王佳蓉 陳翊民 吳瑞珊

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院耳鼻喉科，福建 泉州 362000)

鼻咽癌組織中TRPC1表達(dá)及其對鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

王佳蓉 陳翊民 吳瑞珊

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院耳鼻喉科，福建 泉州 362000)

目的探討鼻咽癌組織中瞬時受時電位(TRPC)1的表達(dá)情況及其對鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。方法選擇鼻咽癌組織標(biāo)本80例和鼻咽慢性炎癥標(biāo)本80例；鼻咽癌C666-1細(xì)胞分為siRNA TRPC1組、陰性對照組、空白對照組。采用免疫組織化學(xué)法測定組織中 TRPC1蛋白的表達(dá)，采用Western印跡檢測細(xì)胞中 TRPC1蛋白的表達(dá)，采用RT-PCR測定細(xì)胞中 TRPC1 mRNA的表達(dá)，采用Transwell實驗測定細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果鼻咽癌組TRPC1蛋白陽性率高于鼻咽慢性炎癥組(Plt;0.05)。si-TRPC1組C666-1細(xì)胞中TRPC1蛋白和TRPC1 mRNA的表達(dá)量均低于陰性對照組和空白對照組(Plt;0.05)。第3天和第5天si-TRPC1組C666-1細(xì)胞OD值低于陰性對照組和空白對照組(Plt;0.05)。si-TRPC1組C666-1細(xì)胞G1期比例高于陰性對照組和空白對照組(Plt;0.05)，S期比例低于陰性對照組和空白對照組(Plt;0.05)。si-TRPC1組C666-1細(xì)胞早期凋亡比例高于陰性對照組和空白對照組(Plt;0.05)，C666-1細(xì)胞侵襲力低于陰性對照組和空白對照組(Plt;0.05)。結(jié)論鼻咽癌組織中TRPC1蛋白呈高表達(dá)，沉默TRPC1基因后鼻咽癌細(xì)胞中TRPC1水平下降，TRPC1能夠促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，抑制鼻咽癌細(xì)胞凋亡。

鼻咽癌；瞬時受時電位；增殖；凋亡；細(xì)胞周期

鼻咽癌為我國高發(fā)惡性腫瘤之一，與EB病毒感染有關(guān)，主要采取放射治療為主，化學(xué)治療和手術(shù)為輔的綜合治療措施。鼻咽癌放療后的5年生存率約為50%，但因其早期癥狀比較輕微、病灶比較小、發(fā)病部位隱蔽，給鼻咽癌的診斷帶來一定困難。鼻咽癌周圍淋巴組織豐富，使鼻咽癌更具有侵襲性和轉(zhuǎn)移性，常常在出現(xiàn)臨床癥狀前就已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。鼻咽癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是導(dǎo)致其治療失敗的主要原因〔1～3〕，因此，探討鼻咽癌的生物學(xué)特性具有重要意義。瞬時受時電位(TRPC)1為非選擇性的鈣離子、鈉離子等陽離子通道，其和多種腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移關(guān)系密切〔4～6〕。本文探討鼻咽癌組織中TRPC1蛋白的表達(dá)情況及基因沉默TRPC1對鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。

1 資料與方法

1.1資料 選擇福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院2014年7月至2016年6月鼻咽活檢確診為鼻咽癌的石蠟標(biāo)本80例作為鼻咽癌組，鼻咽活檢確診為鼻咽慢性炎癥標(biāo)本80例作為對照組。鼻咽癌組患者年齡(48.78±12.43)歲，男56例，女24例；對照組年齡(49.12±11.65)歲，男49例，女31例，兩組患者性別和年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。鼻咽癌TNM分期T1期18例，T2期33例，T3期19例，T4期10例，N0 21例，N1 30例，N2 19例，N3 10例；臨床分期：Ⅰ期4例，Ⅱ期23例，Ⅲ期24例，Ⅳ期29例。所有患者均資料完整，經(jīng)病理組織學(xué)確診。

細(xì)胞和主要試劑：鼻咽癌C666-1細(xì)胞(中國上海栩冉生物科技有限公司)，濃縮型鼠抗人TRPC1多克隆抗體(美國Hyclone公司)，siRNA TRPC1質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒(廣州瑞博生物科技公司)，胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基(美國Abcam公司)，BCA蛋白試劑盒、RT-PCR試劑盒、RNA提取試劑盒(美國Sigma公司)，Transwell小室(美國BD公司)等。

