劉碧源，申可佳，申奏秦旋，付靈梅，熊 桀

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

護(hù)卵湯對(duì)慢性應(yīng)激超排卵小鼠卵巢TGF-β1，P-Smad3及FSHR mRNA表達(dá)的影響

劉碧源，申可佳*，申奏秦旋，付靈梅，熊 桀

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

目的觀察護(hù)卵湯對(duì)慢性應(yīng)激超排卵小鼠卵巢轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor beta 1,TGF-β1）、信號(hào)蛋白P-Smad3及卵泡刺激素受體（follicle-stimulating hormone receptor,FSHR）mRNA表達(dá)的影響。方法建立慢性應(yīng)激小鼠模型，造模成功后，隨機(jī)分為模型組、護(hù)卵湯組和生長(zhǎng)激素組，另設(shè)正常組。在超排卵第3天和注射絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin,HCG）24 h后，檢測(cè)各組卵巢TGF-β1、P-Smad3及FSHR mRNA表達(dá)。結(jié)果與模型組比較，在超排卵第 3天，護(hù)卵湯組和生長(zhǎng)激素組TGF-β1、P-Smad3及 FSHR mRNA表達(dá)均顯著升高（P＜0.01或P＜0.05）；注射 HCG 24 h后生長(zhǎng)激素組表達(dá)升高更明顯（P＜0.01）。結(jié)論護(hù)卵湯可能通過(guò)激活TGF-β/Smads信號(hào)通路，發(fā)揮促進(jìn)卵泡發(fā)育和改善卵巢功能的作用。

護(hù)卵湯；慢性應(yīng)激；超排卵；卵巢轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；P-Smad3；卵泡刺激素受體

現(xiàn)代社會(huì)女性身兼家庭工作多重角色，承受的壓力越來(lái)越大，長(zhǎng)期焦慮、憂郁、憤怒等負(fù)面情緒作為應(yīng)激，不斷刺激下丘腦-垂體-卵巢軸，引起神經(jīng)內(nèi)分泌及卵巢功能紊亂，卵巢功能的受損引起女性生殖功能退化，出現(xiàn)月經(jīng)失調(diào)、閉經(jīng)、不孕等系列疾病，嚴(yán)重影響女性的生活質(zhì)量并加速機(jī)體衰老進(jìn)程。即使在輔助生殖技術(shù)如此發(fā)達(dá)的今天，仍有部分患者因卵巢功能衰退無(wú)法獲得足夠的高質(zhì)量卵子而失去生育的機(jī)會(huì)，給患者身心及社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來(lái)巨大的壓力[1-2]。

護(hù)卵湯是全國(guó)名老中醫(yī)尤昭玲教授所創(chuàng)，治療卵巢功能障礙臨床療效好，深受患者歡迎[3-4]。我們的前期基礎(chǔ)研究已證實(shí)護(hù)卵湯可改善超排卵大鼠卵巢功能，促進(jìn)其排卵前卵巢微環(huán)境轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β （transforming growth factor-beta,TGF-β）等蛋白的表達(dá)[5-9]，在本研究中通過(guò)模擬人類應(yīng)激造成卵巢功能紊亂的發(fā)病經(jīng)過(guò)，從TGF-β/Smads信號(hào)通路進(jìn)一步探討護(hù)卵湯對(duì)卵巢功能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡健康SPF級(jí)ICR雌性小鼠80只，體質(zhì)量為22～25 g。第三周購(gòu)入成年ICR雄性小鼠40只，均由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物合格許可證號(hào)：SCXK(湘)2011-0003。

1.1.2 藥物 護(hù)卵湯組方：熟地黃10 g，生地黃10 g，沙參 10 g，石斛 10 g，山藥 10 g，蓮子 10 g，桑椹子10 g，覆盆子10 g，菟絲子10 g，月季花10 g，蓮子心3 g，肉蓯蓉10 g，甘草3 g。以上飲片購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥房，購(gòu)回后加水浸泡2 h，火上煎煮3次，將3次煎液混合濃縮成濃度1.49 g/mL的護(hù)卵湯，4℃冰箱保存供實(shí)驗(yàn)用。來(lái)曲唑(letrozole sheets,LE)：由江蘇恒瑞醫(yī)藥公司生產(chǎn)。生長(zhǎng)激素（growth hormone,GH）：由長(zhǎng)春金賽藥業(yè)公司生產(chǎn)。阿司匹林：購(gòu)自沈陽(yáng)奧吉娜藥業(yè)公司。尿促性腺激素 (gonadotropins,Gn)和絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin,HCG）：麗珠制藥廠生產(chǎn)。

