David Machaku,周丹鳳,林 琳,司振軍,劉士旺,2,魏培蓮,2

(1.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院,杭州 310023;2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù) 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,杭州 310023;3.浙江大學(xué) 生物工程研究所,杭州 310027)

出芽短梗霉發(fā)酵產(chǎn)liamocin的培養(yǎng)條件研究

David Machaku1,周丹鳳1,林 琳1,司振軍3,劉士旺1,2,魏培蓮1,2

(1.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院,杭州 310023;2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù) 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,杭州 310023;3.浙江大學(xué) 生物工程研究所,杭州 310027)

liamocin是出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)的某些菌株在發(fā)酵過程中分泌的一種多元醇酯,現(xiàn)已證明其具有抗腫瘤、抗菌、表面活性劑等多種作用。我們篩選獲得一株出芽短梗霉liamocin高產(chǎn)菌株,對(duì)其產(chǎn)liamocin的發(fā)酵條件進(jìn)行初步研究,并建立了一種濾紙片法測(cè)定liamocin含量的簡(jiǎn)便方法。研究結(jié)果顯示:菌株以葡萄糖、蔗糖、木糖作碳源,都可以有效產(chǎn)生liamocin;酵母提取物、硝酸鈉、玉米漿是比較適合的氮源;發(fā)酵過程中培養(yǎng)基pH值變化較大,培養(yǎng)基初始pH值為4～8時(shí),liamocin都可以較好地產(chǎn)出；培養(yǎng)基裝量對(duì)liamocin產(chǎn)量的影響較大。該研究結(jié)果可為liamocin發(fā)酵條件的進(jìn)一步優(yōu)化提供參考。

出芽短梗霉;重油;liamocin;發(fā)酵

出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)廣泛用于普魯蘭多糖(pullulan)[1-3]和聚蘋果酸(poly malic acid)[4-5]的生產(chǎn),1993年日本的Nagata等[6]在研究出芽短梗霉發(fā)酵產(chǎn)聚蘋果酸時(shí),發(fā)現(xiàn)某些菌株可分泌一種密度比水重的多元醇酯。該物質(zhì)在靜止時(shí)沉在培養(yǎng)基的底部,因此又稱重油(heavy oil),后被稱作liamocin。結(jié)構(gòu)分析顯示該多元醇酯頭部基團(tuán)為甘露醇或阿拉伯醇,尾部為3,5-二羥基癸酸的三聯(lián)體或四聯(lián)體[7-8]。現(xiàn)已證明該多元醇酯具有抗腫瘤[9-10]、抗菌[11]、表面活性劑[10,12]等多種作用,具有廣泛的應(yīng)用前景。目前出芽短梗霉發(fā)酵產(chǎn)liamocin的研究剛剛起步,已有研究主要集中在結(jié)構(gòu)鑒定、生物活性測(cè)定等方面,關(guān)于發(fā)酵條件的研究非常少。Price等[13]研究了不同糖和多元醇作為碳源對(duì)出芽短梗霉菌株NRRL50380產(chǎn)liamocin的影響,結(jié)果表明包括葡萄糖、蔗糖、木糖、果糖等在內(nèi)的多種糖都可以產(chǎn)liamocin,其中以蔗糖的產(chǎn)量較高。使用不同碳源時(shí),liamocin的結(jié)構(gòu)有所不同,其結(jié)構(gòu)主要與多元醇有關(guān),與尾部的關(guān)系不大。Leathers等[14]對(duì)出芽短梗霉以燕麥木聚糖、玉米纖維、小麥秸稈水解物等生物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)liamocin進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,燕麥木聚糖和小麥秸稈水解物可以較好地生產(chǎn)liamocin。以上主要是關(guān)于碳源的研究,而其他發(fā)酵條件諸如氮源、pH值、溶氧等對(duì)liamocin的影響尚缺乏系統(tǒng)的研究。本課題組在進(jìn)行聚蘋果酸發(fā)酵研究的時(shí)候分離到一株產(chǎn)liamocin的菌株,為提高其發(fā)酵產(chǎn)量,對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 微生物

出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)(本實(shí)驗(yàn)室篩選保存),馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)冰箱斜面保存,每2個(gè)月轉(zhuǎn)接1次。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面保藏培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,水1 000 mL,瓊脂15～20 g,pH值自然。

