伊 琳 曲 強(qiáng) 紀(jì)祿風(fēng) 石向慧 王立紅 顧遠(yuǎn)暉

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000)

當(dāng)歸揮發(fā)油對自發(fā)性高血壓大鼠ACE2基因表達(dá)的影響

伊 琳 曲 強(qiáng)1紀(jì)祿風(fēng) 石向慧 王立紅 顧遠(yuǎn)暉1

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000)

目的探討當(dāng)歸揮發(fā)油對自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)心肌血肌緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)2基因表達(dá)的影響及作用機(jī)制。方法將40只8周齡雄性SHR隨機(jī)分為模型組，當(dāng)歸揮發(fā)油組(低、高)和卡托普利組，并以同周齡的Wistar大鼠作為正常對照組。分別灌胃4 w后，取大鼠心肌組織，HE染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)的變化實(shí)時熒光定量PCR法檢測ACE2 mRNA 表達(dá)量，Western印跡檢測ACE2蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果當(dāng)歸可降低SHR血壓；HE染色顯示，與模型組相比較，當(dāng)歸揮發(fā)油各組病變分別有不同程度的減輕；與模型組相比，當(dāng)歸高、低劑量組ACE2 mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯升高(Plt;0.01)。結(jié)論當(dāng)歸揮發(fā)油對SHR血壓有調(diào)節(jié)作用，可能通過ACE2基因發(fā)揮降壓作用。

當(dāng)歸揮發(fā)油;高血壓;血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)2

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)過度活動是人類原發(fā)性高血壓的主要發(fā)病機(jī)制之一。近年研究發(fā)現(xiàn)，RAS 中存在一個拮抗血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)/血管緊張素(Ang)Ⅱ/血管緊張素1受體(AT1R) 軸的平衡系統(tǒng)即ACE2/Ang1～7/Mas 受體軸，其中ACE2為關(guān)鍵基因〔1〕，在高血壓的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。當(dāng)歸揮發(fā)油是當(dāng)歸的脂溶性成分，包含藁本內(nèi)酯、正丁烯內(nèi)酯、當(dāng)歸酮等，其中藁苯內(nèi)酯含量最高。當(dāng)歸揮發(fā)油具有降壓作用，本研究將探討當(dāng)歸對ACE2基因表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1動物選擇與分組 40只8周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)(體重180～220 g)，SPF級,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司〔動物合格證號SCXK(京)2012-0001〕，動物檢疫合格證明No.1100562901)。8只正常血壓 Wistar 大鼠(體重180～220 g)，雄性，SPF級，購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心〔動物合格證號SYXK(甘)2011-0001〕。

1.2藥物與試劑選擇 當(dāng)歸購自甘肅省岷縣，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心提取揮發(fā)油，采用CO2超臨界萃取法；卡托普利分散片(國藥準(zhǔn)字H41025659)；高效RIPA裂解液，BCA濃度測定試劑盒，聚丙酰胺配膠試劑盒(索萊寶)；Western印跡儀(伯樂美國)，Power Lab ML125/R無創(chuàng)尾動脈血壓器(日本)，低溫?fù)u床，低溫離心機(jī)。

1.3給藥方法和分組 將SHR和Wistar大鼠在SPF級實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，于給藥前測定各組大鼠的血壓，采用Power Lab ML125/R無創(chuàng)血壓測定分析系統(tǒng)測定清醒狀態(tài)下鼠尾動脈收縮壓，連續(xù)測定1 w，待各組大鼠適應(yīng)環(huán)境后，將SHR隨機(jī)分為模型組、卡托普利組、當(dāng)歸低劑量與高劑量組，Wistar 大鼠為對照組，每組8只。給藥途徑為灌胃。模型組和對照組給予生理鹽水，不給任何藥物。當(dāng)歸組、卡托普利組根據(jù)實(shí)驗(yàn)鼠體表面積最終確定給藥劑量，當(dāng)歸低、高組分別每日為當(dāng)歸揮發(fā)油1.2、10 g/kg，卡托普組每日產(chǎn)卡和普利2.25 mg/kg。每周給藥7 d，每天定時給藥，連續(xù)4 w，隨體重變化每周按時調(diào)整給藥劑量。每周的第七天于同一時間測定血壓，每只大鼠每次測定5次，取均值。試驗(yàn)期間，各組大鼠標(biāo)準(zhǔn)飲食，自由飲水。

