王瀟霖，黃鳳，鄭瀟瀟，唐國林，王雯，蔣桂華

·炮制制劑·

皮寒感舒顆粒制劑可行性分析及原料藥質(zhì)量檢驗

王瀟霖，黃鳳，鄭瀟瀟，唐國林，王雯，蔣桂華*

目的：對皮寒感舒顆粒進(jìn)行可行性分析，并檢查原料藥材的質(zhì)量。方法：本文從皮寒藥的前期研究對皮寒感舒顆粒制劑可行性進(jìn)行了分析；同時對皮寒感舒顆粒的原料藥皮寒藥進(jìn)行了質(zhì)量檢驗。并確立了色譜條件為：DiamonsilTMC18HPLC 色譜柱(4.6×250 mm, 5 μL，Ser.No.∶ 8132964.)流動相：乙腈-水（40∶60）流速：1.0 mL?min-1，柱溫：30 ℃,進(jìn)樣量：10 μL，檢測波長：210 nm，分析時間：25 min進(jìn)行分析。結(jié)果：符合《四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》2010版的要求。且建立的色譜方法可行。結(jié)論：原料藥材的質(zhì)量合格，制備皮寒感舒顆粒的分析方法可靠?？捎糜谄ず惺骖w粒制備工藝的進(jìn)一步研究。

皮寒藥;流行性感冒顆粒劑;質(zhì)量檢查;高麗槐素;芒柄花素;HPLC

前言

皮寒藥為攀西地區(qū)安寧河流域治療感冒的常用民間藥，民間使用歷史悠久，效果顯著，口碑盛佳。臨床研究證實，皮寒藥在治療感冒的作用中效果極佳，抗病毒實驗結(jié)果表明該藥有明顯抗甲型H1N1流感病毒作用。皮寒感舒顆粒成功開發(fā)應(yīng)用具有預(yù)防和治療季節(jié)性流行性感冒的現(xiàn)實意義，形成特效、安全的抗流感病毒醫(yī)院制劑，利于臨床醫(yī)生選擇用藥，增加基層醫(yī)院制劑收入。同時帶動四川皮寒藥的規(guī)范化種植，使皮寒藥更好的開發(fā)和推廣，為人類的健康做出一定的貢獻(xiàn)。本文對皮寒感舒顆粒進(jìn)行可行性分析，并檢查原料藥材的質(zhì)量，確保制劑藥材來源可靠。探索制劑的分析方法，為皮寒感舒顆粒的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。

1 皮寒感舒顆粒制劑可行性分析

皮寒藥為藥食兩用中藥。不僅可單用或燉食，一些中醫(yī)在治療風(fēng)寒感冒時，也常以皮寒藥為藥引，以增強(qiáng)臨床療效。何昭德[1]對四川省涼山州彝族人民利用皮寒藥治療感冒進(jìn)行了總結(jié)和驗證，并研究了72例皮寒藥配伍陳皮治療感冒的案例，發(fā)現(xiàn)皮寒藥治療感冒療效顯著。蘭群等[2]研究皮寒藥水體液與醇提液抗菌作用時發(fā)現(xiàn)水體液和醇沉液在生藥濃度1g?mL-1時對表皮葡萄球菌皆表現(xiàn)出抑制作用，且水提液的作用大于醇提液。但醇提液對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出一定抑制作用。趙芙蓉等[3]人對皮寒藥進(jìn)行的藥效作用研究表明，皮寒藥不僅具有解熱鎮(zhèn)痛、抗菌等作用，亦可用H1N1流感病毒的治療，且急性毒性小，安全性較好。陳孝雨[4]等對皮寒藥水溶性成分進(jìn)行研究，在對其水提取液進(jìn)行分離純化后，最終得到并鑒定出其中五個化學(xué)成分，分別為7,2’-二羥基-4’-甲基-異黃酮、高麗槐素、芒柄花素-7-O-β-D葡萄糖苷、芒柄花素、9-（β-D-ribofuranosyl）-Adeniosine（腺苷）。據(jù)研究黃酮類物質(zhì)能對抗流感病毒[5]。皮寒藥水提液中黃酮類成分芒柄花素、高麗槐素的含量相對較高，芒柄花素又稱剌芒柄花素、芒柄花黃素、生原禪寧、普拉腦、大豆黃素4’-甲基醚，為黃酮類成分。現(xiàn)代研究表明芒柄花素具有抗菌作用[6]、雌激素樣作用[7]，抗氧化作用，可明顯促進(jìn)非特異性免疫系統(tǒng)，抗癌細(xì)胞作用還有降血脂，利尿等作用。髙麗槐素又稱馬卡因、朝鮮槐英、山槐素，為黃酮類成分?，F(xiàn)代研究表明高麗槐素具有抗菌作用[8]，抗腫瘤作用[9]，抗過敏作用[10]對磷酸二醋酶具有抑制作用。芒柄花素與高麗槐素可作為皮寒感舒顆粒制備工藝的指標(biāo)成分。且可確定皮寒感舒顆粒的提取工藝采用水提加熱回流法。皮寒藥水提藥液比較渾濁，液體澄清度達(dá)不到要求，且易霉變。故不采用口服制劑。片劑的制備要添加多種賦形劑成本較高。顆粒劑具有吸收迅速，起效快，生物利用度高，易于攜帶和貯藏，使用方便，口感也比較好，與傳統(tǒng)的水煎劑相比能減少服用量等特點，故可采用顆粒劑。

