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(1 防化研究院，北京 102205；2 北京理工大學(xué)，北京 100081)

針頭噴霧常壓離子化質(zhì)譜技術(shù)對(duì)化生物質(zhì)的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)研究

司昕宇1胡麗麗2張眾垚1李翠萍1，*徐偉2，*

(1 防化研究院，北京 102205；2 北京理工大學(xué)，北京 100081)

近年來常壓離子化技術(shù)在對(duì)特定物質(zhì)的快速現(xiàn)場(chǎng)質(zhì)譜檢測(cè)提供了一條很好的技術(shù)途徑。本文針對(duì)該技術(shù)領(lǐng)域，提出了一種新型的針頭噴霧常壓離子化方法，在離子阱質(zhì)譜儀上采用化學(xué)毒劑模擬劑(DMMP)樣品及其與污水的混合液體、Met-Arg-Phe-Ala(MRFA)肽段生物樣品進(jìn)行了噴霧實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了這種新的噴霧方法對(duì)復(fù)雜樣品的直接質(zhì)譜檢測(cè)分析性能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，針頭噴霧離子化質(zhì)譜技術(shù)能夠?qū)RFA肽段生物樣品進(jìn)行檢測(cè)，最低檢測(cè)限為5 ng/mL；對(duì)DMMP液體樣品進(jìn)行在線直接檢測(cè)，最低檢測(cè)限為1 ng/mL，檢測(cè)時(shí)間為1.5 min。通過與Nano-ESI噴霧離子化方法對(duì)比實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用本文方法檢測(cè)得到的離子流強(qiáng)度是Nano-ESI方法的2倍，同時(shí)離子流信號(hào)也較穩(wěn)定，是一種適合戰(zhàn)場(chǎng)化生在線快速檢測(cè)的新型離子化質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)。

常壓離子源 針頭噴霧 MRFA肽段 DMMP

1 前言

質(zhì)譜儀具有檢測(cè)種類廣譜、靈敏度高、動(dòng)態(tài)范圍寬、定性準(zhǔn)確等諸多優(yōu)勢(shì)。針對(duì)化生毒劑檢測(cè)，質(zhì)譜技術(shù)的廣譜性表現(xiàn)為對(duì)不同形態(tài)(氣體、液體、固體)的已知或未知物質(zhì)，可覆蓋從小分子化學(xué)物質(zhì)(含非蛋白毒素)到大分子生物毒劑(含蛋白毒素、細(xì)菌及其他微生物)的一體化檢測(cè)，因此，在當(dāng)前化生恐怖日益嚴(yán)重的大背景之下，質(zhì)譜儀作為應(yīng)對(duì)化生武器襲擊、化生恐怖威脅、化生事故救援的有效檢測(cè)工具，在防范化生威脅中扮演了重要的角色。

離子源技術(shù)是質(zhì)譜儀中的關(guān)鍵一環(huán)，電子轟擊離子源、化學(xué)電離離子源等早期離子源，實(shí)現(xiàn)了小分子化合物的質(zhì)譜檢測(cè)，但這些離子源需要工作在真空條件下，且應(yīng)用領(lǐng)域有限。常壓離子化(Ambient Ionization)技術(shù)是指在大氣壓及樣品原始環(huán)境下產(chǎn)生離子的技術(shù)，不需要或僅僅簡(jiǎn)單地對(duì)樣品進(jìn)行提前處理，同時(shí)可對(duì)樣品進(jìn)行在線直接電離，告別了高電壓、高真空等苛刻的條件，只需質(zhì)量分析器和檢測(cè)器處在真空中即可。因此常壓離子化技術(shù)很好的克服了上述傳統(tǒng)離子化技術(shù)前端進(jìn)樣系統(tǒng)的缺點(diǎn)，無需放置到真空腔中，為實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)在線和原位快速檢測(cè)提供了前端條件的保障，是一種非常適合戰(zhàn)場(chǎng)偵測(cè)的離子化技術(shù)。

近年來，各種新型常壓離子源技術(shù)迅猛發(fā)展，出現(xiàn)了多種的新型離子源，從解析電噴霧電離(Desorption Electro spray Ionization，DESI)[1,2]、直接實(shí)時(shí)分析電離(Direct Analysis in Real Time, DART)[3,4]到紙噴霧電離(Paper Spray, PS)[5,6]、葉片噴霧電離(Leaf Spray)[7]、牙簽噴霧電離(Toothpick spray)[8]、納升電噴霧電離(Nano-ESI)[9]等。這些常壓離子源不斷出現(xiàn)，其目的都是為了提供一種更加快速簡(jiǎn)單的、可以減少對(duì)樣品的預(yù)處理的過程電噴霧方式，達(dá)到實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速質(zhì)譜檢測(cè)的目的。

