陳桂蓮，黃惠娟，田黎明

橄欖苦甙對卵巢輻射損傷的防治效果

陳桂蓮1，黃惠娟1，田黎明2

目的探討橄欖苦甙減輕卵巢輻射損傷的效果及其機(jī)制。方法32只成熟雌性SD大鼠隨機(jī)分為4組，正常對照組和輻射組予蒸餾水10 mL/(kg·d),橄欖苦甙組和輻射+橄欖苦甙組予橄欖苦甙100 mg/(kg·d),連續(xù)灌喂12周。12周后，輻射組和輻射+橄欖苦甙組大鼠動(dòng)情期時(shí)，接受5 Gy的X線盆腔照射1次。輻射后7 d檢測血清抗苗勒氏管激素(AMH)、IL-1、IL-6和TNF-α含量，計(jì)算卵巢組織各級(jí)卵泡數(shù)。結(jié)果與正常對照組比較，輻射組血清AMH濃度顯著降低(Plt;0.05)，血清IL-1、IL-6、TNF-α濃度升高(Plt;0.05)；卵巢中卵泡數(shù)減少。與輻射組比較，輻射+橄欖苦甙組血清AMH升高，IL-1、IL-6、TNF-α濃度降低(Plt;0.05)；卵泡總數(shù)增加。結(jié)論橄欖苦甙可通過抑制輻射誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，減輕卵巢的輻射性損傷。

橄欖苦甙；電離輻射；卵巢儲(chǔ)備功能；炎癥因子

橄欖苦甙(oleuropein)是一種天然裂環(huán)烯醚萜苷類多酚化合物，為橄欖葉中的主要有效活性成分，具有多種藥理活性，如降壓[1]、抗氧化[2-3]、抗腫瘤[4-5]等。卵巢是女性生殖內(nèi)分泌功能的主要器官，產(chǎn)生卵子并分泌激素。對年輕女性患者而言，放療引起的卵巢功能損傷嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量。年輕宮頸癌患者術(shù)中保留卵巢，后期接受放療的過程中，卵巢功能受到損傷,血清促性腺激素水平增高，血清雌激素、孕激素水平下降，出現(xiàn)圍絕經(jīng)期癥狀[6]。因此，如何減輕放射性卵巢損傷也成為研究的熱點(diǎn)。本研究通過建立合適的輻射模型，首次探討橄欖苦甙對卵巢輻射損傷的防治效果及潛在作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1．1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雌性SD大鼠40只，6～7周齡，體重 (190±20)g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[SCXK(滬)2012-0002]，動(dòng)物合格證編號(hào):2015000521327,飼養(yǎng)于南京軍區(qū)福州總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科屏蔽環(huán)境[SYXK(閩)2013-0004],單籠飼養(yǎng)全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng)，環(huán)境溫度(22±1)℃，光照12 h，自由攝食和飲水。適應(yīng)3 d后，連續(xù)10 d每日晨8：00取陰道分泌物涂片，光鏡下觀察性周期，選用規(guī)律動(dòng)情周期且周期為4～5 d的大鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.1.2主要試劑 橄欖苦甙(購于西安普萊特生物工程有限公司，橄欖苦苷90%HPLC)，10%水合氯醛(購于南京軍區(qū)福州總醫(yī)院藥學(xué)科制劑室，水合氯醛溶液，100 mL：10 g)，大鼠卵泡刺激素(FSH)、大鼠黃體生成素(LH)、大鼠雌二醇(E2)、大鼠抗苗勒氏管激素(AMH)、大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、大鼠白細(xì)胞介素-6(IL-6)、IL-1測定所用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒均購自上海西唐生物公司。

1.1.3主要儀器 DENLEY DRAGON Wellscan MK 3酶標(biāo)儀(THERMO)；Wellwash 4 MK2洗板機(jī)(THERMO)；TGL-168離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；XW-80A漩渦混合器(上海青浦滬西儀器廠)；Olympus(BX41)光學(xué)顯微鏡(OLMPUS)。

1．2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組及給藥 橄欖苦甙溶解于蒸餾水形成1 g/100 mL混懸液，經(jīng)口灌胃給藥，入選的32只大鼠，按隨機(jī)數(shù)表法分4組，每組8只。①正常對照組；② 橄欖苦甙組；③輻射組；④輻射+橄欖苦甙組。各組大鼠連續(xù)灌喂12周，正常對照組和輻射組予蒸餾水10 mL/(kg·d)；輻射組和輻射+橄欖苦甙組予橄欖苦甙100 mg/kg·d[相當(dāng)于橄欖苦甙混懸液10 mL/(kg·d)]。

