王 欣 李宜炯 龐 超 楊艷紅 張瑞華 朱振龍 王政民

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院病理科，河北 石家莊 050031)

Kiss-1在胃腺癌組織中的表達(dá)及對(duì)胃腺癌MKN-45細(xì)胞增殖、遷移能力的影響

王 欣 李宜炯1龐 超 楊艷紅 張瑞華 朱振龍 王政民

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院病理科，河北 石家莊 050031)

目的探討腫瘤抑制因子(Kiss)-1在胃腺癌組織中的表達(dá)及對(duì)胃腺癌細(xì)胞增殖、遷移能力的影響。方法qRT-PCR檢測50例胃腺癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織中Kiss-1水平。分別將Kiss-1小干擾RNA(siRNA Kiss-1)和對(duì)照小RNA(siRNA control)、Kiss-1過表達(dá)載體(p EGFP-N1-Kiss-1)和對(duì)照空載體(p EGFP-N1)轉(zhuǎn)染至胃腺癌細(xì)胞株(MKN-45)中，培養(yǎng)48 h后，Western印跡檢測細(xì)胞中Kiss-1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9、MMP-2、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、C-myc蛋白水平，噻唑藍(lán)(MTT)檢測細(xì)胞增殖能力，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力。用Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑FH535作用胃腺癌細(xì)胞后，檢測細(xì)胞增殖和凋亡情況。結(jié)果Kiss-1在胃腺癌組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織(Plt;0.01)。p EGFP-N1-Kiss-1組細(xì)胞存活率和遷移率顯著低于p EGFP-N1組，siRNA Kiss-1組顯著高于siRNA control組(Plt;0.01)。p EGFP-N1-Kiss-1組細(xì)胞中MMP-9、MMP-2、β-catenin、C-myc水平顯著低于p EGFP-N1組，siRNA Kiss-1組顯著高于siRNA control組(Plt;0.01)。抑制劑作用后的胃腺癌細(xì)胞增殖遷移趨勢與p EGFP-N1-Kiss-1組一致。結(jié)論Kiss-1在胃腺癌組織中低表達(dá)，Kiss-1通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制胃腺癌細(xì)胞增殖遷移能力。

胃腺癌；腫瘤抑制因子；遷移；Wnt/β-catenin信號(hào)通路

胃腺癌是胃癌的一種，由胃腺體細(xì)胞惡化產(chǎn)生〔1〕。胃腺癌的發(fā)病率占全部胃癌發(fā)病率的95%〔1〕。腫瘤抑制因子(Kiss)-1最初發(fā)現(xiàn)于黑素瘤細(xì)胞株中，是一種與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因〔3〕。Kiss-1廣泛存在于正常的組織和器官中，在小腸、胎盤、睪丸、腦等組織中均具有不同程度的表達(dá)〔4〕。研究表明，Kiss-1參與膀胱癌、甲狀腺癌、子宮內(nèi)膜癌等多種癌癥的轉(zhuǎn)移，在乳腺癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞增殖遷移過程中發(fā)揮抑制作用〔5，6〕。本研究運(yùn)用qRT-PCR檢測胃腺癌組織中Kiss-1水平，并探討Kiss-1對(duì)胃腺癌細(xì)胞增殖遷移的影響。