1.4樣本采集 給藥4 w后，將動物禁食不禁水12 h，3%水合氯醛(避光)腹腔注射麻醉后于腹主動脈取血8 ml，3 000 r/min 離心 10 min(4℃),分離血清。將大鼠頸椎脫臼處死，開胸取出心肌組織，部分心肌組織立即置于液氮保存；另一部分心肌組織置入10%甲醛溶液中固定、脫水透明及石蠟包埋切片，HE 染色，觀察血管組織形態(tài)學(xué)變化。

1.5實(shí)時熒光定量PCR檢測ACE2 mRNA的表達(dá)量 按 Trizol試劑盒說明書抽取組織總RNA，按 RT-PCR 試劑盒說明書配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系合成 cDNA，然后進(jìn)入PCR 擴(kuò)增體系，反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃，50 s；50個循環(huán)；72℃ 8 min；觀察擴(kuò)增曲線和溶解曲線，溶解曲線以單峰為佳,以β-actin 為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法，按照相對表達(dá)量=2-ΔΔCt，ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組 ΔCt-對照組 ΔCt，ΔCt=目的基因 Ct平均值-β-actin Ct平均值，分析各組基因的相對表達(dá)水平。

1.6Western印跡檢測ACE2蛋白表達(dá)水平 各組大鼠處死后，PBS水沖洗后，取心肌組織200 mg，加500高效裂解液(含1%PSMF)冰上裂解20 min，4℃離心后得上清為總蛋白，95℃水浴鍋煮10 min，同時采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度計(jì)算上樣量，隨后進(jìn)行免疫印跡檢測。以GAPDH作為內(nèi)參照，進(jìn)行半定量分析，比值表示其相對含量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用ANOVA方差分析，并行兩兩比較。

2 結(jié) 果

2.1各組用藥前后血壓的變化 模型組收縮壓顯著高于對照組(Plt;0.01);連續(xù)灌服當(dāng)歸揮發(fā)油，當(dāng)歸組(高、低)血壓明顯低于模型組(Plt;0.01)，卡托普利組血壓低于模型組(Plt;0.01)，當(dāng)歸各組(高、低)內(nèi)未見明顯差異(Plt;0.01)。見圖1。

2.2HE染色結(jié)果 心肌組織病理切片結(jié)果顯示，模型組與對照組相比，心肌纖維增粗，排列較紊亂，橫紋結(jié)構(gòu)模糊，毛細(xì)血管比例相對減少。與模型組比較，卡托普利組肌纖維排列比較均勻，且肌纖維變細(xì)；與模型組比較，當(dāng)歸揮發(fā)油高劑量組橫紋肌結(jié)構(gòu)清晰，心肌纖維排列更加均勻且肌纖維變細(xì)。見圖2。

與對照組相比：1)Plt;0.01；與模型組相比：2)Plt;0.01圖1 當(dāng)歸揮發(fā)油對鼠尾動脈壓的影響

圖2 心肌組織病理切片(HE，×400)

2.3各組ACE2 mRNA表達(dá)水平比較 與模型組相比，當(dāng)歸揮發(fā)油低劑量組ACE2 mRNA與高劑量組表達(dá)水平均升高(Plt;0.01)。

2.4Western印跡檢測ACE2蛋白表達(dá)水平 與模型組相比，ACE2蛋白表達(dá)水平在當(dāng)歸揮發(fā)油各組均升高(Plt;0.01)，見圖3。

