王聯(lián)發(fā) 陳 晨 王星星

(中國人民解放軍第105醫(yī)院心內(nèi)二科，安徽 合肥 230031)

辛伐他汀對快速起搏早期家兔心房肌超微結(jié)構(gòu)的影響及可能機制

王聯(lián)發(fā) 陳 晨 王星星

(中國人民解放軍第105醫(yī)院心內(nèi)二科，安徽 合肥 230031)

目的建立家兔快速心房起搏模型，探討辛伐他汀對快速心房起搏早期心房超微結(jié)構(gòu)及L型鈣通道α1c蛋白的影響。方法30只家兔隨機分為對照組、心房快速起搏組、辛伐他汀組各10只。辛伐他汀組5 mg·kg-1·d-1辛伐他汀灌胃2 w，其余組以等量生理鹽水灌胃，對照組不行起搏，心房快速起搏組和辛伐他汀組行快速心房起搏(800次/min)建立家兔快速起搏模型，急性起搏8 h后取右房組織，電鏡觀察心房肌超微結(jié)構(gòu)的改變，免疫組化法觀察急性起搏8 h后右房組織L型鈣通道α1c蛋白表達。結(jié)果心房快速起搏組起搏8 h后心房肌細胞超微結(jié)構(gòu)有明顯變化，如肌原纖維排列紊亂、肌小節(jié)減少，肌溶解、線粒體腫脹、空泡樣改變、糖原聚集等心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的改變，心房肌細胞L型鈣通道的α1c亞單位的蛋白表達水平較對照組明顯下降。辛伐他汀組心房肌超微結(jié)構(gòu)的改變相對較輕，L型鈣通道α1c亞單位的蛋白表達水平較對照組下降不明顯。結(jié)論辛伐他汀可明顯改善快速起搏早期家兔心房肌超微結(jié)構(gòu)的變化，對快速心房起搏導致的L型鈣通道α1c亞單位的表達有一定保護作用。

辛伐他??；快速起搏；心房重構(gòu)；L型鈣離子通道

心房顫動(AF)是臨床最為常見、復雜的心律失常之一，隨年齡增加發(fā)病率逐步升高〔1〕。周自強等〔2〕調(diào)查表明，我國AF的患病率為0.77%，80歲以上人群AF患病率達7.5%。AF轉(zhuǎn)復后藥物維持竇性心律的只有65%，3年的維持率只有20%〔3〕。AF的發(fā)生及維持機制日益引起關注。AF可使心房發(fā)生電重構(gòu)及結(jié)構(gòu)重構(gòu)，而心房重構(gòu)發(fā)生的同時也加重AF的發(fā)生及維持。本文通過建立快速家兔起搏模型，觀察快速起搏早期心房肌超微結(jié)構(gòu)的改變及辛伐他汀預處理對其影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 新西蘭大耳白家兔30只，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心，體重2.0～2.5 kg，雌雄不拘。30只家兔均分為對照組、心房快速起搏組、辛伐他汀組。辛伐他汀組5 mg·kg-1·d-1辛伐他汀灌胃2 w，其余組以等量生理鹽水灌胃2 w。

1.2主要試劑、溶液成分 ①辛伐他汀片 (杭州默沙東制藥有限公司)；②山羊抗兔抗體 (美國Chemicon公司)；③液體石蠟、二甲苯、各濃度乙醇溶液、蘇木素、伊紅染液 (解放軍第105醫(yī)院病理實驗室提供)；④SP-900免疫組化染色試劑盒 (北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；⑤3%戊巴比妥鈉溶液：戊巴比妥鈉3 g溶解100 ml無菌生理鹽水，常溫保存。⑥3%戊二醛溶液：30%戊二醛10 ml加入0.1 mmol/L二甲砷酸鈉緩液，定容至100 ml，避光保存于4℃冰箱。⑦10%甲醛：量取市售甲醛100 ml，加Na2HPO44 g、NaH2PO46.5 g及焦碳酸二乙酯(DEPC)水至1 000 ml，常溫保存?zhèn)溆?。⑧二氨基?lián)苯胺(DAB)顯色劑：取1 ml超純水，加入1滴試劑盒中A試劑，充分混勻在分別滴加B、C試劑各1滴，再次混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用，配后避光保存。

