李 靖，孫 楠，孫永慧，鄒淑君

（黑龍江中醫(yī)藥大學 藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

分析測試

鋅離子和鈣離子對槲皮素與牛血清白蛋白結(jié)合作用的影響*

李 靖，孫 楠，孫永慧，鄒淑君*

（黑龍江中醫(yī)藥大學 藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

運用熒光光譜法，分別考察了Zn2+、Ca22+對槲皮素與牛血清白蛋白（BSA）相互作用的影響，兩種金屬離子是否影響槲皮素對BSA的熒光猝滅作用機理、槲皮素與BSA結(jié)合作用常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)、作用力類型等。結(jié)果表明，Zn2+和Ca2+存在時，不改變槲皮素對BSA的熒光猝滅機理、不改變槲皮素與BSA結(jié)合作用的作用力類型、結(jié)合位點數(shù)基本不變。但Zn2+存在時，會導致槲皮素對BSA的結(jié)合常數(shù)減?。籆a2+存在時，會導致槲皮素與BSA的結(jié)合常數(shù)增大。說明兩種離子會影響槲皮素的蛋白質(zhì)結(jié)合濃度。

槲皮素；牛血清白蛋白；鋅離子；鈣離子；結(jié)合作用；熒光光譜

小分子藥物進入血液后，與血漿中的載體蛋白相結(jié)合，從而被轉(zhuǎn)運到靶位點發(fā)揮藥效。但血液中在小分子藥物與血清白蛋白相互結(jié)合并被轉(zhuǎn)運的過程中，生物體內(nèi)的外源或內(nèi)源金屬離子可能會對藥物分子與血清白蛋白的相互作用過程產(chǎn)生影響[1]。因此，研究金屬離子存在下藥物分子與血清白蛋白的相互作用，有助于更確切地了解體內(nèi)藥物與蛋白間的作用關(guān)系，是生命科學的重要內(nèi)容。槲皮素（Quercetin，縮寫為Qct，結(jié)構(gòu)式見圖1）是許多藥用植物中的重要天然藥效成分，普遍存在于天然藥用植物當中，具有防止血小板凝聚、防治心血管疾病、增強免疫、抗癌、抗菌抗病毒等功能[2,3]。是應用前景很好的小分子藥物。Zn2+在生命活動中起著轉(zhuǎn)換物質(zhì)和交流能量的作用，是構(gòu)成多種蛋白質(zhì)必需的成分；Ca2+是形成骨骼和牙齒的主要成分，發(fā)揮著從生命產(chǎn)生到調(diào)節(jié)生理功能的各種作用。藥物進入血液中，血液中少量的Zn2+、Ca2+可能對藥物小分子實時產(chǎn)生影響。本實驗即研究Zn2+、Ca2+對槲皮素與BSA相互作用的影響。

圖1 槲皮素的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of quercetin

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

PB-20型pH計（德國賽多利斯儀器有限公司）；RF-5301PC型熒光光度計（日本島津公司）。

槲皮素（中國藥品生物制品檢定所）；三羥甲基氨基甲烷 （Tris 99.8%上海博宏生物科技有限公司）；牛血清白蛋白（BSA 99.8%美國Sigma公司）；ZnCl2、CaCl2等試劑均為國產(chǎn)分析純。實驗用水均為二次蒸餾水。

1.2 溶液配制

BSA儲備液配制：以Tris-HCl緩沖溶液為溶劑配成 1×10-5mol·L-1溶液（pH 值 7.4，含 0.01mol·L-1NaCl以維持溶液離子強度），置于4℃的冰箱中保存。

槲皮素溶液的配制 稱取一定量的槲皮素，加少量甲醇溶解于25mL容量瓶中，再用二次蒸餾水定容至刻度線，得1×10-4mol·L-1的溶液。

金屬離子溶液的配制 分別稱取一定量的Zn-Cl2、CaCl2，加二次蒸餾水溶解配制成1×10-3mol·L-1的ZnCl2溶液和 5×10-3mol·L-1的 CaCl2溶液。

1.3 實驗方法

（1）在9個10mL容量瓶中均加入1×10-5mol·L-1的 BSA 溶液 1mL，再依次加入 0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8mL 的槲皮素溶液，用 Tris-HCl緩沖溶液定容至刻度并搖勻。

（2）另在10個10mL容量瓶中均加入1×10-5mol·L-1的BSA溶液1mL，從第2號容量瓶開始，分別加入金屬離子溶液（Zn2+、Ca2+）1mL，從第3號容量瓶開始，再依次加入 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8mL的槲皮素溶液，用Tris-HCl緩沖溶液定容至刻度，搖勻。

（1）、（2）兩組溶液分別在 290、300、310K 溫度下反應20min。以280nm為激發(fā)波長，入射狹縫為5nm，發(fā)射狹縫為3nm，在290～450nm范圍內(nèi)掃描熒光光譜。

