顧 芳，汪慎燚，秦宜德

(安徽醫(yī)科大學 生物化學與分子生物學教研室，合肥 230032)

微型制備型電泳比較從細胞中提取蛋白質的3種方法

顧 芳，汪慎燚，秦宜德

(安徽醫(yī)科大學 生物化學與分子生物學教研室，合肥 230032)

為探索建立適用于從人卵巢癌細胞株SKOV3中提取蛋白質的最優(yōu)化方法，通過培養(yǎng)人卵巢癌細胞株SKOV3，分別采用Pull-Down Lysis、RIPA裂解法和加有硫脲的細胞裂解液提取細胞總蛋白，使用 Bradford法測定蛋白質濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE )分析，然后使用微型制備型電泳分離蛋白，根據(jù)色譜圖上的吸收峰比較從人卵巢癌細胞株SKOV3細胞中提取蛋白質的3種方法。結果表明：不同方法提取人卵巢癌細胞株SKOV3總蛋白的豐度及色譜圖存在差異，Pull-Down Lysis 試劑法在分離相對分子質量為15～80 kDa的蛋白質方面具有明顯的優(yōu)勢。3種方法中以Pull-Down Lysis 試劑法為人卵巢癌細胞株SKOV3蛋白質提取的最優(yōu)方法，與微型制備型電泳的兼容性更好。

蛋白質提?。?SKOV3細胞； 制備型電泳； 優(yōu)化方法

0 引 言

凝膠電泳和毛細管電泳技術廣泛應用于核酸、蛋白質等生物物質的分析領域[1-2]。但是，由于電泳技術不易放大，有關制備型電泳技術的研究報道很少[3-5]。1997年，Cole 等利用設計的一套可在線收集樣品的制備型電色譜裝置，實現(xiàn)了標準蛋白質混合物的分離[6-7]。本實驗所用的微型制備型電泳為美國BIO-RAD公司生產，它將凝膠電泳、毛細管電泳技術及色譜分析技術相結合，能快速、有效地分離核酸和蛋白質等生物大分子。它能分離相對分子質量差別僅有2%的蛋白，通過非變性PAGE膠純化等電點只相差0.1pH單位的蛋白。但它對樣品的質量要求比較高，因此樣品的制備是制備型電泳分析中最重要的環(huán)節(jié)，它直接影響后續(xù)的研究分析。

本文實驗以人卵巢癌細胞株SKOV3為對象，比較3種不同的蛋白質提取方法，即Pull-Down Lysis、RIPA裂解法和加有硫脲的細胞裂解液法，了解不同裂解液的提取蛋白效率以及它們與制備型電泳的兼容性，從而建立SKOV3細胞總蛋白的相對最優(yōu)提取方法。

1 材料與方法

1.1材料

人卵巢癌細胞株SKOV3由本實驗室保存。DMEM培養(yǎng)液購自美國GIBCO 公司,胎牛血清購于杭州四季青公司。胰蛋白酶、丙酮酸鈉和谷氨酰胺均購自美國 AMRESCO 公司。二氧化碳培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，超聲破碎儀是美國Sonics。微型制備型電泳購于美國BIO-RAD公司，型號為Mini Prep Cell。

1.2細胞培養(yǎng)

培養(yǎng)SKOV3細胞，接種于含10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液中，在37 ℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱里培養(yǎng)。待單細胞層接近匯合時，用0.1%的胰酶(含0.1 mol/L EDTA)消化，分別以 5×104個/mL的密度接種于直徑為100 mm的3個細胞培養(yǎng)皿中，24 h后換液并繼續(xù)培養(yǎng)24 h，提取蛋白質(此時每皿細胞數(shù)達到1×107個)。

1.3細胞總蛋白的提取

Pull-Down Lysis 試劑法：用胰酶消化后離心收集細胞，用預冷的 PBS洗滌細胞3次，加Pull-Down Lysis試劑(1 mL每1×107個細胞)，在冰上靜置裂解30 min，期間顛倒混勻數(shù)次，4 ℃、12 000g離心20 min后，取上清儲存于-80 ℃冰箱備用。

RIPA裂解法 ：離心收集胰酶消化的細胞后，用預冷的PBS 洗細胞3次，然后加500 μL RIPA，RIPA buffer中加入PMSF 5 μL放于冰上靜置裂解30 min。超聲(180 W)10次，每次10 s，間隔 10 s，最后以4 ℃，12 000g離心20 min后，取上清儲存于-80 ℃冰箱備用。

硫脲裂解法(參照 Herman 等[8]的方法) ：離心收集到的細胞經預冷的PBS洗2次后，在1×107個細胞中加含硫脲裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%CHAPS，現(xiàn)加 65 mmol/L DDT)1 mL。放于冰上靜置裂解30 min，再超聲180 W，每次工作10 s，間隔10 s，最后以4 ℃，12 000g離心20 min，取上清儲存于-80 ℃冰箱備用。