1.2.2輻射條件 大鼠于動(dòng)情期時(shí)進(jìn)行照射。將每只大鼠予10%水合氯醛按0.3 mL/100 g體重進(jìn)行腹腔麻醉后，固定于自制模具中，采用瓦里安(Varian)直線加速器6 MVX射線進(jìn)行盆腔一次性照射，照射劑量5 Gy，吸收劑量率100 cGy/min，照射野5×5 cm2，源皮距100 cm。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1一般情況 測量大鼠體重，觀察毛發(fā)及活動(dòng)情況。比較大鼠照射前后及用藥與否，體重的變化。

1.3.2大鼠卵巢濕重及器官系數(shù)分析 大鼠麻醉后稱重，開腹分離卵巢組織，剔除周圍組織，并用冰生理鹽水沖凈卵巢表面血污，濾紙吸干后稱重。器官系數(shù)=(器官重量/體重)×100%。

1.3.3各組大鼠血清AMH、 IL-1、IL-6和TNF-α含量的檢測 各組分別于照射后7 d(正常對照組和橄欖苦甙組也在同一天取材)，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹部乙醇常規(guī)消毒，打開胸腔、腹腔，左心室采血3～5 mL，以3000 r/min離心10 min，離心半徑13.5 cm,取上清液，-80 ℃保存，均采用ELISA法檢測，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。采用450 nm吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定所測指標(biāo)的濃度。

1.3.4動(dòng)情周期觀察 照射后連續(xù)7 d，每日晨8：00取陰道脫落細(xì)胞涂片，光鏡下觀察進(jìn)行動(dòng)情周期判斷[7]并記錄。

1.3.5卵巢HE染色 分離右側(cè)卵巢，用10%中性甲醛固定，依次行脫水，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，隔20片取1片，隨機(jī)選取3片，常規(guī)HE染色，光鏡下計(jì)數(shù)整張切片各級(jí)卵泡數(shù)[8]。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 各組大鼠經(jīng)過12周灌喂, 體重穩(wěn)定增長，活動(dòng)自如，毛發(fā)有光澤, 攝食飲水及排便正常，照射前對比各組未見明顯差異。照射后7 d，對比照射前后及組間各組大鼠體重、攝食及飲水無明顯變化。

2.2大鼠卵巢濕重及器官系數(shù)分析 照射后7 d，對比各組大鼠卵巢系數(shù)及臟器系數(shù)比值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。見圖1。

1：正常對照組；2：橄欖苦甙組；3：輻射組；4：輻射+橄欖苦甙組圖1 各組大鼠卵巢濕重和臟器系數(shù)比較

2.3大鼠血清AMH濃度的測定 接受輻射的大鼠AMH分泌減少，而單純給予橄欖苦甙大鼠AMH的分泌無影響。與正常對照組比較，橄欖苦甙組橄欖苦甙干預(yù)后，AMH差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)；輻射組照射后，AMH值顯著減少(Plt;0.05)；輻射+橄欖苦甙組接受橄欖苦甙干預(yù)后進(jìn)行輻射，其AMH值較正常對照組下降但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)，明顯高于輻射組(Plt;0.05)。見圖2。

1：正常對照組；2：橄欖苦甙組；3：輻射組；4：輻射+橄欖苦甙組與輻射組比較，*Plt;0.05圖2 各組大鼠血清AMH濃度比較

2.4大鼠血清IL-1、IL-6和TNF-α的測定 橄欖苦甙組IL-1、IL-6和TNF-α的濃度較正常對照組略有下降，其中TNF-α下降顯著(Plt;0.05)。輻射組IL-1、IL-6和TNF-α的濃度均顯著高于正常對照組和輻射+橄欖苦甙組(Plt;0.05)。輻射+橄欖苦甙組大鼠IL-1、IL-6和TNF-α的濃度與正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。見表1。