本文針對(duì)這種需要提出了一種新的針頭噴霧常壓離子化方法，采用一次性的醫(yī)用注射器與孔徑分離膜相結(jié)合作為噴霧離子源，與HCT離子阱質(zhì)譜儀結(jié)合進(jìn)行了離子化條件的研究，并開展了對(duì)MRFA肽段為代表的生物大分子的檢測(cè)以及DMMP為代表的化學(xué)毒劑模擬劑液體及其與污水混合樣品的直接在線質(zhì)譜檢測(cè)。

2 樣品與儀器

2.1 樣品來源

Met-Arg-Phe-Ala(MRFA)肽段、甲醇、采購于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；實(shí)驗(yàn)用純凈水購于浙江娃哈哈公司；甲基磷酸二甲酯(dimethyl methylphosphonate, DMMP)采購于北京化學(xué)藥劑有限公司；污水由實(shí)驗(yàn)拖布污水桶中獲得。

2.2 樣品配置

取MRFA固體1 mg作為溶質(zhì)，1 mL體積比為1∶1的甲醇水溶液作為溶劑，配置濃度為1000 μg/mL的MRFA甲醇水溶液母液，稀釋母液至不同濃度。

取1 mg DMMP液體作為溶質(zhì)，用甲醇溶液作為溶劑，將溶質(zhì)定容至1mL，得到濃度1000 μg/mL的甲基磷酸二甲酯溶液，再用體積比為1∶1的甲醇和污水的混合溶液(污水來自實(shí)驗(yàn)室污水桶)稀釋母液至不同濃度。

2.3 實(shí)驗(yàn)儀器

所有的實(shí)驗(yàn)質(zhì)譜結(jié)果都來自于Bruker HCT 離子阱質(zhì)譜儀，氮?dú)庥米鞲稍餁怏w，使用正離子模式。微流注射泵采用model KDS-100，一次性醫(yī)用注射器(內(nèi)徑0.25mm)購于江蘇治宇醫(yī)用設(shè)備公司，孔徑膜購于天津津騰實(shí)驗(yàn)儀器公司。Nano噴霧管由Nano-ESI所用玻璃毛細(xì)管的尖端直徑為5 μm，內(nèi)徑為0.8 mm，外徑為1.5 mm，通過Sutter Instrument公司型號(hào)為P-1000拉管儀獲得。

3 實(shí)驗(yàn)方法、結(jié)果及討論

針頭噴霧離子源就是采用醫(yī)療用一次性醫(yī)用注射器，在針頭處裝填內(nèi)徑為0.2 mm的純銅漆包線后，再對(duì)針頭施加直流高壓，這樣常規(guī)的醫(yī)用針頭就可以作為樣品的采集和噴霧離子源，其操作流程如圖1所示。對(duì)污水樣品無需進(jìn)行萃取等預(yù)處理工作，使用醫(yī)用針頭提取樣品后，便可直接進(jìn)行樣品的噴霧檢測(cè)，提取樣品時(shí)間大約需要20 s；對(duì)針頭噴霧離子化方法外加電壓，將醫(yī)用針頭安裝在微流注射泵、設(shè)置參數(shù)等大約需要40 s；對(duì)計(jì)算機(jī)操作，得到質(zhì)譜結(jié)果大約需要30 s。從提取樣品到得到結(jié)果總共需要的時(shí)間大約為1.5 min，體現(xiàn)了針頭噴霧離子化方法在快速質(zhì)譜檢測(cè)中的速度優(yōu)勢(shì)。

圖1 針頭噴霧的流程圖

在實(shí)驗(yàn)中采用如下的針頭噴霧離子化參數(shù)：針頭的外加電壓設(shè)置為3.4 kV、針頭與質(zhì)譜儀入口的夾角為30度、微流注射泵的推速為10 μL/h。

