沈國正，劉 輝*，李白沙，張 琛，黃康康，郗篤雋，裴嘉博，張 青，裘劼人

(1.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024； 2.杭州市臨安區(qū)林業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江 杭州 311300)

紅陽獼猴桃與杭州地區(qū)部分野生獼猴桃種質(zhì)的SSR分析

沈國正1，劉 輝1*，李白沙1，張 琛1，黃康康1，郗篤雋1，裴嘉博1，張 青2，裘劼人1

(1.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024； 2.杭州市臨安區(qū)林業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江 杭州 311300)

以杭州地區(qū)種植的中華獼猴桃紅陽、美味獼猴桃海沃德、徐香、金魁及11份本地野生獼猴桃為試材，對其SSR遺傳多樣性及其親緣關(guān)系進(jìn)行分析和評價(jià)。結(jié)果表明，利用16對引物15份材料上均擴(kuò)增出多態(tài)性片段，共計(jì)得到88條多態(tài)性條帶，檢出81個(gè)等位變異點(diǎn)，遺傳相似系數(shù)(GS)變異范圍為0.58～0.91。GS值在0.60水平上UPGMA聚類分析可將供試的獼猴桃種質(zhì)資源劃分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ共4個(gè)組。這些遺傳變異豐富的種質(zhì)資源可為今后利用本地獼猴桃資源開展育種研究提供理論依據(jù)。

紅陽獼猴桃； 野生獼猴桃； SSR標(biāo)記； 遺傳多樣性； 杭州

獼猴桃為多年生雌雄異株落葉藤本植物，我國是獼猴桃的原產(chǎn)地，目前全世界66種獼猴桃屬植物中，有62種均產(chǎn)于我國，且絕大部分為我國特有，種質(zhì)資源十分豐富。目前國內(nèi)外獼猴桃品種選育主要從野生種質(zhì)資源中選擇或雜交育種[1]，豐富的野生獼猴桃種質(zhì)資源是獼猴桃品種選育和產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)[2-3]。20世紀(jì)70年代以來，我國已從野生獼猴桃資源中選育出55個(gè)品種和200多個(gè)優(yōu)良株系，獼猴桃產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展[4]。但異地間品種交換頻繁，且獼猴桃屬中普遍存在自發(fā)的種間雜交和種內(nèi)多倍化現(xiàn)象，使得品種資源的混雜現(xiàn)象比較突出，也不利于新品種的選育。

微衛(wèi)星DNA，即簡單重復(fù)序列(SSR，simple sequence repeats)標(biāo)記以其共顯性、重現(xiàn)性良好和多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)，成為構(gòu)建品種指紋的重要標(biāo)記，廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物和果樹的品種鑒定和種質(zhì)資源分析。宋曉燕等[5]用12對SSR引物評價(jià)192份二倍體馬鈴薯栽培品種的遺傳多樣性，檢測到98個(gè)等位位點(diǎn)并劃分為11個(gè)組群。高源等[6]利用TP-M13-SSR標(biāo)記，基于TP-M13-SSR指紋圖譜構(gòu)建蘋果種質(zhì)分子身份證。高天翔等[7]用11對SSR引物對中國櫻桃14個(gè)自然居群280個(gè)個(gè)體分析評價(jià)遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)。這些研究結(jié)果都證實(shí)了SSR標(biāo)記分析遺傳關(guān)系的有效性。本研究利用SSR標(biāo)記對杭州地區(qū)發(fā)展較快的紅心獼猴桃品種紅陽與杭州建德篩選到的優(yōu)質(zhì)野生獼猴桃材料及其他主栽品種進(jìn)行初步研究，擬分析它們之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，為新品種的選育提供遺傳學(xué)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2015年5—8月對杭州地區(qū)主要栽培品種和野生獼猴桃(主要在杭州建德)進(jìn)行了普查，選取近年來栽培較多的品種中華獼猴桃栽培種紅陽，美味獼猴桃栽培種海沃德、徐香、金魁以及收集到的建德野生獼猴桃11份，共15份材料。采集供試材料的葉片(野生獼猴桃為幼嫩葉片，其余品種為成熟葉片)用冰盒保存并運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，置于-20 ℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

采用改良CTAB法[8]從100 mg供試材料葉片中提取基因組DNA，用微量核酸濃度儀(BioSpec-nano)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度和質(zhì)量，并將模板濃度調(diào)至200 ng·μL-1。DNA母液于-20 ℃冰箱保存。對Huang等[9]報(bào)道的應(yīng)用于獼猴桃的微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行篩選，篩選出適用于供試材料的多態(tài)性好的引物16對(表1)。引物由上海生工合成。