2 皮寒感舒顆粒原料藥的前處理與質(zhì)量檢查

實驗所用皮寒藥藥材于2016年3月采自四川涼山州西昌市禮州鎮(zhèn)，采后自然陰干。

2.1 實驗儀器與試藥

儀器： Agilent Technologies1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司），BS200S電子天平（北京塞多利斯天平有限公司），DZKW-4型電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司），微型植物試樣粉碎機(jī)FZ102型（北京中興偉業(yè)儀器有限公司），ZDHW型調(diào)溫電熱套（河北省黃驊市中興儀器有限公司）。

試藥：β-谷甾醇對照品（成都曼斯特生物科技有限公司，批號：MUST-15110311）、高麗槐素（成都曼斯特生物科技有限公司，批號：MUST-15071610），芒柄花素（成都曼斯特生物科技有限公司，批號：MUST-16031005），蒸餾水為實驗室自制，其他試劑均為分析純。

2.2 實驗方法及結(jié)果

2.2.1 性狀鑒別 長圓錐形，長3～15 cm，直徑0.6～8 mm。表面棕黃色，有縱皺紋和橫向突起的皮孔。易折斷，斷面纖維狀。奇數(shù)羽狀復(fù)葉叢生，質(zhì)脆、多破碎完整小葉橢圓形或卵圓形，淡灰黃色，長3～10 mm寬2～8 mm。葉軸細(xì)長。全緣兩面均被白色柔毛?；偣＠w細(xì)，傘形花序，蝶形花，花冠紫色或淡紫色，尖端有一個凹陷的缺口。種子腎形，墨綠色或棕褐色。氣微、味淡，嚼之微有有豆腥味。取本品進(jìn)行藥材、種子、花瓣在放大鏡下觀察。觀察結(jié)果見圖1、圖2、圖3。

圖1 皮寒藥藥材

圖2 皮寒藥花瓣缺口

圖3 皮寒藥種子

2.2.2 顯微鑒別 按2010年版《四川省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》皮寒藥藥材粉末顯微鑒別方法[11]。

本品粉末淡黃棕色。木栓細(xì)胞類長方形或不規(guī)則形，棕黃色或紅棕色，壁較厚。非腺毛眾多，由單細(xì)胞組成，基部略彎曲，壁厚，具疣狀突起，長150～960 μm，直徑15～20 μm。纖維眾多，長梭形，常成束，直徑10～20 μm。導(dǎo)管多網(wǎng)紋或螺紋，直徑30～50 μm。淀粉粒較多，大小不一，類圓形、長圓形、不規(guī)則形，直徑5～30 μm，多為單粒，有的多個聚集成團(tuán)；臍點呈點狀、裂縫狀；復(fù)粒少見由2～4 g個分粒組成。草酸鈣方晶單個散在，直徑10～20 μm。取本品粉末滴加甘油或水合氯醛透化后置顯微鏡下觀察；鑷子撕取浸泡葉片中部表皮，用0.5%亞甲基藍(lán)染色1.5 min，蒸餾水洗去多于染料，30%封片。氣孔不等式或平軸式。觀察結(jié)果見圖4。

