常超越 ， 張召興 ， 李蘊(yùn)玉 ， 賈青輝 ， 閆艷娟 ， 張香齋 ， 李佩國

(河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 河北 秦皇島 066604)

雞源多殺性巴氏桿菌QHP-1株分離鑒定與耐藥性分析

常超越 ， 張召興 ， 李蘊(yùn)玉 ， 賈青輝 ， 閆艷娟 ， 張香齋 ， 李佩國

(河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 河北 秦皇島 066604)

為了確定引起雞急性死亡的病原菌，從臨床病死雞體內(nèi)分離到的一株病原菌，并命名為QHP-1，采用分離培養(yǎng)、純培養(yǎng)、形態(tài)觀察、生化試驗(yàn)等鑒定方法，初步鑒定為多殺性巴氏桿菌。經(jīng)過Kmt1基因序列分析發(fā)現(xiàn)，臨床分離菌株QHP-1與多殺性巴氏桿菌的同源性為100%。動物回歸試驗(yàn)表明，分離的QHP-1株有強(qiáng)的致病性。耐藥性分析結(jié)果：分離菌株QHP-1對頭孢克肟、頭孢曲松、強(qiáng)力霉素、恩諾沙星4種藥物高度敏感；對氟苯尼考、慶大霉素、阿米卡星3種藥物中度敏感；對阿莫西林、氨芐西林、四環(huán)素等5種藥物耐藥。

雞 ; 多殺性巴氏桿菌 ；Kmt1基因 ； 分離鑒定 ； 藥敏試驗(yàn)

2016年10月，秦皇島市昌黎某一養(yǎng)雞場，42日齡雛雞突然發(fā)病和突然死亡，多數(shù)病雞呈急性死亡，病雞出現(xiàn)了嗜睡，精神沉郁、食欲減少或不食、羽毛松亂；有的病雞出現(xiàn)咳嗽癥狀、并且口鼻有黏液性分泌物流出，還伴有腹瀉癥狀，有的昏迷痙攣而死亡。對病死雞進(jìn)行了剖檢，無菌采集病料組織分離鑒定，通過細(xì)菌的常規(guī)鑒定方法和分子生物鑒定的方法確定了引起成年雞死亡的病原菌為多殺性巴氏桿菌，對其進(jìn)行了耐藥性分析。

1 材料與方法

1.1 病料來源 秦皇島昌黎縣某養(yǎng)雞場存欄1萬只，發(fā)病率為18%，對急性死亡的病雞進(jìn)行剖檢，記錄眼觀病理變化。無菌操作采集具有典型病理變化的肝臟、心血、肺臟和脾臟等病料，進(jìn)行了分離鑒定。

1.2 主要試劑與儀器 血液瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、NB營養(yǎng)肉湯，購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片，購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司；美藍(lán)染色液試劑盒，購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；微量發(fā)酵，購自杭州天和微生物試劑有限公司；ID32E腸道菌鑒定試紙條，購自法國梅里埃公司；瓊脂糖、TAE、DL-2 000 Marker、2×TaqMarker Mix，Gold View核酸染液、10×Loading Buffer、樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒，均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 42日齡海藍(lán)褐雛雞8只，購自秦皇島市昌黎某雞場。

1.4 細(xì)菌分離純化 無菌采集的病死雞的肝臟、心血、肺臟和脾臟等病料組織，劃線接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)12～24 h，選取圓形、透明、露珠樣優(yōu)勢生長菌接種劃線普通培養(yǎng)基純化培養(yǎng)后，提取純化培養(yǎng)后優(yōu)勢菌落接種在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中37 ℃、200 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)，并調(diào)取純培養(yǎng)的單菌落涂片，革蘭染色，顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.5 細(xì)菌生化特性鑒定 按說明書進(jìn)行操作，用微量發(fā)酵管和自動生化鑒定系統(tǒng)ID32E腸道菌鑒定試紙條進(jìn)行生化試驗(yàn)。

1.6 細(xì)菌基因組DNA的提取與Kmt1基因的PCR檢測 將純化培養(yǎng)過的分離菌株QHP-1接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)12～16 h，按照樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行提取基因組DNA，參照文獻(xiàn)[1]多殺性巴氏桿菌的Kmt基因序列設(shè)計1對引物，預(yù)擴(kuò)增片段為457 bp，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(50 μL)：2×TaqMarker Mix 25 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2.0 μL, ddH2O 21μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，72 ℃中延伸10 min，共30個循環(huán)。取出5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中，150 V電泳20 min，觀察PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶，將DNA回收送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果與GenBnak數(shù)據(jù)庫中登錄基因序列進(jìn)行同源性比較分析。

1.7 致病性試驗(yàn) 將雛雞分為2組，每組4只，第1組為試驗(yàn)組每只雛雞腹腔注射劑量為0.25 mL(108CFU/mL)；第2組接種等量的營養(yǎng)肉湯作為陰性對照。觀察發(fā)病及死亡情況，對于死亡的雛雞剖檢，無菌取其肝臟、心血、肺臟等病料組織分離并鑒定。