1.1.3 主要試劑 PCR試劑盒購(gòu)自KAPA Biosystems公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TAKARA公司。PCR引物由南京金斯瑞生物公司合成，其他常規(guī)試劑均為國(guó)藥產(chǎn)品分析純。

1.1.4 主要儀器 熒光定量PCR儀 (BIO-RAD公司，Real-Time System 型)，凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD公司，Universal Hood II型），水平電泳設(shè)備 (BIORAD 公司，DYC-31D 型)，離心機(jī)（Eppendorf公司，5424 R型），超凈工作臺(tái) （蘇州凈化公司，SW-CJ-2D 型）。

1.2 方法

1.2.1 慢性應(yīng)激小鼠模型的建立[10]6周齡ICR雌性小鼠正常喂養(yǎng)1周后，稱量并記錄體質(zhì)量。隨機(jī)抽取20只小鼠為正常組，其余小鼠每天上午放入制動(dòng)器內(nèi)制動(dòng)，共制動(dòng)14 d；第一次制動(dòng)時(shí)間從3 h開始，每天延長(zhǎng)30 min，至最長(zhǎng)制動(dòng)時(shí)間為每天6 h，造成小鼠慢性應(yīng)激狀態(tài)。制動(dòng)第10天開始，每天陰道涂片并用瑞氏染色觀察陰道脫落細(xì)胞的情況，監(jiān)測(cè)小鼠動(dòng)情周期的變化。若發(fā)現(xiàn)動(dòng)情周期紊亂無(wú)規(guī)律交替，或在某期明顯延長(zhǎng)或持續(xù)停留在間期記為動(dòng)情周期異常，提示小鼠卵巢功能紊亂和/或減退[11-12]。第14天造模成功制動(dòng)結(jié)束后，再次稱量所有小鼠體質(zhì)量。

1.2.2 給藥及標(biāo)本采集 造模成功后，小鼠隨機(jī)分為護(hù)卵湯組、生長(zhǎng)激素組和模型組，另設(shè)正常組。護(hù)卵湯組：從試驗(yàn)第1天開始灌胃護(hù)卵湯0.029 g/（kg·d）直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，1次/d。 生長(zhǎng)激素組：從試驗(yàn)第 8 天開始腹腔注射 GH 0.0005IU/（kg·d），1 次/d，連續(xù)12 d；試驗(yàn)第15天加用阿司匹林0.01 mg/（kg·d）灌胃直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，1次/d。正常組和模型組：在同一時(shí)間灌胃或注射等量的生理鹽水。4組小鼠均在試驗(yàn)第15天啟動(dòng)微刺激超排卵，其方案為：先用 LE 0.65 μg/（kg·d）灌胃，1 次/d，連續(xù) 5 d；第21 天腹腔注射 Gn 0.0195U/（kg·d），1 次/d， 連續(xù)7 d，于末次應(yīng)用Gn后，雌雄鼠以2∶1比例合籠，次日晨檢查陰栓，有陰栓者腹腔注射HCG 1.29U/（kg·d）一次。每組小鼠在超排卵啟動(dòng)后第3天和注射HCG 24 h后這兩個(gè)時(shí)間段，分別處死10只小鼠獲取卵巢放入液氮罐保存待檢。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測(cè)卵巢 TGF-β1，F(xiàn)SHR，P-Smad3 mRNA的表達(dá)水平 用Trizol提取卵巢組織的總RNA，紫外分光光度計(jì)定量檢測(cè)?？俁NA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA按照試劑盒說(shuō)明書操作，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)（見(jiàn)表1），以β-肌動(dòng)蛋白(β-Actin)為內(nèi)參分別擴(kuò)增 TGF-β1，F(xiàn)SHR，PSmad3的基因。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min；95℃變性5 s；56℃退火10 s；72℃延伸25 s；進(jìn)行39循環(huán)后；65℃維持5 s；95℃維持50 s。數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件qbase plus分析，基因表達(dá)相對(duì)量用2-△△Ct表示，用擴(kuò)增曲線、熔點(diǎn)曲線監(jiān)測(cè)各標(biāo)本 PCR反應(yīng)的特異性。