圖4 皮寒藥粉末顯微鑒別圖

2.2.3 薄層鑒別 薄層板制備：照《中國藥典》2015年版第四部通則0502薄層色譜法中薄層板制備方法制備[12]。

取本品粉末3.007 g，加乙醇40 mL，加熱回流2 h，濾過，取濾液，在水浴上濃縮至1mL，作為供試品。取β-谷甾醇1mg，加1mL三氯甲烷溶解制成對照品溶液1。取高麗槐素對照品1 mg,加三氯甲烷溶解制成對照品溶液2。取芒柄花素對照品1 mg,加三氯甲烷溶解制成對照品溶液3。取供試品溶液與對照品溶液1、2、3，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（10∶3）為展開劑，展開，取出，晾曬。10%硫酸乙醇為顯色劑。至105 ℃加熱，在紫外下觀察。觀察結(jié)果見圖5。

圖5 皮寒藥薄層鑒別色譜圖

2.2.4 檢查及浸出物 水分：照《中國藥典》2015年版第四部通則0832烘干法測定[12]。

總灰分與酸不溶性灰分：照2015年版《中國藥典》第四部通則2302灰分法測定[12]。

浸出物：照《中國藥典》2015年版第四部通則2201熱浸法測定[12]。結(jié)果見表1。

表1 皮寒藥水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物測定結(jié)果

?

結(jié)果表明：樣品水分含量在8.88%～9.35%之間，平均值為9.10%；總灰分含量在8.53%～8.76%之間，平均值為8.65%，酸不溶性灰分含量在3.21%～3.36%，平均值為3.39%。

2.2.5 HPLC法測定皮寒藥水提液中高麗槐素、芒柄花素的含量

色譜條件 色譜柱：DiamonsilTMC18 HPLC 色譜柱(4.6×250 mm,5 μL, Ser.No.∶ 8132964.)流動相：乙腈-水（40∶60）流速：1.0 mL?min-1，柱溫：30 ℃,進(jìn)樣量：10 μL,檢測波長：210 nm,分析時間：25 min.

樣品溶液的制備 取皮寒藥粗粉20 g，加10倍水，煎煮2次，每次30 min，合并煎液。提取液離心過濾，定容置200 mL容量瓶中。精密量取50 mL濾液，同比例乙酸乙酯萃取[17]數(shù)次，乙酸乙酯層旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無乙酸乙酯味，10 mL甲醇洗滌定容，得樣品溶液。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱取高麗槐素，甲醇溶解，定容至10 mL,制成1.002 mg?mL-1高麗槐素對照品儲備液。再取1mL1.002 mg?mL-1高麗槐素定容到5 mL容量瓶中,制成0.2004 mg?mL-1。

精密稱取芒柄花素，甲醇溶解，定容至10 mL,制成0.999 mg?mL-1芒柄花素對照品儲備液。再取1 mL 0.999 mg?mL-1芒柄花素對照品定容到10 mL容量瓶中,制成0.0999 mg?mL-1。

系統(tǒng)適用性試驗 分別精密吸取對照品溶液及供試品溶液各10 μL，按“色譜條件”依次進(jìn)樣，結(jié)果表明，本實驗條件下，高麗槐素、芒柄花素色譜峰，峰形良好，能達(dá)到檢測要求。理論塔板數(shù)均不低于4000，且分離度好。結(jié)果如圖6、7、8所示。

圖6 皮寒藥水提液樣品 HPLC色譜圖

圖7 皮寒藥芒柄花素 HPLC色譜圖

圖8 皮寒藥高麗槐素 HPLC色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別吸取高麗槐素、芒柄花素對照品溶液2，4，8，12，16 μL按照所述色譜條件進(jìn)行色譜分析，測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，高麗槐素的量為橫坐標(biāo)，繪制回歸方程。結(jié)果如圖9、10。

圖9 高麗槐素標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖10 芒柄花素標(biāo)準(zhǔn)曲線