（3）數(shù)據(jù)處理參考文獻[4]的方法。

2 結(jié)果與討論

2.1 BSA的熒光猝滅光譜

圖2是300K下，激發(fā)波長為280nm，測定的BSA熒光光譜。

圖2 不同情況下槲皮素對BSA的熒光猝滅光譜圖Fig.2 Fluorescence quenching spectra of quercetin on BSA under different conditions

圖2中A是BSA的濃度不變，槲皮素的濃度逐漸增大時BSA的熒光發(fā)射光譜?？梢姡珺SA在343nm處有最大發(fā)射峰，槲皮素能夠?qū)SA的熒光產(chǎn)生猝滅作用。隨著槲皮素濃度的增加，熒光猝滅峰出現(xiàn)規(guī)律性的降低，表明槲皮素與蛋白質(zhì)分子之間發(fā)生了相互作用。且隨著槲皮素濃度增大，BSA的熒光光譜逐漸藍移。Zn2+、Ca2+本身對BSA的熒光幾乎沒有猝滅作用。圖2中B、C分別是在一定濃度的Zn2+、Ca2+存在下，逐步增加槲皮素的濃度，BSA的發(fā)射光譜?？梢姡琙n2+、Ca2+存在下，槲皮素仍能對BSA的熒光產(chǎn)生規(guī)律性的猝滅。

2.2 猝滅機理、結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)

[4]和[5]，根據(jù)Stern-Volmer方程計算出Zn2+、Ca2+不存在與存在下槲皮素對BSA的動態(tài)猝滅常數(shù)Ksv和雙分子碰撞猝滅速率常數(shù)Kq，見表1。槲皮素對BSA的動態(tài)猝滅常數(shù)Ksv隨著溫度的升高而降低，符合靜態(tài)猝滅規(guī)律。并且雙分子碰撞猝滅速率常數(shù)Kq均遠大于各類猝滅劑對生物大分子的最大擴散碰撞常數(shù) 2.0×1010L·（mol·s）-1，是靜態(tài)猝滅。Zn2+、Ca2+存在下，槲皮素對BSA的猝滅常數(shù)Ksv隨溫度的升高而降低，猝滅速率常數(shù)遠大于各類猝滅劑對生物大分子的最大擴散碰撞常數(shù)Kq，仍符合靜態(tài)猝滅規(guī)律；且動態(tài)猝滅常數(shù)比較結(jié)果是Ksv（Qct）＞Ksv（Qct-Ca2+）＞Ksv（Qct-Zn2+），說明Zn2+、Ca2+能不同程度的減弱槲皮素對BSA的熒光猝滅作用，表明兩種金屬離子可能參與了槲皮素與BSA的相互作用過程。

表1 不同情況下槲皮素與BSA相互作用的猝滅常數(shù)Tab.1 Quenching constants of interaction of quercetin and BSA under different conditions

當發(fā)生靜態(tài)猝滅，小分子物質(zhì)與生物大分子之間形成復合物可存在n個結(jié)合位點時，可根據(jù)線性回歸方程lg[（F0/F）-1]=lgKA+nlg[Q]進行計算，結(jié)果如表1所示。可以見到隨著溫度的升高，槲皮素與BSA形成的分子復合物在溫度升高時，結(jié)合常數(shù)降低，穩(wěn)定性下降，結(jié)合常數(shù)KA處在105數(shù)量級，說明槲皮素與BSA之間屬于強結(jié)合作用。隨著溫度的改變，結(jié)合位點數(shù)基本不變，基本在1左右。Zn2+、Ca2+存在時，結(jié)合常數(shù)大小為 KA（Qct-Ca2+）＞KA（Qct）＞ KA（Qct-Zn2+），兩種金屬離子存在下，槲皮素與BSA結(jié)合常數(shù)均處在104～106數(shù)量級，仍屬于強結(jié)合作用。但是，Ca2+存在時，槲皮素與BSA作用的KA最大，增大了槲皮素的蛋白結(jié)合濃度，有助于槲皮素持久緩釋發(fā)揮藥效；Zn2+存在時，槲皮素與BSA作用的KA減小，減小了槲皮素的蛋白結(jié)合濃度，可能能夠在短期內(nèi)提高槲皮素藥效。Zn2+、Ca2+存在時，槲皮素與BSA結(jié)合位點數(shù)隨略有變化，但不同程不大，仍基本為1左右。

2.3 作用力類型

當溫度變化不大時，可以將焓變△H看做一個常數(shù)。根據(jù)Van't Hoff熱力學方程，可以計算出藥物與蛋白質(zhì)作用的熱力學參數(shù),不同情況下槲皮素與BSA相互作用的熱力學參數(shù)見表2。