為了驗(yàn)證該噴霧方法可以對(duì)生物大分子進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)中選取MRFA作為待測(cè)樣品。MRFA是一種無色粉末狀物質(zhì)，其分子式為 C23H37N7O5S，相對(duì)分子質(zhì)量為523.6 Da。記錄對(duì)不同濃度的MRFA溶液進(jìn)行針頭質(zhì)譜檢測(cè)的總特征離子流強(qiáng)度，如表1所示，得到的線性回歸曲線如圖2所示，測(cè)試得到的最低檢測(cè)限LOD為5ng/mL、線性度R2= 0.9878。最低檢測(cè)限的質(zhì)譜圖如圖3所示，對(duì)m/z=524的特征峰進(jìn)行二次碎裂，得到圖3中的m/z=506是樣品分子去掉一個(gè)羥基的碎片峰，m/z=271是樣品分子去掉苯丙氨酸與丙氨酸分子基團(tuán)得到的碎片峰。

表1 MRFA的在不同濃度下質(zhì)譜檢測(cè)的總特征離子流強(qiáng)度

圖2 MRFA肽段檢測(cè)的線性回歸曲線

圖3 5 ng/ml的MRFA肽段檢測(cè)的質(zhì)譜圖

為了驗(yàn)證針頭噴霧的離子化效果，將針頭噴霧離子化方法與Nano-ESI離子化方法進(jìn)行對(duì)比。圖4是對(duì)濃度為1 μg/mL的MRFA樣品總離子流強(qiáng)度隨分析時(shí)間變化的記錄圖。其中上方曲線是針頭噴霧的離子流強(qiáng)度，下方曲線為Nano-ESI的離子流強(qiáng)度(Nano-ESI外加電壓為0.7 kV)。在10分鐘內(nèi)，針頭噴霧離子化方法與Nano-ESI離子化方法相比對(duì)于同樣濃度的MRFA樣品，得到的信號(hào)強(qiáng)度約為Nano-ESI的2倍，表現(xiàn)為離子流信號(hào)強(qiáng)度更高，離子流信號(hào)也比較穩(wěn)定。同時(shí)證明針頭噴霧可以長(zhǎng)時(shí)間提供穩(wěn)定的噴霧。

圖4 針頭噴霧與Nano-ESI的檢測(cè)性能對(duì)照結(jié)果

為了驗(yàn)證這種噴霧離子化方法對(duì)于復(fù)雜樣品可以直接進(jìn)行質(zhì)譜分析，而不需要萃取、過濾等預(yù)處理過程，實(shí)驗(yàn)中對(duì)化學(xué)毒劑模擬劑與污水混合樣品進(jìn)行了針頭噴霧離子化質(zhì)譜分析。甲基磷酸二甲酯(dimethyl methylphosphonate, DMMP)是神經(jīng)性化學(xué)毒劑GB的模擬劑，其分子式為C3H9O3P，相對(duì)分子質(zhì)量為124.08 Da，是一種低黏度無色或淺黃色透明液體，揮發(fā)性較好。對(duì)DMMP的液體和污水(由實(shí)驗(yàn)拖布污水桶中取樣)混合樣品進(jìn)行針頭噴霧質(zhì)譜檢測(cè)，獲得記錄采用針頭噴霧質(zhì)譜檢測(cè)方法對(duì)不同濃度的甲基磷酸二甲酯污水溶液的離子流強(qiáng)度，如表2所示，得到的線性回歸曲線如圖5所示，得到的最低檢測(cè)限(LOD)為1ng/mL，最低檢測(cè)限的質(zhì)譜圖如圖6所示，其中，m/z=125是樣品分子結(jié)合H+后的特征峰，m/z=109是樣品分子掉一個(gè)甲基后形成的碎片峰，m/z=94是再去掉一個(gè)甲基得到的碎片峰。

表2 DMMP污水溶液在不同濃度下質(zhì)譜檢測(cè)得到的總特征離子流強(qiáng)度

圖5 DMMP污水溶液檢測(cè)的線性回歸曲線

圖6 1ng/ml的DMMP污水溶液檢測(cè)的質(zhì)譜圖

污水中含有細(xì)菌、灰塵等干擾物質(zhì)，在質(zhì)譜檢測(cè)中進(jìn)入質(zhì)譜儀會(huì)對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果造成干擾，同時(shí)也會(huì)對(duì)儀器造成污染等。但當(dāng)這些大顆粒物質(zhì)樣品在微流注射泵的推動(dòng)作用下流過微濾膜時(shí)，微濾膜會(huì)截留這些干擾物質(zhì)，起到過濾的效果。圖7為同樣的DMMP污水溶液在經(jīng)過微濾膜前后在電子倒置顯微鏡下的圖片對(duì)比結(jié)果，從圖7中可以清楚的看到一些大顆粒物質(zhì)已經(jīng)被被微濾膜過濾。同時(shí)微濾膜由均勻的連續(xù)體構(gòu)成，過濾時(shí)沒有介質(zhì)的脫落，不會(huì)造成對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生二次干擾的影響，圖6的質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果幾乎沒有干擾峰也可以說明這一結(jié)果。