組別nIL?1IL?6TNF?α正常對照組816 96±10 33244 57±46 1230 77±11 76 橄欖苦甙組816 36±10 02227 71±61 3721 75±6 64? 輻射組828 14±10 26?376 07±70 28?45 23±17 88? 輻射+橄欖苦甙組816 67±6 44#277 05±66 40#38 22±46 42# 與正常對照組比較，?Plt;0 05；與輻射組比較，#Plt;0 05

2.5大鼠動(dòng)情周期變化 連續(xù)7 d陰道涂片，觀察到正常對照組和橄欖苦甙組大鼠均可觀察到下一次動(dòng)情期改變；輻射組3/8大鼠出現(xiàn)動(dòng)情周期延長，未見下一動(dòng)情期；輻射+橄欖苦甙組大鼠均可出現(xiàn)下一動(dòng)情期。

2.6大鼠卵巢組織光鏡下改變及卵泡數(shù)變化 正常對照組卵巢結(jié)構(gòu)清晰，卵巢中可見原始卵泡，各級(jí)發(fā)育中卵泡及成熟卵泡；輻射組卵巢結(jié)構(gòu)混亂，皮質(zhì)中原始卵泡和初級(jí)卵泡數(shù)量銳減，可見大量閉鎖卵泡及多個(gè)大的陳舊樣黃體組織；橄欖苦甙組卵巢結(jié)構(gòu)清晰，各級(jí)卵泡數(shù)未見明顯變化；輻射+橄欖苦甙組卵巢結(jié)構(gòu)相對清晰，原始卵泡明顯減少，可見少量閉鎖卵泡及黃體樣組織。見圖3。

橄欖苦甙組大鼠卵泡總數(shù)及各級(jí)生長卵泡數(shù)較正常對照組正常大鼠差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。輻射組大鼠卵泡總數(shù)較正常對照組顯著減少(Plt;0.05)，各級(jí)卵泡中，原始卵泡、初級(jí)卵泡數(shù)減少明顯 (Plt;0.05)。輻射+橄欖苦甙組大鼠，各組卵泡數(shù)較正常對照組減少，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)；輻射+橄欖苦甙組較輻射組卵泡總數(shù)多，以原始卵泡，初級(jí)卵泡數(shù)保留多(Plt;0.05)。見表2。

圖3 各組大鼠卵巢組織HE染色(×40)

組別原始卵泡初級(jí)卵泡次級(jí)卵泡竇狀卵泡總卵泡數(shù)正常對照組16 13±7 26?14 88±4 42?13 75±9 903 13±2 9547 88±17 08? 橄欖苦甙組14 38±6 2812 63±6 639 50±4 720 50±0 9337 00±9 24 輻射組3 13±3 947 00±3 708 00±3 301 13±1 4619 25±6 18 橄欖苦甙+輻射組13 38±7 19?14 63±7 05?10 25±5 681 00±1 5139 25±7 50? 與輻射組比較，?Plt;0 05

3 討 論

3.1卵巢儲(chǔ)備功能評(píng)估方式 卵巢儲(chǔ)備功能指的是卵巢內(nèi)存留原始卵泡的數(shù)量和質(zhì)量，反映了女性的生育潛能。近年來常用AMH評(píng)估卵巢儲(chǔ)備功能[9]。研究認(rèn)為，AMH能更好地用于預(yù)測絕經(jīng)年齡，其與年齡相關(guān)的卵巢儲(chǔ)備功能下降相關(guān)性最強(qiáng)。初級(jí)卵泡，次級(jí)卵泡及直徑2～8 mm的早期竇卵泡中高表達(dá)AMH[10-11]。目前認(rèn)為，AMH分泌在月經(jīng)周期過程中相對穩(wěn)定[12]。卵泡數(shù)目出生時(shí)已固定，不能再生，且僅0.1%的卵泡可發(fā)育成熟并排卵，絕大部分的卵泡閉鎖消失。這也導(dǎo)致了卵巢功能易受損。始基卵泡作為卵巢功能的基本生殖單位。卵泡的耗竭及卵泡對垂體促性腺激素的無反應(yīng)性可導(dǎo)致卵巢功能衰竭。由于原始卵泡并不分泌AMH,部分學(xué)者認(rèn)為，AMH只能反映生長卵泡的數(shù)量，而無法反映處于休眠期的原始卵泡的數(shù)量[13]。卵巢組織中，各級(jí)卵泡的數(shù)量是反應(yīng)卵巢儲(chǔ)備功能的最直接的證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)取大鼠卵巢制作組織切片，計(jì)數(shù)各級(jí)卵泡數(shù)，作為評(píng)估卵巢儲(chǔ)備功能的手段之一。