1.3快速心房起搏模型的建立 各組家兔分別給予3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉，靜脈推注肝素1 000 U，將兔仰臥固定于兔臺，頸部正中切口，分離右側(cè)頸內(nèi)靜脈并切開，近頭端結(jié)扎，置入1根5F四極電極導管(電極間距5 mm)至右房，插入深度約6 cm，將遠端電極對與心電圖左、右上肢電極相連，記錄家兔右心耳內(nèi)膜心電圖，示大A小V，表明電極位于右心房，固定好電極導管。心房快速起搏組和辛伐他汀組采用心臟電生理刺激儀連續(xù)單刺激模式進行8 h的快速心房起搏，起搏頻率為800次/min，電壓4 V，對照組植入起搏電極，但不行高位快速右房起搏刺激，定時觀察家兔的反應狀態(tài)。

1.4標本的采集 根據(jù)實驗分組，分別在起搏8 h結(jié)束后，采用空氣栓塞法快速處死家兔，無菌技術(shù)開胸，迅速取出心臟，在磷酸鹽緩沖液(PBS)中漂洗心臟，剪下右心房組織，用雙面刀片修成約1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，一部分于2.5%戊二醛4℃保存固定準備行電鏡觀察，一部分于10%甲醛中固定準備行HE染色及免疫組化試驗。

1.5電鏡觀察 梯度脫水后環(huán)氧樹脂包埋，制成超薄組織切片。醋酸雙氧鈾溶液和檸檬酸鉛溶液染色(鉛、鈾雙染色)，在JEM10OCX1I透射電鏡下，60～80 kV加速電壓，10 000～20 000放大倍率，觀察左房心肌細胞超微結(jié)構(gòu)變化，選取典型視野拍照。

1.6HE染色 右心房組織存10%甲醛中固定24 h后，脫水、常規(guī)石蠟包埋、切片，行HE染色，觀察細胞形態(tài)的完整性。

1.7免疫組化染色 固定好的家兔右心房心肌組織按HE染色方法脫水、包埋、切片，常規(guī)脫蠟脫水，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，滴加試劑A，37℃孵育30 min，滴加按適當比例稀釋的一抗，4℃孵育過夜后置于37℃恒溫箱平衡40 min，PBS洗滌3 min×5次；滴加試劑B，37℃孵育30 min，PBS洗滌3 min×5次；滴加試劑C，37℃孵育30 min，PBS洗滌3 min×5次；DAB顯色，蘇木素復染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。應用計算機輔助圖像分析系統(tǒng)進行分析，每組高倍鏡(放大400倍)下隨機選擇8個視野，計算每個視野L型鈣離子通道α1c亞單位蛋白表達平均光密度值，作為蛋白表達量。

1.8統(tǒng)計學方法 應用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析及t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 實驗過程中，心房快速起搏組1只家兔在建模過程中死亡，解剖后考慮為心臟破裂導致大出血，又補充1只家兔，共有30只家兔建模成功，順利完成實驗。見圖1、圖2。

圖1 快速起搏前正常家兔心電圖(紙速 50 mm/s，Ⅱ?qū)?lián))

圖2 快速右心房起搏家兔心電圖(紙速 50 mm/s，Ⅱ?qū)?lián))

2.2各組心肌組織電鏡觀察 對照組心房組織在電鏡下見心肌纖維排列規(guī)則，無斷裂、溶解，肌小節(jié)明暗帶清楚，線粒體形態(tài)較規(guī)則。心房快速起搏組心肌纖維排列明顯紊亂，心肌纖維出現(xiàn)不同程度的損傷，包括肌纖維腫脹、斷裂、溶解；肌小節(jié)明暗帶不可區(qū)分；肌絲明顯減少；糖原聚集；線粒體腫脹、體積變大，部分破裂，數(shù)量減少，有的出現(xiàn)空泡樣改變。辛伐他汀組上述改變出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)，明暗帶恢復，肌細胞排列比較整齊，但部分線粒體仍有異常，見圖3。

圖3 各組心肌組織電鏡觀察

2.3免疫組化觀察L型鈣離子通道α1c亞單位陽性表達情況 HE染色可見心房肌細胞排列規(guī)則，細胞大小勻齊。L型鈣離子通道α1c亞單位免疫組化陽性表達為棕褐色的細顆粒狀，主要分布在細胞膜和細胞質(zhì)，縱切視野陽性顆粒沿細胞膜分布，橫切視野胞質(zhì)陽性顆粒呈點狀散在，見圖4。對照組細胞膜和細胞質(zhì)均有著色，分布較均勻，平均光密度0.245±0.014，心房快速起搏組陽性表達呈散在分布，較對照組明顯減少(0.133±0.007,Plt;0.05)，辛伐他汀組陽性表達較心房起搏組有改善(0.199±0.011，Plt;0.05)，說明辛伐他汀對快速心房起搏導致的L型鈣通道α1c亞單位的表達有一定保護作用。