測定結(jié)果表明：在0.1998～1.998 μg之間芒柄花素的峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系；在0.4008～3.206 μg之間高麗槐素的峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系；

精密度考察 分別精密吸取對照品10 μL，并按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，計算高麗槐素、芒柄花素峰面積RSD分別為0.68%、0.64%，表明本方法精密度良好。

穩(wěn)定性考察 精密吸取對照品高麗槐素、芒柄花素各10 μL，并按上述色譜條件分別于0，2，4，8，12，24 h測定一次；計算髙麗槐素、芒柄花素峰面積的RSD分別為1.02%、RSD=1.09%。對照品溶液高麗槐素、芒柄花素在24小時內(nèi)穩(wěn)定性良好。

精密吸取樣品10 μL，并按上述色譜條件分別于0，2，4，8，12，24 h測定一次；計算芒柄花素、高麗槐素峰面積芒柄花素RSD分別為2.81%、1.23%。本方法測得樣品中芒柄花素和高麗槐素的含量重現(xiàn)性良好。

重現(xiàn)性試驗考察 分別精密吸取供試品10 μL，并按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，計算髙麗槐素、芒柄花素RSD值分別為0.81%、0.23%。本方法測得樣品中芒柄花素和高麗槐素的含量重現(xiàn)性良好。

加樣回收率的考察 精密稱取皮寒藥樣品10 g，分別置于具塞錐形瓶中，分別精密加入適量對照品（高麗槐素、芒柄花素），按“樣品溶液的制備”項下制備樣品，并按上述色譜條件進(jìn)樣10 μL，測得皮寒藥藥材粗粉的含量。測得樣品中芒柄花素、高麗槐素的含量，計算回收率。結(jié)果見表2、3?；厥章?=[測得量(mg)－藥材中含量(mg)]/芒柄花素或高麗槐素加入量*100%

表2 芒柄花素回收率試驗結(jié)果

表3 高麗槐素回收率試驗結(jié)果

測定結(jié)果表明：本方法高麗槐素、芒柄花素回收率良好。

含量測定結(jié)果 取5批樣品，按照精密稱取皮寒藥樣品10 g制備樣品，并按上述色譜條件進(jìn)行測定，測得皮寒藥藥材粗粉的含量。測得結(jié)果如表4所示。

表4 皮寒藥藥材的含量測定結(jié)果

由表可知：皮寒藥中高麗槐素的含量在0.2346～0.2532 mg?g-1之間，芒柄花素的含量在0.1433～0.1469 mg?g-1之間。

2 討論

皮寒藥資源豐富，具有廣闊的開發(fā)前景。且安全性較好，療效確切?？刹捎妹⒈ㄋ嘏c高麗槐素可作為指標(biāo)成分，水提加熱回流的方法作為皮寒藥顆粒劑的提取工藝，制備成單驗方皮寒藥顆粒劑。期望以抗流感病毒為切入點，結(jié)合中醫(yī)辨證的用藥思想，開發(fā)出宜于規(guī)?；a(chǎn)的預(yù)防或治療季節(jié)性流行感冒特色的安全、有效、價廉物美的中藥醫(yī)院制劑。根據(jù)以上實驗結(jié)果，皮寒藥藥材均符合2010版《四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》中所規(guī)定。且建立了以色譜條件為：DiamonsilTMC18 HPLC 色譜柱(4.6×250mm,5ul, Ser.No.∶ 8132964.)，流動相：乙腈-水（40∶60）流速：1.0 mL?min-1，柱溫：30 ℃,進(jìn)樣量：10 μL,檢測波長：210 nm，分析時間：25 min.以高麗槐素、芒柄花素的含量進(jìn)行分析。本文認(rèn)為皮寒感舒顆粒的原料藥材的質(zhì)量合格。方法可靠，可應(yīng)用于皮寒感舒顆粒制備工藝的進(jìn)一步研究。

[1] 何德昭.涼山州民間草藥“皮寒藥”加陳皮治療感冒72例[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2004,27(3)∶ 11.

[2] 蘭群,趙芙蓉,蔣桂華,等.皮寒藥不同提取液體外抗菌作用研究[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2002,35(3)∶39.