1～5：對照組、模型組、卡托普利組、當(dāng)歸揮發(fā)油低劑量組、當(dāng)歸揮發(fā)油高劑量組圖3 Western印跡電泳結(jié)果

3 討 論

在世界范圍內(nèi)，心血管疾病(CAD)位于所有疾病死亡之首位，在所有心血管疾病中，原發(fā)性高血壓是最主要的危險因素。同時高血壓的知曉率、治療率、控制率均不滿意，對高血壓的防治仍面臨嚴(yán)重的挑戰(zhàn)。有關(guān)高血壓發(fā)病機(jī)制的研究一直在深入進(jìn)行中，原發(fā)性高血壓是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用所致的復(fù)雜性疾病，其中遺傳因素在EH的發(fā)病機(jī)制中的影響占30%～50%。新近研究表明，miRNA、DNA甲基化，組蛋白修飾及基因組結(jié)構(gòu)變異等都有可能參與血壓調(diào)節(jié)和高血壓的發(fā)生〔2〕。ACE2基因位于染色體Xp22，2002 年加拿大學(xué)者 Crackower等〔3〕報道ACE2 基因定位于 X 染色體上，是高血壓的候選基因之一〔4〕。Yagil等〔5〕基于對ACE2的認(rèn)識首先提出了有關(guān)RAS調(diào)節(jié)血壓的“兩臂學(xué)說”，其中一個臂依賴于ACE的活性與AngⅡ產(chǎn)生，另一個臂則依賴于ACE2的活性與Ang(1～7)的生成，二者相互拮抗，共同參與血壓的調(diào)節(jié)，ACE2最重要的生物學(xué)效應(yīng)是降解AngⅡ生成Ang(1～7)，其中ACE2催化AngⅡ生成Ang(1～7)的效率是催化AngI生成Ang(1～9)效率的400倍。一方面，ACE2通過對AngⅡ的降解來限制它的血管收縮功能，另一方面，通過Ang(1～7)的生成拮抗AngⅡ的作用，Ang(1～7)具有擴(kuò)張血管及抗纖維化的功能〔6〕。組織中ACE/ACE2的平衡失調(diào)將導(dǎo)致血壓的改變，ACE2表達(dá)上調(diào)阻止血壓升高，ACE2表達(dá)缺失導(dǎo)致血壓升高〔7，8〕。金海燕等〔9〕的研究也發(fā)現(xiàn)自發(fā)高血壓大鼠心臟 ACE2 基因及蛋白水平明顯減低可同時伴隨血壓的升高。因此，RAS系統(tǒng)中ACE/AngⅡ/AT1R與 ACE2/Ang(1～7)/MasR軸的作用相互拮抗，后者作為內(nèi)生性的反調(diào)控用途拮抗前者功能，當(dāng)兩者的生理不平衡達(dá)到一定程度時，就會導(dǎo)致一些心血管疾病如高血壓的發(fā)生。當(dāng)歸是甘肅的道地藥材，也是中藥治療高血壓使用頻率最高的藥物之一〔10〕?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)通過對當(dāng)歸提取物發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸提取物通過對RASS系統(tǒng)、離子通道、血管神經(jīng)等對高血壓的發(fā)生發(fā)展起到一定的作用。本次研究再次證實(shí)當(dāng)歸具有降壓的作用，當(dāng)歸揮發(fā)油對心肌組織有保護(hù)作用，當(dāng)歸揮發(fā)油可能會增強(qiáng)ACE2的活性，作用于ACE2/Ang(1～7)/MasR軸，抑制血管的收縮，拮抗ACE的作用而發(fā)揮降壓的作用，下一步研究中將進(jìn)一步探討當(dāng)歸對ACE2/Ang(1～7)/MasR軸中其他因素的影響及對相關(guān)信號通路的作用，以明確當(dāng)歸對ACE2/Ang(1～7)/MasR的干預(yù)作用。

1De Mello WC.Local renin angiotensin aldosterone systems and cardiovascular diseases〔J〕.Med Clin North Am,2017;101(1):117-27.