1.8 藥敏試驗(yàn) 按照美國臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(NCCLS)推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進(jìn)行試驗(yàn)操作和結(jié)果判斷[7]。挑取單菌落接種于營養(yǎng)肉湯中，37 ℃震蕩培養(yǎng)至菌濃度達(dá)到0.5麥?zhǔn)媳葷峁軙r，用無菌棉簽沾取菌液均勻涂布于平板上，貼上藥敏紙片，每個藥物做3個重復(fù)，置37 ℃培養(yǎng)16～18 h，觀察結(jié)果。測量抑菌圈直徑，求其平均值。

2 結(jié)果分析

2.1 病死雞剖檢結(jié)果 病死雞肺充血、出血、水腫；肝臟顏色淡、腫大明顯，表面存在大量灰白色壞死點(diǎn)；心冠脂肪及心外膜有大量出血點(diǎn)；有的病死雞出現(xiàn)腺胃乳頭水腫，乳頭出血點(diǎn)；小腸黏膜嚴(yán)重出血，腸腔內(nèi)存在大量黃色的黏液。

2.2 細(xì)菌形態(tài)特征與培養(yǎng)特性 采集肺臟、肝臟、心血組織經(jīng)鮮血瓊脂平板培養(yǎng)，可見均勻一致的灰白色、圓形、濕潤、不溶血的露珠樣小菌落，在普通瓊脂上生長貧瘠。涂片染色鏡檢，可見革蘭陰性短桿菌，散在或成雙，美藍(lán)染色呈典型的兩極濃染球桿菌，呈卵圓形，中央不易著色(見圖1)。

圖1 多殺性巴氏桿菌QHP-1株美藍(lán)染色鑒定結(jié)果 (1 000×)

2.3 細(xì)菌生化特性鑒定 分離菌株QHP-1能發(fā)酵葡萄糖、果糖、d-甘露醇產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不發(fā)酵麥芽糖、蔗糖、鼠李糖，精氨酸雙水解酶陰性，鳥氨酸脫羧酶、接觸酶、氧化酶為陽性，吲哚試驗(yàn)為陽性。經(jīng)ATB自動生化儀鑒定分析系統(tǒng)檢測分析，鑒定結(jié)果為多殺性巴斯德菌，結(jié)果見表1，評定結(jié)果合格率為 99.5%。

2.4 多殺性巴氏桿菌Kmt基因的PCR擴(kuò)增與測序 分離菌株QHP-1，進(jìn)行多殺性巴氏桿菌種特異性Kmt1基因的 PCR 鑒定，分離菌株QHP-1擴(kuò)增出大約為457 bp的目的條帶(見圖2)。將目的片段回收進(jìn)行測序，測序結(jié)果與GenBank DNA序列數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的多殺性巴氏桿菌Kmt基因序列同源性為100%，確定了分離菌株QHP-1為多殺性巴氏桿菌。

表1 分離菌株生化特性鑒定結(jié)果

+：陽性；-：陰性

圖2 多殺性巴氏桿菌QHP-1株Kmt基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.5 致病性試驗(yàn) 試驗(yàn)組雛雞12 h后發(fā)病死亡。無菌采集肺臟、肝臟、心血組織等進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果顯示,所分離菌與QHP-1株一致。對照組4只雛雞健康存活，表明該菌有致病性。

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 分離菌株QHP-1對頭孢克肟、頭孢曲松、強(qiáng)力霉素、恩諾沙星4種藥物高度敏感；對氟苯尼考、慶大霉素、阿米卡星3種藥物中度敏感；對阿莫西林、氨芐西林、四環(huán)素等5種藥物耐藥。結(jié)果見表2。

3 討論

禽巴氏桿菌病是危害禽類主要的細(xì)菌性傳染病，該病原為條件致病菌，血清型具有16種，尤其是雞一旦發(fā)病，多數(shù)呈急性型，不易控制，相關(guān)的滅活疫苗只對相同的血清型有一定的保護(hù)率，對其他的血清型效果不明顯[3-5]。本試驗(yàn)從病死的雛雞中分離了1株病原菌QHP-1，通過分離培養(yǎng)、純培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察，生化試驗(yàn)等多種鑒定方法，初步確定分離菌QHP-1為多殺性巴氏桿菌。相關(guān)文獻(xiàn)報道了Kmt1基因是多殺性巴氏桿菌的特異性基因，利用多殺性巴氏桿菌的Kmt1基因特異性，已經(jīng)建立多種檢測多殺性巴氏桿菌的PCR方法[6-7]。本實(shí)驗(yàn)也選用多殺性巴氏桿菌的特異性的Kmt1基因?qū)Ψ蛛x菌株QHP-1進(jìn)行了PCR檢測，與GenBnak數(shù)據(jù)庫中登錄Kmt1基因基因序列進(jìn)行同源性為100%，從分子生物學(xué)角度證實(shí)了該菌株為多殺性巴氏桿菌。動物回歸性試驗(yàn)顯示分離菌株QHP-1有很強(qiáng)的致病性。

