其分子生物學(xué)研究，E-mail：dengyu127@163.com