1.2采用免疫組織化學(xué)法測定鼻咽癌組織和鼻咽慢性炎癥組織中TRPC1蛋白表達(dá)情況 將鼻咽癌組織和鼻咽慢性炎癥組織石蠟切片脫蠟后，按照免疫組織化學(xué)試劑盒說明書進(jìn)行染色，一抗為濃縮型鼠抗人TRPC1多克隆抗體。結(jié)果判定：胞質(zhì)和胞膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒為TRPC1陽性表達(dá)，根據(jù)細(xì)胞染色強度評分分為0～3分，根據(jù)陽性細(xì)胞比例評分分為0～4分，染色強度評分與陽性細(xì)胞評分的乘積作為免疫組化評分，免疫組化評分陰性為0～1分；+為3～5分；為6～8分；為9～12分，其中陽性為評分+、、例數(shù)之和。

1.3鼻咽癌C666-1細(xì)胞分組 鼻咽癌C666-1細(xì)胞分為3組：siRNA TRPC1組(鼻咽癌C666-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA TRPC1序列)；陰性對照組(鼻咽癌C666-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性對照序列)；空白對照組(鼻咽癌C666-1細(xì)胞未進(jìn)行轉(zhuǎn)染)。

1.4轉(zhuǎn)染后各組鼻咽癌C666-1細(xì)胞TRPC1蛋白表達(dá)測定 將鼻咽癌C666-1細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，取生長良好的鼻咽癌C666-1細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，以TRPC1單克隆抗體為一抗，以GAPDH為內(nèi)參照，采用Western印跡檢測鼻咽癌C666-1細(xì)胞TRPC1蛋白表達(dá)情況。

1.5轉(zhuǎn)染后各組鼻咽癌C666-1細(xì)胞TRPC1 mRNA表達(dá)測定 將鼻咽癌C666-1細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，提取鼻咽癌C666-1細(xì)胞總RNA，采用RT-PCR法測定鼻咽癌C666-1細(xì)胞中TRPC1 mRNA表達(dá)，反應(yīng)條件：95℃ 5 min，94℃ 10 s，52℃ 10 s，72℃ 60 s，共30個循環(huán)。

1.6轉(zhuǎn)染后各組鼻咽癌C666-1細(xì)胞增殖能力測定 取生長良好的各組鼻咽癌C666-1細(xì)胞接種到96孔板中，采用MTT法觀察細(xì)胞的增殖情況，分別取第1、3、7天細(xì)胞測定570 nm波長處光密度值。

1.7轉(zhuǎn)染后各組鼻咽癌C666-1細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期測定 采用流式細(xì)胞儀測定各組鼻咽癌C666-1細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期情況。

1.8轉(zhuǎn)染后各組鼻咽癌C666-1細(xì)胞遷移能力測定 采用Transwell實驗測定C666-1細(xì)胞的遷移能力。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗；計量資料多組均數(shù)比較采用方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD檢驗。

2 結(jié) 果

2.1鼻咽癌組織中TRPC1蛋白的表達(dá)情況 鼻咽癌組TRPC1蛋白陽性表達(dá)65例(81.3%)，明顯高于鼻咽慢性炎癥組〔15例(18.8%)〕(χ2=30.104,Plt;0.05)。見圖1。

2.2基因沉默TRPC1后各組細(xì)胞中TRPC1蛋白mRNA表達(dá)情況 si-TRPC1組C666-1細(xì)胞中TRPC1蛋白和mRNA的表達(dá)均低于陰性對照組和空白對照組(Plt;0.05)。見表1和圖2。

2.3基因沉默TRPC1后各組細(xì)胞增殖情況 第1天si-TRPC1組、陰性對照組和空白對照組C666-1細(xì)胞OD值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)；第3天和第7天si-TRPC1組C666-1細(xì)胞OD值低于陰性對照組和空白對照組(Plt;0.05)。見表2。

圖1 鼻咽癌組織和鼻咽慢性炎癥組織中TRPC1蛋白的表達(dá)情況(DAB,×400)