2朱鼎良.遺傳因素在原發(fā)性高血壓發(fā)病中的新進(jìn)展〔J〕.中國循環(huán)雜志,2012;27(2):81-2.

3Crackower MA,Sarao R,Oudit GY,etal.Angiotensin-converting enzyme 2 is an essential regulator of heart function〔J〕.Nature,2002;417(6891):822-8.

4Donoghue M,Hsieh F,Baronas E,etal.A novel angiotensin-converting enzyme-related carboxypeptidase(ACE2)converts angiotensin Ⅰ to angiotensin 1-9〔J〕.Circ Res,2000;87(5):E1-9.

5Yagil Y,Yagil C.Hypothesis ACE2 modulates blood pressure in the mammalian organism〔J〕.Hypertension,2003;41(4):871-3.

6Tallant EA,Clark MA.Molecular mechanisms of inhibition of vascular growth by angiotensin-(1-7)〔J〕.Hypertension,2003;42(4):574-9.

7Ocaranza MP,Michea L,Chiong M,etal.Dissociating angiotensin 1-9 anticardiovascular remodeling effects from those on blood pressure〔J〕.J Hypertens,2014;32(8):1719-21.

8Ocaranza MP,Moya J,Barrientos V,etal.Angiotensin-(1-9)reverses experimental hypertension and cardiovascular damage by inhibition of the angiotensin converting enzyme/Ang Ⅱ axis〔J〕.J Hypertens,2014;32(4):771-83.

9金海燕，宋 蓓，鐘久昌. ACE2 基因:高血壓防治新的靶點(diǎn)〔J/CD〕.中華臨床醫(yī)師雜志:電子版，2011;5(11):5062-5.

10蔡永敏,王守富,黃謙峰,等.原發(fā)性高血壓中藥現(xiàn)代應(yīng)用頻次研究〔J〕.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2014;10(3):603.

〔2016-11-15修回〕

(編輯 李相軍)

TheeffectsofAngelicaonACE2geneinspontaneouslyhypertensiverats

YILin,QUQiang,JILu-Feng,etal.

GansuUniversityofChineseMedicine,Lanzhou730000,Gansu,China

ObjectiveTo study the influence of Angelica sinensis (oliv.) Diels on ACE2 gene in spontaneously hypertensive rats (SHR).MethodsAll the rats were divided into Angelica , model , captopril groups, weekly-old Wistar rats as normal control group, The systolic blood pressure(SBP) of the tail in different groups before and after treatment were measured .After 4 weeks, cardiac tissue of the rats were taken out, HE stain was used to observe the pathological changes of cardiac tissue, the mRNA level of ACE2 was detected by RT-PCR，the protein expression of ACE2 was tested by Western blot.ResultsAngelica reduced SBP in SHRs. Myocardial fibers of Angelica group were thinned and organized with sharply defined stripes structure. The ACE2 mRNA and protein expressions were significant increased in Angelica group (Plt;0.01).ConclusionsThe essential oil of Angelica sinensis could reduce the blood pressure through up-regulating the expression of ACE2.

Angelica; Hypertension; ACE2

R2-031

A

1005-9202(2017)22-5507-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.010

國家自然科學(xué)基金(No.81460669)；甘肅省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目批準(zhǔn)號(GZK-2016-40)；甘肅省自然科學(xué)基金(No.1310RJZA084)

1 甘肅省人民醫(yī)院

顧遠(yuǎn)暉(1969-)，男，主任醫(yī)師，主要從事腫瘤相關(guān)的臨床與基礎(chǔ)研究。

伊 琳(1971-)，女，副教授，博士，主要從事高血壓遺傳學(xué)、中西醫(yī)結(jié)合心血管疾病研究。