1.2.2 種子培養(yǎng)基

葡萄糖50 g,蛋白胨1 g,酵母提取物1 g,KH2PO40.5 g,MgSO4·7H2O 0.4 g,NaCl 1 g,水1 000 mL。

1.2.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖50 g,蛋白胨0.6 g,酵母提取物0.6 g,KH2PO40.4 g,MgSO4·7H2O 0.4 g,NaCl 1 g,水1 000 mL。其中,在進(jìn)行碳源優(yōu)化時(shí),其他成分均不變,使用質(zhì)量濃度50 g/L的不同碳源;在進(jìn)行氮源優(yōu)化時(shí),其他成分均不變,使用質(zhì)量濃度1 g/L的不同氮源。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 斜面培養(yǎng)

菌種接種于PDA培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d備用。

1.3.2 種子培養(yǎng)

250 mL三角燒瓶裝入50 mL培養(yǎng)基,接入兩環(huán)培養(yǎng)好的斜面菌種,于28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)2 d。

1.3.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

250 mL三角燒瓶裝入50 mL培養(yǎng)基,接入2 mL培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液,于28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)8 d。培養(yǎng)基裝量在優(yōu)化時(shí)有所不同。所有試驗(yàn)均做3個(gè)搖瓶,結(jié)果取平均值。

1.4 pH值的測(cè)定

用數(shù)顯臺(tái)式酸度計(jì)(上海越平PHS-3C)進(jìn)行測(cè)定。

1.5 liamocin的測(cè)定方法

liamocin的測(cè)定采取濾紙吸取稱重法。濾紙?jiān)?0 ℃的烘箱中烘干至恒重,稱取濾紙重量得W1。搖瓶發(fā)酵結(jié)束后室溫靜置1 h,使liamocin沉淀聚集在搖瓶底部,小心地將上層清液緩慢倒出,然后加入少量蒸餾水輕輕搖晃洗滌liamocin,靜置幾分鐘,將上層清液小心地倒出,如此反復(fù)洗滌3～5次,使上層清液澄清為止。將預(yù)先干燥的濾紙過濾吸取liamocin,盡量使liamocin完全吸收到濾紙上去,然后將含有l(wèi)iamocin的濾紙片置于60 ℃的烘箱中烘3～4 h,稱重得到W2。發(fā)酵液中l(wèi)iamocin質(zhì)量濃度的計(jì)算公式為:liamocin質(zhì)量濃度(g/L)=(W2-W1)/搖瓶中發(fā)酵液體積×1 000,其中(W2-W1)/搖瓶中發(fā)酵液體積為每毫升發(fā)酵液中的liamocin克數(shù),換算成1 L中的含量則乘以1 000。

2 結(jié)果與討論

2.1 liamocin測(cè)定方法的建立

liamocin的測(cè)定文獻(xiàn)中均采用有機(jī)溶劑提取法[8,10],即發(fā)酵結(jié)束后用甲基乙基酮提取發(fā)酵液及菌體中的liamocin,先用脫水劑除去liamocin中的水,然后采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或氣流干燥的方法將有機(jī)溶劑除去,最后稱重。這種方法操作比較復(fù)雜,所需時(shí)間也較長(zhǎng),不太適合發(fā)酵優(yōu)化時(shí)進(jìn)行大量樣品的測(cè)定。根據(jù)liamocin的特點(diǎn),本課題組建立了一種較為簡(jiǎn)單快速的方法,即濾紙片吸取稱重法,其具體操作流程和條件見1.5節(jié)。該方法僅吸取發(fā)酵液中的liamocin進(jìn)行測(cè)定,而菌體中尚未分泌出來的liamocin則無法測(cè)定。因此,相對(duì)于有機(jī)溶劑提取法,該方法測(cè)定的數(shù)值會(huì)偏低。另外,該方法是根據(jù)干燥前后的重量差來計(jì)算liamocin含量的,因此,干燥條件的控制可能會(huì)影響最終的測(cè)定結(jié)果。但只要嚴(yán)格控制固定的干燥條件,該方法用于發(fā)酵優(yōu)化中l(wèi)iamocin的測(cè)定還是可行的。圖1和圖2分別為發(fā)酵液中和濾紙吸取后liamocin的狀態(tài)。