組別TRPC1蛋白TRPC1mRNASi-TRPC1組0.387±0.0120.425±0.047陰性對照組0.853±0.0171)0.832±0.0581)空白對照組0.862±0.0321)0.847±0.0531)F/P值51.243/0.00034.267/0.000

與si-TRPC1組比較：1)Plt;0.05；下表同

圖2 Western印跡測定TRPC1蛋白的表達(dá)情況

組別第1天第3天第7天si-TRPC1組0.342±0.0190.488±0.0471.126±0.084陰性對照組0.338±0.0210.721±0.0761)1.768±0.0921)空白對照組0.351±0.0170.736±0.0711)1.775±0.1011)F值0.95714.75163.264P值0.4250.0000.000

2.4基因沉默TRPC1后各組細(xì)胞周期變化情況 si-TRPC1組、陰性對照組和空白對照組C666-1細(xì)胞G2期比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05);si-TRPC1組C666-1細(xì)胞G1期比例高于陰性對照組和空白對照組(Plt;0.05)，S期比例低于陰性對照組和空白對照組(Plt;0.05)。見表3。

2.5基因沉默TRPC1后各組細(xì)胞凋亡變化情況 si-TRPC1組、陰性對照組和空白對照組C666-1細(xì)胞早期凋亡比例比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)，其中si-TRPC1組C666-1細(xì)胞早期凋亡比例(7.352%±0.183%)高于陰性對照組(3.782%±0.214%)和空白對照組(3.746%±0.201%，F(xiàn)=46.364,Plt;0.05)。

2.6基因沉默TRPC1后各組細(xì)胞侵襲力比較 si-TRPC1組C666-1細(xì)胞侵襲力(127.57±35.47)低于陰性對照組(214.35±37.68)和空白對照組(221.47±35.46，F(xiàn)=11.647,Plt;0.05)。見圖3。

表3 各組細(xì)胞周期情況

圖3 各組細(xì)胞侵襲力(×200)

3 討 論

TRP離子通道包括7個亞家族，TRPC為其亞家族成員之一，TRPC亞家族包括TRPC1、TRPC2、TRPC3、TRPC4、TRPC5、TRPC6、TRPC7共7個亞型，TRPC1主要在心臟、肺、腦、腎臟、皮膚、骨骼肌、卵巢、睪丸、前列腺等組織中呈高表達(dá)。TRPC1可以和TRPC3形成一具體，是最早發(fā)現(xiàn)的哺乳動物TRP通道，其功能主要為參與鈣依賴的、受體介導(dǎo)的腺體和平滑肌的收縮和分泌功能，參與介導(dǎo)鈣離子的進(jìn)入，維持體內(nèi)鈣離子和鎂離子平衡，并和鈣離子信號相關(guān)的多種生理過程有關(guān)，在細(xì)胞的分化、增殖、凋亡、遷移等過程中發(fā)揮重要作用。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣庫被消耗時，激活細(xì)胞上的TRPC1通道，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加，填充細(xì)胞內(nèi)鈣離子的不足。細(xì)胞內(nèi)鈣離子和腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，參與腫瘤的分化、生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，在增殖比較快的腫瘤細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平比較高，阻斷鈣離子內(nèi)流可以在一定程度上阻止肺癌、前列腺癌等惡性腫瘤細(xì)胞的生長〔7～9〕。能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，從而抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖和異常分化，從而引起腫瘤的浸潤和擴散，在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用〔10，11〕。本文中鼻咽癌組TRPC1蛋白陽性率明顯升高，考慮TRPC1在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

RNA干擾技術(shù)可以特異、有效、簡單地下調(diào)細(xì)胞中目的基因的表達(dá)，在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、藥物靶點篩選、功能基因組學(xué)等研究中被廣泛應(yīng)用〔12～16〕。本研究結(jié)果提示，TRPC1基因影響鼻咽癌C666-1細(xì)胞的生物學(xué)特性，能夠促進(jìn)C666-1細(xì)胞增殖，影響C666-1細(xì)胞周期，抑制C666-1細(xì)胞凋亡，促進(jìn)C666-1細(xì)胞侵襲，在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。TRPC1為鈣離子通道，其促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖、抑制鼻咽癌細(xì)胞凋亡可能與其調(diào)節(jié)鈣離子內(nèi)流有關(guān)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度在細(xì)胞增殖和凋亡、血管生成和基因轉(zhuǎn)錄方面也發(fā)揮重要作用；當(dāng)細(xì)胞膜上鈣離子通道異常，細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)被破壞，則可促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管生成，抑制細(xì)胞凋亡，從而引起腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移。