表1 獼猴桃SSR分析的16對引物及退火溫度

PCR反應(yīng)體系及條件(PCR所用試劑購自博大泰克)。反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性20 s，55～57 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸2 min。反應(yīng)結(jié)束控制在4 ℃。PCR產(chǎn)物使用微芯片毛細(xì)管電泳儀(MCE-202 MultiNA，島津)進(jìn)行片段分析。電泳試劑使用DL-500試劑盒(島津)，25 bp DNA ladder(Invitrogen，1×TE稀釋50倍)，SYBR? GOLD熒光染料(1×TE稀釋100倍)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)SSR分析的結(jié)果，將每條SSR引物擴(kuò)增出的每條帶視為1個(gè)位點(diǎn)，相同遷移率的記為1，無條帶的記為0，在Excel 2007中將片段大小統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化為0/1矩陣。使用NTSYS-pc 2.1軟件，通過similarity→clustering→SHAN→Graphics→tree plot，程序得到15份材料的親緣關(guān)系聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 15份獼猴桃材料的遺傳多樣性

通過引物篩選預(yù)實(shí)驗(yàn)，選定了16對多態(tài)性好的引物UDK96-1、UDK96-15、UDK96-16、UDK96-20、UDK96-22、UDK96-26、UDK96-34、UDK96-37、UDK96-40、UDK97-401、UDK97-403、UDK97-407、UDK97-409、UDK97-413、UDK97-414、UDK97-415。利用這些引物對4個(gè)主栽獼猴桃品種和11份野生獼猴桃材料進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)其在所有供試材料中均可擴(kuò)增出清晰條帶；共獲得88條多態(tài)性條帶，平均每對引物擴(kuò)增4.2條帶，每個(gè)位點(diǎn)均呈現(xiàn)出一定的多態(tài)性(表2)。其中，利用UDK97-407進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)紅陽沒有條帶，其余14份材料均有條帶(圖1)。結(jié)果表明，引物擴(kuò)增得到的基因片段長度在80～300 bp，PCR擴(kuò)增總計(jì)得到81個(gè)等位位點(diǎn)，平均每對SSR引物可以檢測到5.06個(gè)等位位點(diǎn)。

表2 15份獼猴桃材料的SSR指紋圖譜

1～11為野生材料；12為紅陽；13為海沃德；14為徐香；15為金魁圖1 UDK97-407在15份獼猴桃樣本上的擴(kuò)增結(jié)果

2.2 聚類分析

通過SSR多態(tài)性標(biāo)記分析，15份獼猴桃種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)(GS)變異范圍為0.58～0.91，大部分野生材料與品種間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。其中，野生獼猴桃種質(zhì)材料1和2的GS值最大，表明兩者親緣關(guān)系近，與其他樣本間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；11和紅陽之間親緣關(guān)系較近。

根據(jù)材料間的遺傳相似系數(shù)，采用UPGMA法對獼猴桃種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析(圖2)，利用16對SSR引物能將15份種質(zhì)資源相互區(qū)分，在GS值0.60的水平上將所有的材料劃分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ4個(gè)組。Ⅰ組包括了野生種質(zhì)資源1和2，Ⅱ組包括了野生種質(zhì)資源3、5、10和栽培品種海沃德，Ⅲ組包括了野生種質(zhì)資源11和栽培品種紅陽、徐香和金魁，Ⅳ組包括了野生種質(zhì)資源4、6、7、8和9。

圖2 15份獼猴桃樣本的聚類分析

3 討論

選擇優(yōu)良性狀的親本材料是進(jìn)行獼猴桃育種工作的前提和基礎(chǔ)，親本材料遺傳背景狹窄則會(huì)導(dǎo)致難以培育出優(yōu)良性狀的品種。因此，通過選擇變異來源廣泛的親本材料，比較材料間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，對于獼猴桃新品種的選育和品種改良工作具有重要意義。利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行獼猴桃遺傳多樣性的研究，國內(nèi)外已有許多相關(guān)報(bào)道。鄭軼琦等[10]利用9對SSR引物，對中國栽培的48個(gè)獼猴桃品種(品系)進(jìn)行了遺傳多樣性研究表明，中國獼猴桃栽培品種具有較高的遺傳多樣性，SSR標(biāo)記在獼猴桃品種中有較高的鑒定效率；易盼盼等[11]通過對51對SSR引物的篩選，獲得了與抗?jié)儾』蜻B鎖的SSR分子標(biāo)記UDK97-428116，為獼猴桃抗病育種提供早期分子篩選標(biāo)記；王丹丹等[12]利用21對引物對25份軟棗獼猴桃建立了EST-SSR反應(yīng)體系，為獼猴桃屬植物的形狀定位、品種鑒定、種質(zhì)創(chuàng)新、新品種培育及遺傳多樣性分析等工作奠定了基礎(chǔ)。眾多研究結(jié)果表明SSR標(biāo)記是進(jìn)行獼猴桃品種鑒定的有效工具，與其他標(biāo)記相比，SSR標(biāo)記在鑒定獼猴桃品種的研究中顯示更高的效率。