表1 PCR引物序列及長(zhǎng)度

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況及動(dòng)情周期觀察

正常對(duì)照組從實(shí)驗(yàn)開始到實(shí)驗(yàn)結(jié)束外觀及活動(dòng)狀態(tài)均無(wú)異常，體質(zhì)量適度增加。其他組小鼠制動(dòng)開始后逐漸出現(xiàn)進(jìn)食減少，二便減少，行動(dòng)遲緩，四肢無(wú)力，毛色晦暗無(wú)光并出現(xiàn)不同程度的脫落，制動(dòng)結(jié)束后體質(zhì)量較正常對(duì)照組明顯減輕；對(duì)動(dòng)情周期的觀察發(fā)現(xiàn)，正常組小鼠均有規(guī)律變化的動(dòng)情周期，模型組小鼠均出現(xiàn)不同程度的動(dòng)情周期異常，提示慢性制動(dòng)應(yīng)激引起小鼠卵巢功能紊亂或減退。制動(dòng)小鼠在制動(dòng)結(jié)束后逐漸恢復(fù)進(jìn)食及二便，行動(dòng)變活潑，毛色恢復(fù)光澤，體質(zhì)量增加，到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)體質(zhì)量與正常組無(wú)明顯區(qū)別。

2.2 各組小鼠卵巢TGF-β1mRNA表達(dá)的比較

在超排卵第3天，模型小鼠卵巢組織中TGF-β1mRNA 表達(dá)明顯低于正常組（P＜0.01），隨時(shí)間延長(zhǎng)其mRNA表達(dá)逐漸恢復(fù)，但與正常組比較差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，護(hù)卵湯組和生長(zhǎng)激素組在該時(shí)間點(diǎn) TGF-β1 mRNA表達(dá)均明顯升高 （P＜0.01）。 但注射 HCG 24 h 后護(hù)卵湯組其mRNA表達(dá)與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表 2。

2.3 各組小鼠卵巢P-Smad3 mRNA表達(dá)的比較

與正常組比較，在超排卵第3天模型組小鼠卵巢組織中 P-Smad3 mRNA 表達(dá)明顯降低（P＜0.01），但在注射HCG 24 h后達(dá)到正常組水平。經(jīng)過(guò)干預(yù)后，護(hù)卵湯組和生長(zhǎng)激素組在超排卵第3天其mRNA 表達(dá)均較模型組明顯升高（P＜0.01）；護(hù)卵湯組在注射HCG 24 h后P-Smad3 mRNA表達(dá)與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見(jiàn)表 3。2.4 各組小鼠卵巢FSHR mRNA表達(dá)的比較

表2 各組小鼠卵巢TGF-β1 mRNA表達(dá)的比較 （±s,n=10）

表2 各組小鼠卵巢TGF-β1 mRNA表達(dá)的比較 （±s,n=10）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01。

組別正常組模型組生長(zhǎng)激素組護(hù)卵湯組F值P值超排卵第3天1.000±0.085 0.280±0.017**1.199±0.101△△0.578±0.097△△104.5 0.000注射HCG 24 h 1.000±0.116 0.757±0.089*2.109±0.141△△0.612±0.032 192.8 0.000

表3 各組小鼠卵巢P-Smad3 mRNA表達(dá)的比較 （±s,n=10）

表3 各組小鼠卵巢P-Smad3 mRNA表達(dá)的比較 （±s,n=10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01。

組別正常組模型組生長(zhǎng)激素組護(hù)卵湯組F值P值超排卵第3天1.000±0.029 0.228±0.008**2.454±0.041△△0.591±0.070△△246.4 0.000注射HCG24 h 1.000±0.032 1.012±0.022 2.801±0.131△△0.670±0.020 607.7 0.000

在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，模型組小鼠卵巢組織中FSHR mRNA 表達(dá)均明顯低于正常組 （P＜0.01）；生長(zhǎng)激素組其mRNA表達(dá)均顯著高于模型組 （P＜0.01）。在超排卵第3天，護(hù)卵湯組FSHR mRNA表達(dá)較模型組明顯升高 （P＜0.05）， 但在注射 HCG 24 h后其表達(dá)與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 結(jié)果見(jiàn)表 4。

表4 各組小鼠卵巢FSHR mRNA表達(dá)的比較 （±s,n=10）

表4 各組小鼠卵巢FSHR mRNA表達(dá)的比較 （±s,n=10）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別正常組模型組生長(zhǎng)激素組護(hù)卵湯組F值P值超排卵第3天1.000±0.080 0.458±0.032**2.071±0.075△△0.563±0.022△934.4 0.000注射HCG 24 h 1.000±0.044 0.635±0.084**2.454±0.173△△0.709±0.020 324.7 0.000