1.4蛋白質定量

采用Bradford法[9-11]定量，以牛血清白蛋白標準溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線,計算蛋白濃度。

1.5聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

采用SDS-PAGE非連續(xù)變性電泳檢測：12%濃度的分離膠，4%濃度的濃縮膠，沸水浴5 min后上樣。用考馬斯亮藍R-250染色。

1.6微型制備型電泳分析

采用Native-PAGE[12]非變性膠:10%濃度的下層膠，4%濃度的上層膠。分別取含30 μL上述方法提取的總蛋白質液與上樣緩沖液混合，用注射器穿過上槽緩沖液的液面,將樣品緩緩加到微型制備型電泳儀的膠面，將電源調制恒流6 mA,啟動電源，并接通核酸蛋白檢測儀和自動部分收集器。

2 結果與分析

2.1標準曲線的繪制及蛋白質含量、濃度的對比分析

由圖1可知，牛血清白蛋白濃度與吸收度A在0～0.8 g/L范圍內線性關系良好，其回歸方程為：Y=0.815X-0.810(R2=0.992)。由此對3種蛋白提取方法得到的蛋白質含量及濃度對比分析見表1。

圖1 牛血清白蛋白的標準曲線

表1 3種提取蛋白方法蛋白質含量及濃度比較

從表1可見，3種提取蛋白方法從蛋白質含量和蛋白質濃度上看，Pull-Down Lysis 試劑法優(yōu)于細胞裂解法和硫脲裂解法。

2.2蛋白質的SDS-PAGE電泳分析

在細胞數(shù)相同、不同方法提取蛋白后終體積相同、 電泳上樣體積相同的條件下，電泳結果如圖2所示。

從圖2可以看出，蛋白質帶型基本不變，但泳道2所示蛋白質條帶著色較深，蛋白質含量較高；泳道1和泳道3蛋白質條帶著色淺，蛋白質含量較低，其結果與蛋白質含量及濃度計算相吻合。進一步表明Pull-Down Lysis 試劑法適合作為SKOV3細胞總蛋白的提取方法。

1-RIPA裂解法；2-Pull-Down Lysis試劑法；3-硫脲裂解法圖2 3種方法提蛋白SDS-PAGE電泳圖譜

2.3微型制備型電泳分析

樣品通過微型制備型電泳分離由核酸蛋白檢測儀檢測到的吸收峰經HD-A電腦采集器分析結果如下：圖3(b)出峰數(shù)及峰面積均高于圖3(a)及圖3(c)。出峰時間圖3(c)晚于圖3(a)及圖3(b)，圖3(a)的出峰時間稍早于圖3(b)，基本一致,表明樣品濃度不同出峰時間會有差別。

(a) RIPA裂解法

(b) Pull-Down Lysis試劑法

(c) 硫脲裂解法圖3 3種方法提取總蛋白的吸收峰色譜圖

3 結 論

本研究所用的微型制備型電泳是一種設計精巧的核酸蛋白樣品分離純化系統(tǒng)。它的功能就是從樣品中分離純化出目標蛋白或者目標核酸。樣品在柱狀膠中進行電泳，蠕動泵給予樣品洗脫以動力，帶動樣品從凝膠柱中流出，流出的樣品被分子截留膜截留后，經過陶瓷冷卻棒中心的管道流經紫外檢測儀，最后為自動部分收集器收集以便進行后續(xù)研究。電泳儀的電泳液經循環(huán)泵和陶瓷冷卻棒，保持一定溫度，保證樣品條帶平行地洗脫，并可以最大限度地確保在用非變性膠分離純化樣品的過程中，保持樣品活性。

樣品的質量是微型制備型電泳分析中最關鍵的環(huán)節(jié)之一，直接影響制備型電泳的分辨率和可靠性。本研究采取了3種從SKOV3細胞中提取總蛋白的方法，發(fā)現(xiàn)相比其他兩種方法，Pull-Down Lysis 試劑法步驟少，操作簡單快速，蛋白質得率高。RIPA裂解法是比較常用的提取蛋白的方法，含有高效去垢劑成分1%NP-40,可以破壞脂質雙分子層[13]。硫脲是高效率的變性劑，能溶于高濃度的尿素溶液，從而改善疏水性膜蛋白的溶解性。提取液中所加的 CHAPS 是兼性分子，不帶凈電荷，能溶于高濃度的尿素溶液，可以進一步提高蛋白質的溶解性[14-15]。但RIPA裂解法和硫脲裂解法解法提取蛋白的步驟相對較多、耗時比較長，可能會引起蛋白的降解。從制備型電泳分離的色譜圖看，Pull-Down Lysis試劑法在分離相對分子質量為15～80 kDa的蛋白質方面具有明顯的優(yōu)勢，色譜圖分辨率更高結果重復性好，有利于后續(xù)的蛋白質研究和分析。當然該試劑的分離純化效率與樣品來源關系密切，所以需針對來源不同的樣本探索選擇適宜的提取方法。