圖7 微濾膜對(duì)污水液體樣品進(jìn)行過濾前后的對(duì)比圖

4 結(jié) 論

醫(yī)用針頭作為一種廉價(jià)、易獲取的常見醫(yī)療器械，獲取十分方便，同時(shí)不銹鋼針頭堅(jiān)固耐用，可以應(yīng)對(duì)在復(fù)雜環(huán)境下液體的樣品提取工作，本文采用一次性醫(yī)用針頭作為樣品的采集、運(yùn)輸載體，同時(shí)承擔(dān)常壓離子源的角色，對(duì)MRFA溶液進(jìn)行針頭噴霧檢測(cè)，得到的最低檢測(cè)限為5 ng/mL；將其與常用的Nano-ESI技術(shù)進(jìn)行對(duì)比，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其離子化效率約為Nano-ESI離子化方法的2倍；同時(shí)針對(duì)DMMP的污水樣品進(jìn)行了針頭噴霧離子化質(zhì)譜檢測(cè)，得到DMMP污水樣品的最低檢測(cè)限達(dá)到了1 ng/mL。

一次性的醫(yī)用針頭與微濾膜總價(jià)在2元左右，價(jià)格低廉，同時(shí)一次性使用也避免了反復(fù)操作帶來的對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。從樣品采樣到得到質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果大約只需要1.5分鐘左右，操作時(shí)間短。最重要的是，針頭噴霧可以直接進(jìn)行取樣分析，不需要對(duì)復(fù)雜樣品進(jìn)行提純等預(yù)處理工作。因此，在未來戰(zhàn)場(chǎng)上進(jìn)行化生檢測(cè)時(shí)，對(duì)士兵進(jìn)行簡(jiǎn)單培訓(xùn)后即可完成操作?？梢?，這種新型的常壓離子化質(zhì)譜檢測(cè)方法對(duì)于在戰(zhàn)場(chǎng)條件或化生毒劑襲擊現(xiàn)場(chǎng)實(shí)現(xiàn)對(duì)化生毒劑和有毒物質(zhì)的在線快速檢測(cè)具有重要的意義，在未來的生化物質(zhì)的快速檢測(cè)中展現(xiàn)了較好的發(fā)展前景。

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Studyonfielddetectionofchemicalandbiologicalsubstancebyambientneedlesprayionizationmassspectrometry.

SiXinyu1,HuLili2,ZhangZhongyao1,LiCuiping1,XuWei2*

(1.InstituteofChemicalDefense,Beijing102205,China; 2.BeijingInstituteofTechnology,Beijing100081,China)

Nowadays, ambient ionization provides a technological approach to fast-field mass spectrometry detection of specific substance. Focusing on this field, we presented a new ambient ionization method called needle spray. Spray test with an ion trap mass spectrometer was carried on using chemical agent simulant-DMMP and sewage mixed solution as well as biological sample-MRFA to test the performance of direct mass spectrometry analysis for complexed samples by this new spray method. The results showed that needle spray could solve the problem of mass spectrometry determination of MRFA, and the LOD of MRFA reached 5ng/ml. Meanwhile, the LOD was 1 ng /ml for DMMP liquid sample, and it took 1.5 min for a test. Compared with the Nano-ESI contrast experiment, the TIC of needle spray was doubled and the ion intensity was more stable. Needle spray ionization mass spectrometry is a new mass spectrometry technique which is fit for fast-field chemical and biological detection in battlefield.

ambient ionization；needle spray； MRFA； DMMP

10.3969/j.issn.1001-232x.2017.05.023

2017-05-26

司昕宇，男，1991年出生，防化研究院在讀研究生，Email:417842042@qq.com。

李翠萍，E-mail:cuipingli86@126.com；徐偉，E-mail:weixu@bit.edu.cn。