3 討論

卵泡發(fā)育包括促性腺激素非依賴性階段和促性腺激素依賴階段。目前認(rèn)為這種不依賴激素的調(diào)節(jié)主要由卵巢局部調(diào)控，包括卵泡顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞及卵母細(xì)胞表達(dá)分泌的各種細(xì)胞因子及其受體、激素類分子，以及具有支持營(yíng)養(yǎng)作用的其他蛋白分子。有研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1在始基卵泡的募集及始基卵泡池的維持方面起重要調(diào)控作用[13]。而TGF-β超家族對(duì)卵泡發(fā)育的調(diào)節(jié)作用是通過(guò)與卵泡細(xì)胞上相應(yīng)受體結(jié)合，啟動(dòng)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)傳遞生物信息。其中TGF-β/Smads信號(hào)通路已被證實(shí)在卵泡存在。Smads蛋白家族是TGF-β超家族受體作用的底物，將信息傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控相關(guān)靶基因的表達(dá)。通過(guò)定向敲除Smads蛋白，出現(xiàn)年齡依賴的不孕不育，并出現(xiàn)卵泡的閉鎖增加，卵泡發(fā)育障礙，激素合成受阻，排卵障礙等。可見(jiàn)Smads蛋白家族在卵泡發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。其中Smad2/Smad3主要參與TGF-β的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)模型組小鼠卵巢組織 TGF-β1、FSHR及P-Smad3的mRNA表達(dá)明顯低于正常組，提示慢性制動(dòng)應(yīng)激可能通過(guò)抑制卵巢TGF-β/Smads信號(hào)通路使小鼠卵巢功能受損；護(hù)卵湯組和生長(zhǎng)激素組小鼠的相關(guān)指標(biāo)表達(dá)較模型組明顯增高，提示護(hù)卵湯和生長(zhǎng)激素/阿司匹林可上調(diào)慢性制動(dòng)小鼠超排卵過(guò)程中卵巢 TGF-β1、FSHR及 P-Smad3的mRNA表達(dá)。已證實(shí)TGF-β1可作用于卵巢顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞和卵母細(xì)胞，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)Smads信號(hào)通路，激活Smad2/Smad3使之磷酸化，活化的Smad2/Smad3與Smad4形成多聚體，進(jìn)入核內(nèi)調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，最終可促進(jìn)芳香化酶、FSHR和黃體生成素受體（LHR）等表達(dá)及雌二醇（E2）和孕酮（P）的分泌，從而調(diào)控卵泡的發(fā)育[15-16]。故本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示護(hù)卵湯和生長(zhǎng)激素/阿司匹林可通過(guò)TGF-β1信號(hào)通路改善卵巢功能，促進(jìn)卵泡發(fā)育。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)激素組在注射HCG 24 h后小鼠卵巢TGF-β1、FSHR及P-Smad3的mRNA表達(dá)更高，但護(hù)卵湯的作用不明顯，提示生長(zhǎng)激素/阿司匹林對(duì)卵巢功能的改善可能更優(yōu)于中藥護(hù)卵湯，當(dāng)然，這需要進(jìn)一步的動(dòng)物及臨床實(shí)驗(yàn)去判斷和驗(yàn)證。

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（本文編輯 楊 瑛）

Effects of Huluan Decoction on mRNA Expression of TGF-β1,P-Smad3 and FSHR in Super Ovulation Mice with Chronic Stress

LIU Biyuan,SHEN Kejia*,SHEN Zouqinxuan,FU Lingmei,XIONG Jie
(1.Affiliated Hospital of Hunan Academy of traditional Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410006,China;(Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveTo investigate the effects of Huluan decoction on mRNA expression of TGF-β1,P-Smad3 and FSHR in super ovulation mice with chronic stress.MethodsChronic stress mice models were established.After modeling,the mice were randomly divided into model group,Huluan decoction group,growth hormone group,and normal group(no movement limit)was also assigned.On the third day of the super ovulation and after 24 hours of injection HCG,ovaries were taken from mice of each group for mRNA analysis of TGF-β1,P-Smad3 and FSHR.ResultsCompared with the model group,on the third day of the super ovulation,the mRNA expression levels of TGF-1,P-Smad3 and FSHR in growth hormone group and Huluan decoction group were significantly higher than those in the model group (P＜0.01 orP＜0.05),but growth hormone group increased significantly after 24 hours of the injection HCG (P＜0.01).ConclusionHuluan decoction could activate TGF-beta/Smads signaling pathway to promote the follicular development and improve ovarian function in super ovulation mice with chronic stress.

Huluan decoction;chronic stress;super ovulation;TGF-β1;P-Smad3;FSHR

R285.5；R711.75

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.11.006

本文引用：劉碧源，申可佳，申奏秦旋，付靈梅，熊 桀.護(hù)卵湯對(duì)慢性應(yīng)激超排卵小鼠卵巢TGF-β1，P-Smad3及FSHR mRNA表達(dá)的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（11）：1192-1195.

2017-01-17

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助（81303003，81403427）。

劉碧源，女，副教授，主要從事醫(yī)學(xué)免疫學(xué)的基礎(chǔ)研究。

*申可佳，女，副教授，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療不孕不育的基礎(chǔ)研究，E-mail:shen_kejia@163.com。