1 材料與方法

1.1一般材料 組織及細(xì)胞：收集2010年8月至2013年3月在河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院確診切除的50例胃腺癌患者的胃腺癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織，其中男33例，女17例，平均年齡(58.47±12.34)歲。胃腺癌細(xì)胞株(MKN-45)購于河北醫(yī)科大學(xué)病理教研室。主要儀器及試劑：p EGFP-N1-Kiss-1由本實(shí)驗(yàn)室保存；胰蛋白酶、DMEM、青鏈霉素均購于美國Sigma；Kiss-1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9、MMP-2、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、C-myc單克隆抗體均購于北京鼎國生物科技有限公司；CO2培養(yǎng)箱購于美國Thermo；倒置顯微鏡購于日本尼康。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR檢測組織中Kiss-1水平 50例胃腺癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織剪碎后，在液氮中研磨成粉狀。取出100 mg組織粉末，加入Trizol裂解液1 ml，依次用氯仿、異丙醇抽提后，用乙醇洗滌。加入焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解后，用紫外分光光度計(jì)檢測提取的RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成Kiss-1 cDNA。按照qRT-PCR試劑盒說明書分析Kiss-1 mRNA水平。Kiss-1上游引物：5′-CCTCTGTGCCACCCACTTTG-3′；Kiss-1下游引物：5′-TGTAGTTCGGCAGGTCCTTCT-3′。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 取出保存在液氮罐中的胃腺癌MKN-45細(xì)胞，迅速放在37℃的水浴鍋中融化后，加入含有10%胚牛血清(FBS)的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，1 000 r/min離心10 min，加入5 ml細(xì)胞生長液懸浮細(xì)胞，種植于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次，加入0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，棄酶消化液，加入細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 收集培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的胃腺癌MKN-45細(xì)胞，加入細(xì)胞生長液，接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別將Kiss-1小干擾RNA(siRNA Kiss-1)和對(duì)照小RNA(siRNA control)、Kiss-1過表達(dá)載體(p EGFP-N1-Kiss-1)和對(duì)照空載體(p EGFP-N1)轉(zhuǎn)染至胃腺癌細(xì)胞中，放置于37℃培養(yǎng)6 h后，更換成完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4Western印跡檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Kiss-1水平 收集轉(zhuǎn)染48 h后的胃腺癌細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，放置于冰上裂解細(xì)胞30 min。轉(zhuǎn)移細(xì)胞裂解液至離心管中，4℃，12 000 r/min離心20 min。取蛋白上清液至EP管中。用二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒檢測提取的蛋白樣品濃度。蛋白樣品與上樣緩沖液充分混合后，100℃煮沸5 min。取變性蛋白樣品加入到十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠(SDS-PAGE)上樣孔中，電泳初始電壓為80 V，電泳30 min后，調(diào)整電壓為120 V至電泳結(jié)束。取出蛋白凝膠，在4℃轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。取出PVDF膜，加入5%脫脂奶粉封閉后，依次與一抗(600倍稀釋)、二抗(1 000倍稀釋)反應(yīng)后，轉(zhuǎn)移至暗室中，滴加顯色液，曝光后，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，分析蛋白表達(dá)率。

1.2.5噻唑藍(lán)(MTT)檢測細(xì)胞增殖 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期轉(zhuǎn)染后的胃腺癌MKN-45細(xì)胞，加入胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心后用細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞。調(diào)整每毫升細(xì)胞懸浮液中含有2×104個(gè)細(xì)胞，種植于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸浮液100 μl。放置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，在細(xì)胞中加入體積10 μl 5 mg/ml的MTT溶液，放在37℃孵育反應(yīng)4 h。棄上清液，在細(xì)胞中加入100 μl的二甲基亞砜(DMSO)溶液。每組設(shè)置8個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白組，空白組中不加入細(xì)胞。觀察結(jié)晶物完全融化后，放置于酶標(biāo)儀上檢測每孔的吸光度(OD值)，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)。

1.2.6細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移 轉(zhuǎn)染后胃腺癌MKN-45細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后，加入胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心后，在細(xì)胞沉淀中加入細(xì)胞培養(yǎng)液，接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。用移液槍槍頭小心在貼壁細(xì)胞中劃出一條細(xì)痕，加入PBS洗滌。加入細(xì)胞生長液，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率，細(xì)胞遷移率=遷移的距離/劃痕初始距離。

1.2.7Western印跡檢測細(xì)胞中MMP-9、MMP-2、β-catenin、C-myc表達(dá)水平 胃腺癌與20 μmol/L Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑FH535作用48 h后，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，Western印跡檢測MMP-9、MMP-2、β-catenin、C-myc水平。設(shè)置抑制劑FH535作用后的胃腺癌細(xì)胞為抑制劑組，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組不加抑制劑。操作步驟同1.2.4。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差表示。