[3] 陳孝雨.攀西地區(qū)民間草藥皮寒藥的生藥學(xué)和化學(xué)成分研究[D].成都中醫(yī)藥大學(xué),2010.

[4] 趙芙蓉,蔣桂華,陳孝雨,等.皮寒藥解熱鎮(zhèn)痛作用及初步安全性研宄[J].時珍國醫(yī)國藥,2011, 22 (10)∶ 2518.

[5] 王成陽, 李澤庚. 感冒中醫(yī)藥診治最新研究進(jìn)展[C].中華中醫(yī)藥學(xué)會肺系病分會成立大會暨第十五次全國中醫(yī)肺系病學(xué)術(shù)交流大會, 2011.

[6] Michelline Viviane Marques das Neves,Tania Maria Sarmento da Silva,Edeltrudes de Oliveira Lima,Emídio Vasconcelos Leit?o da Cunha,Eduardo de Jesus Oliveira. Iso fl avone formononetin from red propolis acts as a fungicide against Candida sp[J].Brazilian Journal of Microbiology,2016,47(01)∶159.

[7] 于杰,趙丕文,牛建昭,等.芒柄花素的植物雌激素作用研究[J].中國中藥雜志,2010,35(22)∶3060.

[8] 黃琦,屈玟珊,高世軍,等.苦參生物堿和黃酮體外抑菌活性比較[J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報,2016,32(05)∶577.

[9] 楊璽文,王德立,張興翠,等.初加工對牛大力中高麗槐素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響[J].西南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2016,38(05)∶52.

[10] FUKUI H,MIZUGUCHI H,KASHIWADA Y,et al.Molecular pharmacology of (-) mssckiain,from Kujin,an anti-allergic Kampo medicine[J].Nihon Yakurigaku Zasshi,2016,147(03)∶148.

[11] 四川省食品藥品監(jiān)督管理局.四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)[M].成都∶四川科學(xué)技術(shù)出版社.2011∶185.

[12] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典.2015年版.四部.北京∶中國醫(yī)藥科技出版社,2015.

Feasibility analysis of Pihanganshu granules and quality inspection of raw material

/WANG Xiao-lin, HUANG Feng,ZHENG Xiao-xiao, TANG GUO-lin, WANG Wen, JIANG Gui-hua//(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective:To analyze the feasibility of Pihanganshu granules, and inspect the quality of the raw material.Method:This feasibility of Pihanganshu granules preparation was analyzed from the preliminary study of Pihanyao herbs. At the same time, the quality of raw material of Pihanganshu granules - Pihanyao herbs were tested. The chromatographic condition was established. Diamonsil C18HPLC column (4.6×250 mm, 5μL, Ser. No.∶ 8132964.) was used. Mobile phase was acetonitrile and water with the ration of 40∶60. Flow rate was set at 1.0 mL?min-1and column temperature was 30℃. 10 μL sample was injected for analysis. Detection wavelength was 210 nm and analysis time was 25 min.Result:The quality of the raw material of Pihanganshu granules met the requirements recorded in ‘The standard of Chinese medicinal materials in Sichuan province’( 2010 edition). And the established chromatography method was feasible.Conclusion:The raw material of Pihanganshu granules is qualified. The analytical method of Preparation of Pihanganshu granules is reliable, which can be used for further study of Pihanganshu granules preparation process.

Pihanyao; in fluenza granule; quality test; maackiain; formononetin; HPLC

R 283

A

1674-926X(2017)06-012-04

四川省中醫(yī)藥管理局開發(fā)研究項目（項目編號：2012-G-035）；成都市科技惠民技術(shù)研發(fā)項目（項目編號∶2015-HM01-00162-SF）

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化重點實驗室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137

王瀟霖(1991－ )，女(漢族)，福建泉州，在讀碩士研究生，主要從事中藥品種與質(zhì)量的研究工作。Tel∶18065531756 Email∶446994443@qq.com

蔣桂華(1970－ )，女(漢族)，四川成都人，教授，博士學(xué)位，主要從事中藥品種與質(zhì)量的研究工作。Email∶11469413@qq.com

2017-05-18

(責(zé)任編輯：何瑤)