圖4 心肌組織α1c亞單位免疫組化表達(SAB,×400)

3 討 論

AF的心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)主要體現(xiàn)在心房組織、細胞、分子水平的心房大體結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)的病理改變，表現(xiàn)為細胞肥大、細胞內(nèi)糖原累積、細胞超微結(jié)構(gòu)的改變、內(nèi)膜纖維化及脂肪組織浸潤等，并且與心房電重構(gòu)密切相關，心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)可致心房電傳導及興奮性異常，為AF的發(fā)生與維持提供了重要的病理基礎〔4〕。有研究發(fā)現(xiàn)〔5，6〕，當心房電重構(gòu)被逆轉(zhuǎn)至正常后，AF的持續(xù)原因和結(jié)構(gòu)重構(gòu)若仍然存在，則仍較容易引發(fā)AF，提示心肌細胞的結(jié)構(gòu)重構(gòu)在AF維持和發(fā)展中起重要作用。一旦AF發(fā)生，它將引起心房電重構(gòu)及結(jié)構(gòu)重構(gòu)，心房重構(gòu)又為AF的維持提供了結(jié)構(gòu)基礎，兩者互為因果，最終發(fā)展為永久性AF，形成“AF誘發(fā)AF”的惡性循環(huán)〔7～9〕。研究認為鈣超載在心房重構(gòu)中起重要作用，在AF早期快速激動引起大量的鈣離子進入細胞內(nèi)，造成鈣離子超載，導致線粒體等細胞器代謝異常及蛋白水解酶活性改變，產(chǎn)生肌小節(jié)缺失、肌溶解〔10〕；同時鈣超載導致的鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(CaMK)Ⅱ磷酸化還能夠激活組蛋白去乙?；?HDAC)下游效應器的重構(gòu)，引起心房收縮功能異?！?1〕。其中L型鈣離子通道是決定心肌細胞內(nèi)Ca2+含量和肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放的主要通道〔12〕，L型鈣離子通道是一個由多種不同亞型構(gòu)成的離子通道家族，而α1亞基為各種亞型鈣離子通道的核心組成部分，由其構(gòu)成離子通道結(jié)構(gòu)，并決定通道的電生理特性。本研究可見快速起搏家兔心房8 h即可出現(xiàn)心房肌組織重構(gòu)，L型鈣離子通道α1c亞單位陽性表達明顯下調(diào)，與心房組織超微結(jié)構(gòu)的變化相對應，因此推測α1c亞單位的表達改變可能是AF心房肌組織重構(gòu)的分子基礎之一。辛伐他汀為羥甲基戊二酸單酰輔酶(HMG-Co)A還原酶抑制劑，廣泛應用于臨床，多用于阻滯膽固醇的合成、治療高脂血癥，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物具有除治療高脂血癥之外的其他方面的作用，并不依賴于降血脂功能，稱之為他汀的多效性〔13〕。2010年歐洲心臟病協(xié)會(ESC)AF指南〔14〕指出，通過動物實驗證實他汀類藥物具有較好的抗心律失常的作用，推薦作為AF一級預防和二級預防(上游治療)的重要藥物。Rader等〔15〕對200 例CABG 術(shù)后患者進行研究(其中50例在術(shù)后48 h內(nèi)給予他汀類藥物)，結(jié)果顯示預防性給予他汀類藥物可以減少術(shù)后AF的發(fā)生和縮短患者的住院時間。

本研究提示辛伐他汀具有調(diào)節(jié)快速起搏家兔心房L型鈣通道α1c亞單位變化的作用，這可能為其抗心律失常的細胞學離子機制之一。

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〔2016-03-27修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R541.7

A

1005-9202(2017)22-5518-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.014

南京軍區(qū)聯(lián)勤部資助課題(No.11YG04)

王聯(lián)發(fā)(1967-)，男，主任醫(yī)師，碩士生導師,主要從事心臟起搏與心電生理研究。