2 結(jié) 果

2.1Kiss-1在胃腺癌組織中的表達(dá) 胃腺癌組織中Kiss-1水平明顯低于癌旁組織，差異顯著(Plt;0.01)。

2.2轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Kiss-1蛋白表達(dá) siRNA control組和p EGFP-N1組細(xì)胞中Kiss-1蛋白水平?jīng)]有變化。p EGFP-N1-Kiss-1組顯著高于p EGFP-N1組。siRNA Kiss-1組顯著低于siRNA control組(Plt;0.01)。見圖1。

1：p EGFP-N1；2：p EGFP-N1-Kiss-1；3：siRNA control；4：siRNA Kiss-1；下圖同圖1 轉(zhuǎn)染后胃腺癌細(xì)胞中Kiss-1表達(dá)水平

2.3Kiss-1對(duì)胃腺癌細(xì)胞增殖遷移能力的影響 p EGFP-N1-Kiss-1組細(xì)胞存活率和遷移率顯著低于p EGFP-N1組，siRNA Kiss-1組顯著高于siRNA control組(Plt;0.01)。

2.4Western印跡檢測細(xì)胞中MMP-9、MMP-2、β-catenin、C-myc水平 p EGFP-N1-Kiss-1組細(xì)胞中MMP-9、MMP-2、β-catenin、C-myc水平顯著低于p EGFP-N1組，siRNA Kiss-1組顯著高于siRNA control組(Plt;0.01)。見圖2。

2.5抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)胃腺癌細(xì)胞增殖遷移能力的影響 抑制劑組細(xì)胞存活率和遷移率均顯著低于對(duì)照組(Plt;0.01)。抑制劑組細(xì)胞中MMP-9、MMP-2、β-catenin、C-myc表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(Plt;0.01)。見圖3。

與p EGFP-N1組比較：1)Plt;0.01；與siRNA control組比較：2)Plt;0.01圖2 細(xì)胞中MMP-9、MMP-2、β-catenin、C-myc表達(dá)水平檢測結(jié)果

圖3 抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)胃腺癌細(xì)胞增殖遷移能力的影響

3 討 論

Kiss-1基因位于1q32染色體上，編碼的Kiss-1蛋白由145個(gè)氨基酸組成。有研究表明，Kiss-1在多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)甚至缺失。Kiss-1能夠抑制黑色素瘤細(xì)胞C8161在大鼠中的轉(zhuǎn)移能力〔7〕。過表達(dá)Kiss-1的乳腺癌細(xì)胞株的遷移能力與對(duì)照組相比明顯下降〔8〕。近年來研究表明，Kiss-1表達(dá)下調(diào)與甲狀腺癌、子宮內(nèi)膜癌等多種癌癥的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔9〕。本研究收集了50例胃腺癌患者的胃腺癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織，qRT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)Kiss-1在胃腺癌組織中表達(dá)下調(diào)。本研究結(jié)果提示，Kiss-1是一種抑癌基因。腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。腫瘤細(xì)胞的遷移受多種基因的復(fù)雜調(diào)控〔10〕。MMP是目前研究最多的與腫瘤細(xì)胞遷移相關(guān)的蛋白家族〔11〕。MMP-2和MMP-9在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔12〕。本研究結(jié)果提示，Kiss-1可能是通過調(diào)控MMP-2和MMP-9作用于胃腺癌細(xì)胞。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路廣泛存在于真核生物體內(nèi)，屬于高度保守的信號(hào)通路〔13〕。β-catenin是Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的關(guān)鍵效應(yīng)因子，參與癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移過程〔14〕。C-myc是Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的一個(gè)靶基因，調(diào)控癌細(xì)胞增殖過程，是一種癌基因〔15〕。FH535是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制劑，能夠特異性阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活〔16〕。本研究結(jié)果提示，Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑FH535能夠減弱胃腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。

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〔2017-02-11修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

R73

A

1005-9202(2017)22-5530-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.019

河北省衛(wèi)計(jì)委青年科技課題(20150642)

1 河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院骨科

李宜炯(1982-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事骨腫瘤研究。

王 欣(1982-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事臨床腫瘤病理研究。