通過本實驗，3種方法中以Pull-Down Lysis 試劑法為SKOV3 細胞的蛋白質提取的最優(yōu)方法，與微型制備型電泳的兼容性更好。

[1] Garcia A A，Bonen M R，Ram irez-Vick J，etal．Bioseparation physical form s of plasmid DNA using a combination of low electric Process Science[M].Beijing: Tsinghua University Press，2002：277-298．

[2] 吳娟芳，陳令新，羅國安，等.毛細血管技術在藥物分析中的研究進展[J].藥學學報，2006，41(5)：385-389.

[3] 馮 蕾，趙風生．制備型電泳法分離腺苷酸混合物[J].化學與生物工程，2009，26 (4) ：50-54．

[4] Karim S，Aoyama M.Separation of Humic Acid Constituents by Polyacrylamide Gel EIectro phoresis in the Presence of Concentrated Urea Using a Preparative Electrophoresis System[J].Humic Acid，2012(6):28-31.

[5] 郝斐然，付 斌，張養(yǎng)軍，等.基于電遷移的蛋白質制備技術和方法新進展[J].色譜，2015,33(12)：1226-1233.

[6] Cole K D，Cabezas H J．Improved preparative electrochromatography column design[J].Journal of Chromatography A，1997，3(10)：57-62．

[7] Tellez C M，Cole K D．Preparative electrochr omatography of proteins in various types of porous media[J].Electrophoresis，2000,21(5)：1001-1009.

[8] Herman E M，Helm R M，Jung R，etal．Genetic modification removes an immunodominant allergen from soybean [J].Plant Physiology,2003, 132 : 36-43．

[9] Bradford M M．A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Anal Biochem,1976, 72(5):248-254.

[10] 李 寧．幾種蛋白質測定方法的比較[J].山西農業(yè)大學學報，2006，26(2)：132-134．

[11] 解 毅．油菜種子微粒體制備及蛋白濃度檢測方法研究[J].安徽農業(yè)科學，2011，39(15)：8885-8886．

[12] 郭堯君.蛋白質電泳實驗技術[M].北京 ：科學技術出版社，2005,98-105.

[13] 李 陽，龔依伊，謝亦林，等.小型豬發(fā)育期牙胚蛋白提取方法探討[J].口腔生物醫(yī)學，2015,6(2)：83-86.

[14] Zou Q，Habermann-Rottinghans S M，Murphy K P.Urea effents on protein stability:hydrogen bonding and the hydrophobic effect [J].Proteins,1998,31(2)：107-115.

[15] Herbert B.Advances in protein solubilisation for two-dimensional electrophoresis[J].Electrophoresis,1999,20(4～5):660-663.

ComparisonofThreeProteinExtractionMethodsbyMiniPreparativeElectrophoresis

GUFang，WANGShenyi，QINYide

(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Anhui Medical University, Hefei 230032, China)

Protein extraction from tissue or cells is an important step to effect high-resolution protein separation by preparative electrophoresis.Three protein extraction methods were compared in order to determine an optimal one for human ovarian cancer cell line SKOV3.The three methods including Pull-Down Lysis kit, RIPA lysis buffer and Thiourea lysis buffer were adopted to extract the total protein from human ovarian cancer cell line SKOV3.The protein concentration was determined by Bradford protein assay for calculation of the protein yield, and then the protein samples were separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide electrophoresis(SDS-PAGE)and preparative electrophoresis.Data showed the protein yielded by the method of using Pull-Down Lysis kit is high.The Pull-Down Lysis method generated the best resolution in which most proteins with molecular weight from 15 kDa to 80 kDa were distributed.Experiment showed that the Pull-Down Lysis method has the best protein solubilization ability in three protein extraction methods．

protein extraction; SKOV3 cells; mini preparative electrophoresis; optimization mathod

R 34

A

1006-7167(2017)10-0021-03

2017-01-12

國家自然科學基金資助項目(81472448) ；安徽省自然科學基金資助項目(1508085MH196)

顧 芳(1978-)，女，安徽合肥人，博士生，實驗師，研究方向為生物活性肽及實驗教學與管理。Tel.：13855120256; E-mail：wsxgf2013@163.com

秦宜德(1962-)，男，安徽合肥人，博士，教授，研究方向為生物活性肽。Tel.：0551-65161131;E-mail：qinyide@hotmail.com