圖1 發(fā)酵液中l(wèi)iamocin的狀態(tài)Fig.1 Liamocin in the broth

圖2 濾紙吸取后liamocin的狀態(tài)Fig.2 Liamocin in the filter paper

2.2 liamocin發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 不同碳源對(duì)liamocin產(chǎn)量的影響

分別以質(zhì)量濃度50 g/L的葡萄糖、蔗糖、木糖、麥芽糖、果糖和阿拉伯糖為碳源進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn),其產(chǎn)liamocin情況見表1。

由表1可知,麥芽糖作碳源的時(shí)候liamocin的產(chǎn)量最高,木糖、蔗糖和葡萄糖作碳源時(shí),菌株也能較好地產(chǎn)liamocin,產(chǎn)量均在2.5～3.5 g/L,而果糖和阿拉伯糖的產(chǎn)量則較低,因此不適合產(chǎn)liamocin。從發(fā)酵過程來看,雖然麥芽糖為碳源liamocin產(chǎn)量最高,但麥芽糖并不是最先產(chǎn)生liamocin的。葡萄糖和蔗糖先于麥芽糖產(chǎn)liamocin,但發(fā)酵結(jié)束時(shí)產(chǎn)量卻不高。分析其原因可能是在發(fā)酵后期,由于碳源的缺乏,liamocin被作為一種備用碳源而被利用。目前，已有文獻(xiàn)主要使用葡萄糖[8]和蔗糖[7,15]作為碳源,其中尤以蔗糖為多。由表1可以看出,木糖作為碳源也能夠較好地產(chǎn)生liamocin,雖然麥芽糖的產(chǎn)量比較高,但因其價(jià)格較高,不太適合大規(guī)模生產(chǎn)的需要。因此,出芽短梗霉產(chǎn)liamocin的適宜碳源可選用葡萄糖、蔗糖和木糖。

表1 發(fā)酵過程中不同糖產(chǎn)liamocin的情況Table 1 Liamocin production in the fermentation process with different carbon sources

注:“√”表示有肉眼可見的liamocin產(chǎn)生;“—”表示無肉眼可見的liamocin產(chǎn)生，表2同。

2.2.2 不同氮源對(duì)liamocin產(chǎn)量的影響

表2 氮源種類對(duì)liamocin產(chǎn)量的影響 Table 2 Effects of nitrogen sources on liamocin production

以質(zhì)量濃度50 g/L的葡萄糖作為碳源,分別以質(zhì)量濃度1 g/L的酵母提取物、硝酸鈉、玉米漿、牛肉膏、蛋白胨和硫酸銨為氮源進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn),其產(chǎn)liamocin情況見表2。

由表2可知,在所試驗(yàn)的氮源中,酵母提取物、硝酸鈉和玉米漿作氮源時(shí),菌株能夠較好地產(chǎn)生liamocin,牛肉膏、蛋白胨和硫酸銨作氮源時(shí)菌株則不產(chǎn)生liamocin。酵母提取物、硝酸鈉也被其他研究者[8]廣泛用于liamocin的生產(chǎn),蛋白胨也在使用,但通常是與酵母提取物一起使用[7,15]。氮源對(duì)liamocin產(chǎn)量的影響比較復(fù)雜,不僅僅受氮源種類的影響,氮源質(zhì)量濃度、C/N比值,甚至不同氮源使用導(dǎo)致的菌體量生長(zhǎng)情況、培養(yǎng)基pH值變化等都會(huì)影響產(chǎn)量。因此,今后有必要對(duì)氮源的影響作進(jìn)一步研究。

表3 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)發(fā)酵的影響 Table 3 Effects of initial pH of media on liamocin production

2.2.3 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)liamocin產(chǎn)量的影響

調(diào)整培養(yǎng)基的初始pH值分別為4、5、6、7、8進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn),發(fā)酵結(jié)束時(shí)測(cè)定liamocin產(chǎn)量和發(fā)酵液pH值,測(cè)定結(jié)果見表3。

由表3可知,培養(yǎng)基初始pH值在4～8范圍內(nèi)對(duì)liamocin產(chǎn)量的影響并不是很大,初始pH值為8時(shí)產(chǎn)量略高于其他pH值。對(duì)發(fā)酵結(jié)束時(shí)的pH值進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明在發(fā)酵過程中,培養(yǎng)基的pH值變化幅度比較大,無論初始pH值為多少,發(fā)酵結(jié)束時(shí)培養(yǎng)基的pH值均降到3～4之間,這在一定程度上解釋了為什么初始pH值對(duì)liamocin的產(chǎn)量影響不大。因搖瓶發(fā)酵無法在線進(jìn)行pH值的調(diào)節(jié),pH值對(duì)liamocin產(chǎn)量的影響有待通過發(fā)酵罐培養(yǎng)進(jìn)一步研究。