本研究中各獼猴桃種質(zhì)資源材料之間的遺傳相似系數(shù)為0.58～0.91。魏艷霞等[13]利用RAPD標(biāo)記對野生獼猴桃資源遺傳分析發(fā)現(xiàn)個(gè)別材料遺傳相似性系數(shù)較高，在0.14～0.85，應(yīng)該加強(qiáng)野生資源的收集和利用研究。從聚類結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，海沃德雖然與徐香、金魁同屬美味獼猴桃，卻與其他2個(gè)品種間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；紅陽屬中華獼猴桃，與徐香、金魁卻相近，這與前人關(guān)于部分中華和美味品種間親緣關(guān)系相近的研究相符合，說明美味獼猴桃作為中華獼猴桃的變種，具有很近的親緣關(guān)系[14-16]。本研究為利用杭州地區(qū)豐富的野生獼猴桃資源開展新品種選育提供理論基礎(chǔ)。

[1] 黃宏文，龔俊杰，王圣梅，等. 獼猴桃屬(Actinidia)植物的遺傳多樣性[J]. 生物多樣性，2000，8 (1)：1-12.

[2] HUANG H W，WANG Y，ZHANG Z H，et al.Actinidiagermplasm resources and kiwifruit industry in China[J]. HortScience，2004，39 (6)：1165-1172.

[3] FERGUSON A R，HUANG H W. Genetic resources of kiwifruit：Domestication and breeding [J]. Horticultural Reviews，2006，33：1-121.

[4] 黃宏文. 獼猴桃馴化改良百年啟示及天然居群遺傳漸滲的基因發(fā)掘[J]. 植物學(xué)報(bào)，2009，44(2)：127-142.

[5] 宋曉燕，張春芝，李穎，等. 二倍體馬鈴薯栽培品種遺傳多樣性的SSR標(biāo)記分析[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2016，43(11)：2266-2276.

[6] 高源，王昆，王大江，等. 利用TP-M13-SSR標(biāo)記構(gòu)建蘋果栽培品種的分子身份證[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2016，43(1)：25-37.

[7] 高天翔，蔡宇良，馮瑛，等. 中國櫻桃14個(gè)自然居群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的SSR評價(jià)[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2016，43(6)：1148-1156.

[8] 丁建，董曉莉，鄭曉琴，等. 一種簡便高效提取獼猴桃DNA的方法[J]. 資源開發(fā)與市場，2006，22(5)：401-402.

[9] HUANG W G，CIPRIANI G，MORGANTE M. Microsatellite DNA inActinidiachinensis：isolation，characterization，and homology in related species[J]. Theor Appl Genet，1998，97(8)：1269-1278.

[10] 鄭軼琦，李作洲，黃宏文. 獼猴桃品種 SSR 分析的初步研究[J]. 武漢植物學(xué)研究，2003，21 (5)：444-448.

[11] 易盼盼，樊紅科，雷玉山. 獼猴桃抗?jié)儾』蜻B鎖SSR分子標(biāo)記初步研究[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2015，43(4)：91-98.

[12] 王丹丹，牟元珍，楊東霞. 軟棗獼猴桃EST-PCR體系建立及品種遺傳關(guān)系[J]. 遼東學(xué)院報(bào)，2016，23(3)：177-182.

[13] 魏艷霞，豁澤春，王飛，等. 野生獼猴桃DNA的提取及RAPD分析體系的建立[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，17(2)：169-173.

[14] FERGUSON A R. The need for characterisation and evaluation of germplasm：kiwifruit as an example[J]. Euphytica，2007，154 (4)：371-382.

[15] HUANG H，F(xiàn)ERGUSON A R.Actinidiain China：natural diversity，phylogeographical evolution，interspecific gene flow and kiwifruit cultivar improvement[J]. Acta Horticulturae，2007，753 (1)：31-40.

[16] 井趙斌，徐明，雷玉山. 獼猴桃SRAP-PCR體系的建立及品種資源親緣關(guān)系研究[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2016，43(2)：337-346.

(責(zé)任編輯：張瑞麟)

2017-06-19

杭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(20140932H03)

沈國正(1968—)，男，高級(jí)農(nóng)藝師，從事果樹栽培技術(shù)研究及推廣工作，E-mail：sgz@hz.cn。

劉 輝，E-mail：liuhui518lh@163.com。

文獻(xiàn)著錄格式：沈國正，劉 輝，李白沙，等. 紅陽獼猴桃與杭州地區(qū)部分野生獼猴桃種質(zhì)的SSR分析[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(11)：1906-1909.

10.16178/j.issn.0528-9017.20171114

S663.4

A

0528-9017(2017)11-1906-04