表2 不同情況下槲皮素與BSA相互作用的熱力學參數(shù)Tab.2 Thermodynamic parameters of interaction of quercetin with BSA under different conditions

可見，△G均為負值，表明不論有無Zn2+、Ca2+存在，槲皮素與BSA的作用過程均為Gibbs自由能降低的自發(fā)過程。同時，均有△H＜0，說明反應過程是放熱過程，溫度的升高不利于小分子與蛋白質(zhì)之間形成復合物，使靜態(tài)猝滅作用減弱。根據(jù)Ross理論，可以判斷與BSA相互作用的作用力類型。反應體系的熱力學參數(shù)均符合ΔH＜0、ΔS＜0，表明不論有無Zn2+、Ca2+存在，槲皮素與BSA之間主要作用力類型都是氫鍵和范德華力。

3 結(jié)論

槲皮素對BSA具有較強的熒光猝滅作用，與BSA也有較強的結(jié)合能力，Zn2+和Ca2+本身對BSA不存在猝滅作用，因此，與BSA之間應該沒有強結(jié)合能力。

在槲皮素與BSA的混合體系中，Zn2+或Ca2+加入后，不改變槲皮素對BSA的熒光猝滅機理，不論有無Zn2+或Ca2+存在，槲皮素對BSA的熒光猝滅作用都是靜態(tài)猝滅為主；Zn2+或Ca2+加入后，不改變槲皮素與BSA的作用力類型，對槲皮素與BSA之間的結(jié)合位點數(shù)不產(chǎn)生大的影響。Ca2+存在時，槲皮素與BSA作用的動態(tài)猝滅常數(shù)Ksv減小、但結(jié)合常數(shù)KA是增大的，說明Ca2+可能與槲皮素配位，同時與BSA有一定的結(jié)合，Ca2+可能在槲皮素和BSA分子間形成“離子架橋”[6]，因此，增強了槲皮素與BSA的結(jié)合作用，因此，增大槲皮素的蛋白結(jié)合濃度，有助于槲皮素持久緩釋發(fā)揮藥效；Zn2+存在時，槲皮素與BSA作用的Ksv及KA均減小，可能是由于Zn2+與槲皮素配位能力強，從而削弱了槲皮素與BSA的結(jié)合作用，從而減小了槲皮素的蛋白結(jié)合濃度。該實驗結(jié)論可為合理藥用槲皮素提供理論指導。

參考文獻

［1］ 蔣新宇,李文秀,陳景文.鋅離子存在下槲皮素、楊梅素與牛血清蛋白的結(jié)合［J］.無機化學學報,2008,28（10）：1588-1595.

［2］ 呂蔡,張杰.槲皮素的藥理作用［J］.國外醫(yī)藥（植物藥分冊）,2005,20（3）：108-112.

［3］ 龔珊,張玉英,俞光第,等.槲皮素鎮(zhèn)痛作用的觀察［J］.中草藥,1996,27（10）：612-613.

［4］ 鄒淑君,張蕾，郭迎喜,等.橙皮素銅（II）配合物與牛血清白蛋白作用的研究［J］.化學工程師,2015,29（8）：5-7.

［5］ 徐暘,許樹軍,張蕾,等.鋁離子存在下槲皮素與牛血清白蛋白的相互作用［J］.哈爾濱商業(yè)大學學報（自然科學版）,2016,32（2）：150-153.

［6］ 邵爽,邱瑾.金屬離子對齊多夫定與牛血清白蛋白結(jié)合作用的影響［J］.物理化學學報,2009,25（7）：1342-1346.

Influence of Zn2+and Ca2+on interaction between quercetin and bovine serum albumin*

LI Jing,SUN Nan,SUN Yong-hui,ZOU Shu-jun*
（College of Pharmacy,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China）

The interaction between quercetin and bovine serum albumin（BSA）was studied in the presence of Zn2+or Ca2+by using fluorescence spectroscopy.Investigate whether the presence of Zn2+or Ca2+has an influence on the fluorescence quenching mechanism of quercetin on BSA,the binding constants between quercetin and BSA,the binding site number and the type of force.The results indicated that Zn2+or Ca2+does not change the mechanism of fluorescence quenching mechanism of quercetin on BSA,does not change the type of force between quercetin and BSA.The number of binding sites is almost unchanged.But when Zn2+is present,the binding constant between quercetin and BSA decreases.And when Ca2+is present,the binding constant between quercetin and BSA will increase.So the two ions affect the protein binding concentration of quercetin.

quercetin;bovine serum albumin;Zn2+;Ca2+;binding reaction;fluorescence spectrometry

R96

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20171123

2017-07-20

黑龍江省科學院科學研究基金項目（XKJJ1601）

李 靖（1992-），女，在讀碩士研究生，從事藥物分析研究。

鄒淑君（1974-），女，博士，副教授，從事藥物活性及藥物分析研究。