表4 培養(yǎng)基裝量對(duì)liamocin產(chǎn)量的影響 Table 4 Effects of the media filling volume on liamocin production

2.2.4 培養(yǎng)基裝量對(duì)liamocin產(chǎn)量的影響

以250 mL三角燒瓶進(jìn)行搖瓶培養(yǎng),調(diào)整培養(yǎng)基裝量分別為30、40、50、60 mL,發(fā)酵結(jié)果見表4。由表4可見,隨著培養(yǎng)基裝量的增加,liamocin產(chǎn)量有明顯的下降趨勢(shì),此結(jié)果揭示溶解氧可能對(duì)liamocin的產(chǎn)生具有較大的影響。但目前文獻(xiàn)中尚無關(guān)于裝量或溶解氧情況對(duì)liamocin發(fā)酵影響的報(bào)道,因此，此結(jié)論有待通過發(fā)酵罐發(fā)酵進(jìn)一步驗(yàn)證。

3 結(jié) 論

本研究建立了一種濾紙片快速測(cè)定liamocin含量的方法,該方法比有機(jī)溶劑提取法操作簡(jiǎn)便,更適合用于發(fā)酵優(yōu)化時(shí)大批量樣品的測(cè)定。通過發(fā)酵條件的初步研究,得到了適合liamocin發(fā)酵的一些基本數(shù)據(jù):葡萄糖、蔗糖、木糖作碳源,菌株都可以有效產(chǎn)生liamocin,氮源以酵母提取物、硝酸鈉、玉米漿較好,發(fā)酵過程中培養(yǎng)基pH值變化較大,發(fā)酵過程中pH值的及時(shí)有效控制有可能進(jìn)一步提高liamocin產(chǎn)量,培養(yǎng)基裝量對(duì)liamocin產(chǎn)量的影響較大。該研究結(jié)果為liamocin發(fā)酵條件的進(jìn)一步優(yōu)化提供了參考。但該研究結(jié)果均為搖瓶發(fā)酵得到,因搖瓶發(fā)酵中pH值、溶解氧等均無法在線監(jiān)測(cè)和調(diào)節(jié),有些結(jié)論還需要通過發(fā)酵罐發(fā)酵進(jìn)一步驗(yàn)證。

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FermentativeproductionofliamocinbyAureobasidiumpullulans

David Machaku1, ZHOU Danfeng1, LIN lin1, SI Zhenjun3, LIU Shiwang1,2, WEI Peilian1, 2

(1.School of Biological and Chemical Engineering, Zhejiang University of Science and Technology, Hangzhou 310023, Zhejiang, China; 2.Zhejiang Provincial Key Laboratory for Chemical and Biological Processing Technology of Farm Produce, Hangzhou 310023, Zhejiang, China; 3.Institute of Biological Engineering, College of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, Zhejiang, China)

Liamocin, a kind of polyol lipid produced by some strains ofAureobasidiumpullulansduring fermentation, has been proved to have anticancer activity, antibacterial activity and can function as biosurfactant. The research screened out a high-producing strain of liamocin, conducted a preliminary study on media and culture conditions for liamocin production, and developed a simple method for determining the amount of liamocin by filter paper. The results showed that glucose, sucrose and xylose were efficient carbon sources, and yeast extract, NaNO3and corn steep liquor were efficient nitrogen sources for liamocin production. During the fermentation, pH value of the media changed greatly, with the initial pH of media ranged from 4 to 8, liamocin could be efficiently produced. Moreover, the filling volume of the media affected the production of liamocin greatly. This study has paved a foundation for further fermentation optimization of liamocin fermentation conditions.

Aureobasidiumpullulans; heavy oils; liamocin; fermentation

Q93-335

A

1671-8798(2017)06-0414-05

10.3969/j.issn.1671-8798.2017.06.003

2017-05-12

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LY15C200014)

魏培蓮(1976— ),女,山東省鄒城人,副教授,博士,主要從事微生物菌種選育與發(fā)酵工程研究。E-mail:weipeilian@126.com。