1Strazzulla A，Barreca GS，Giancotti A，etal.Nasopharyngeal carcinoma：review of the literature with a focus on therapeutical implications〔J〕.Infez Med，2015；23(3)：224-9.

2Lee AW，Ma BB，Ng WT，etal.Management of nasopharyngeal carcinoma：current practice and future perspective〔J〕.J Clin Oncol，2015；33(29)：3356-64.

3Chua ML，Wee JT，Hui EP，etal.Nasopharyngeal carcinoma〔J〕.Lancet，2016；387(10022)：1012-4.

4Fels B，Nielsen N，Schwab A.Role of TRPC1 channels in pressure-mediated activation of murine pancreatic stellate cells〔J〕.Eur Biophys J，2016；45(7)：657-70.

5張 駿，朱 震，李雄偉，等.SiRNA沉默TRPC1基因?qū)Ψ蜗侔〢549細(xì)胞增殖和侵襲的影響〔J〕.中華醫(yī)學(xué)雜志，2013；93(28)：2241-3.

6Lepannetier S，Zanou N，Yerna X，etal.Sphingosine-1-phosphate-activated TRPC1 channel controls chemotaxis of glioblastoma cells〔J〕.Cell Calcium,2016；60(6)：373-83.

7鐘長江，岳喜磊，李建華，等.TRPC1在 TGF-β1誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞遷移中的作用〔J〕.中國病理生理雜志，2016；32(2)：267-72.

8Selli C，Pearce DA，Sims AH，etal.Differential expression of store-operated calcium-and proliferation-related genes in hepatocellular carcinoma cells following TRPC1 ion channel silencing〔J〕.Mol Cell Biochem,2016；420(1-2)：129-40.

9阮 健，蔡紅兵，羅 蘭，等.TRPC1對人腎癌細(xì)胞A498增殖和遷移的影響〔J〕.熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2016；16(7)：825-8.

10Faouzi M，Hague F，Geerts D，etal.Functional cooperation between KCa3.1 and TRPC1 channels in human breast cancer：Role in cell proliferation and patient prognosis〔J〕.Oncotarget,2016；7(24)：36419-35.

11Guéguinou M，Harnois T，Crottes D，etal.SK3/TRPC1/Orai1 complex regulates SOCE-dependent colon cancer cell migration：a novel opportunity to modulate anti-EGFR mAb action by the alkyl-lipid Ohmline〔J〕.Oncotarget,2016；7(24)：36168-84.

12Feijó RG，Braga AL，Lanes CF，etal.Silencing of gonad-inhibiting hormone transcripts in litopenaeus vannamei females by use of theRNA interference technology〔J〕.Mar Biotechnol (NY),2016；18(1)：117-23.

13俞芽法，鄭振中.Fgl2-shRNA基因沉默對糖尿病大鼠心功能的改善及心肌病理形態(tài)變化〔J〕.西安交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2015；36(5)：605-8.

14Gonzalez-Rodriguez A，Valverde AM.RNA interference as a therapeutic strategy for the treatment of liver diseases〔J〕.Curr Pharm Des，2015；21(31)：4574-86.

15張 偉，劉雪芹，苗 苗，等.20S蛋白酶體β5亞單位基因沉默對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力的影響〔J〕.解剖學(xué)雜志，2015；38(2)：153-6.

16Iulia Irimie A，Braicu C，Zanoaga O，etal.Inhibition of tumor necrosis factor alpha using RNA interference in oral squamous cell carcinoma〔J〕.J BUON，2015；20(4)：1107-14.

〔2017-01-15修回〕

(編輯 徐 杰)

R76

A

1005-9202(2017)22-5538-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.022

福建省科技廳項目(2016J01521)

王佳蓉(1973-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事過敏性鼻炎的基礎(chǔ)和臨床研究。