表2 分離菌株QHP-1藥敏試驗(yàn)結(jié)果

R：耐藥；I：中介；S：敏感

根據(jù)多殺性巴氏桿菌病流行特點(diǎn)，更有效的控制手段是免疫接種和藥物治療，應(yīng)該研制多價多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗、 弱毒疫苗和亞單位疫苗， 以有效的預(yù)防該病的發(fā)生[8]。本試驗(yàn)13種常用的抗生素對分離菌株QHP-1進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，對頭孢克肟、頭孢曲松、強(qiáng)力霉素、恩諾沙星4種藥物高度敏感；對氟苯尼考、慶大霉素、阿米卡星3種藥物中度敏感；對阿莫西林、氨芐西林、四環(huán)素等5種藥物耐藥，說明了分離菌株QHP-1存在很強(qiáng)的耐藥性。于成接等[9]報道了從廣西地區(qū)分離禽巴氏桿菌對環(huán)丙沙星、恩諾沙星、四環(huán)素等藥物敏感；王彩麗等[10]報道了禽巴氏桿菌只對先鋒噻肟高度敏感；對其他藥物存在很強(qiáng)的耐藥性。與本試驗(yàn)結(jié)果存在差異性，可能與多殺性巴氏桿菌的血清型、地區(qū)有關(guān)。因此當(dāng)養(yǎng)殖場發(fā)生疾病時，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行科學(xué)用藥，降低耐藥性，才能獲得良好的治療效果。

[1] 么乃全,李斯齊,邸海洋, 等.火雞多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及致病性研究[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2016, 46(02): 242-246.

[2] National Committee for Clinical Laboartory Standards, Perfomrance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility test for bacteria isolated from anima1s:approved standard, seconded, NCCLS document M31-A2[J].Wayne,USA，2000,49(21)：105-126.

[3] 李浩,劉陽,李長安.多殺性巴氏桿菌病研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)雜志, 2011,30(2):31-33.

[4] 彭金菊,禤敏瑩,王冬琴,等,多殺性巴氏桿菌病研究進(jìn)展[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2016,3: 29-31.

[5] 劉紅玉,邵周伍林, 李剛,等,一株鵝源巴氏桿菌的分離鑒定及耐藥性分析[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2014,44(02):119-123.

[6] 王帥濤,宮強(qiáng),秦翠麗,等.多殺性巴氏桿菌毒力因子、 免疫原及重要基因研究進(jìn)展[J].中國畜牧獸醫(yī),2010,37(3):186-188.

[7] 曾靜雯,劉慧芳,沈琴芳,等.多殺性巴氏桿菌鑒定與特性研究的分子生物學(xué)方法[J].中國獸藥雜志,2006,40(4):41-44.

[8] 顏赟,刁有祥,程彥麗,等,一株鴨源巴氏桿菌強(qiáng)毒株的分離鑒定及致病性研究[J].中獸醫(yī)科學(xué),2010,40(6): 584-588.

[9] 于成接,丁優(yōu)玲,華亞峰,等.禽霍亂巴氏桿菌的分離 鑒定與致病性研究[J].中國獸醫(yī)雜志,2013,49(2): 21-23.

[10] 王彩麗,榮俊,王化俊,等.雞多殺性巴氏桿菌的鑒定和藥物敏感試驗(yàn)[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,49(5): 1 162-1 165.

Isolation,IdenticationandDrugresistanceanalysisofPasteurellaMultocidaQHP-1isolatedfromchicken

CHANG Chao-yue , ZHANG Zhao-xing , LI Yun-yu , JIA Qing-hui , YAN Yan-juan , ZHANG Xiang-zhai , LI Pei-guo

(Key Laboratorry of preventive Veterinary Medicine in Heibei Province, Hebei Normal University of Science and Technology, Qinhuangdao 066604, China)

To identify the pathogen which caused serious acute death in chickens，The aim of this study was to identify a suspected pathogenic bacteria isolated from the clinical death cases of chicken, and named QHP-1.The suspected bacteria strain was analyzed by the methods of isolating culture and morphological observation. The results showed that the suspected strain wasP.multocida. TheKmt1gene sequence analysis showed that the homology between clinical isolates QHP-1 and Pasteurella multocida was 100%. The results of the animal regression test showed that the isolated QHP-1 strains had strong pathogenicity. Results of drug susceptibility test indicated that the isolate strain was highly sensitive to spore cefixime,ceftriaxone,doxycycline, enrofloxacin, moderately sensitive to florfenicol, gentamicin, Amikacin; the 5 kinds of drugs were not sensitive to amoxicillin, ampicillin and tetracycline ete.

Chicken ;Pasteurellamultocida;Kmtgene ; Isolation and identification ; Drug sensitivity test

LI Pei-guo

S831

A

0529-6005(2017)10-0048-03

2017-01-10

河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系蛋雞產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊崗位(HBCT2013090203)；河北省科技支撐項(xiàng)目(12220412D)

常超越(1990-)，女，碩士生，主要從事動物病原微生物及其防控研究，E-mail：changchaoyue2016@163.com;張召興(1988-),男，碩士生，主要從事動物病原微生物及其防控研究，E-mail：keshiyjszzx0224@126.com

注：張召興與常超越對本文具有同等貢獻(xiàn)

李佩國，E-mail: lpeiguo@163.com