3.2建立適宜輻射模型 現(xiàn)有卵巢輻射損傷模型各有不同。Pesty等[14]用不同劑量的射線(0.5、1、3、6 Gy)一次全身照射6周齡小鼠，各個(gè)劑量組均可發(fā)現(xiàn)原始卵泡和初級(jí)卵泡顯著減少。Said等[3]用3.2 Gy的γ射線一次全身照射23 d齡未成熟SD大鼠，各級(jí)生長卵泡減少，閉鎖卵泡增加。6～8周齡的Balb/c小鼠接受7.2 Gy的γ射線全身照射后，卵母細(xì)胞發(fā)育延遲，大多數(shù)處于減數(shù)分裂Ⅰ期，卵母細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)異常增加，且小鼠排卵率降低[15]。體外研究中，學(xué)者分離卵巢置于適宜的培養(yǎng)基培養(yǎng)，用0.2 Gy的射線照射，可觀察到直徑gt;500 μm的卵泡數(shù)較未照射組顯著減少，且平均直徑小；除此外卵母細(xì)胞裂解增多[16]。本實(shí)驗(yàn)中，接受盆腔5 Gy照射后，輻射組血清AMH明顯降低(Plt;0.05)；3/8大鼠動(dòng)情周期延長；卵巢組織見總卵泡數(shù)減少，原始卵泡和初級(jí)卵泡為主，大量閉鎖卵泡。成功建立卵巢輻射損傷模型。既往研究大多采用全身照射，輻射面積大，輻射損傷重，本實(shí)驗(yàn)采用盆腔照射，減少全身照射引起相鄰器官及相關(guān)組織的影響，使輻射損傷更集中作用于卵巢，并采用多種直接和間接方法對卵巢儲(chǔ)備功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。

3.3橄欖苦甙對抗炎癥反應(yīng)以減輕輻射性卵巢損傷 卵巢輻射損傷機(jī)制主要有氧化應(yīng)激[3]和DNA損傷[16]。其他輻射模型證實(shí)電離輻射誘導(dǎo)血清IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α等炎癥因子發(fā)生變化，炎癥反應(yīng)參與放射性損傷[17-19]。 Das等[20]發(fā)現(xiàn)照射后小鼠體內(nèi)除氧化應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)激活NF-kB通路，增加COX-2表達(dá)，提高炎癥因子IL-6、TNF-α血清濃度，證實(shí)氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)均參與輻射損傷。橄欖苦甙可降低IL-1和IL-6的釋放對抗炎癥反應(yīng)[21]。因此，我們猜想橄欖苦甙可通過調(diào)節(jié)IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子的釋放，減輕卵巢輻射性損傷。IL-1、IL-6、TNF-α是介導(dǎo)急性期炎癥反應(yīng)最重要的細(xì)胞因子。IL-1、TNF-α主要由激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可引起發(fā)熱、食欲不振、嗜睡等癥狀。TNF-α還是炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)因子，可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，增加血管通透性，刺激內(nèi)皮細(xì)胞生成IL-1、內(nèi)皮素等炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致組織損傷；刺激單核巨噬細(xì)胞等合成分泌IL-1、6、8、TNF-α等形成“瀑布效應(yīng)”加重組織損傷。本實(shí)驗(yàn)中，輻射組較對照組炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α的釋放顯著增加，而橄欖苦甙的干預(yù)有效降低輻射+橄欖苦甙組血清IL-1、IL-6、TNF-α濃度，減輕輻射誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。對比輻射組，輻射+橄欖苦甙組血清AMH濃度明顯升高；陰道涂片未見動(dòng)情周期異常；卵巢病理切片示，保留更多生長卵泡數(shù)，以原始卵泡和初級(jí)卵泡差異顯著，可能為原始卵泡對輻射更為敏感[22]。因此，橄欖苦甙可在一定程度上減輕卵巢輻射損傷。結(jié)合炎癥因子的改變及卵巢儲(chǔ)備功能情況，我們有理由認(rèn)為，橄欖苦甙通過抑制輻射誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，減輕卵巢儲(chǔ)備功能的損傷。

綜上所述，橄欖苦甙可通過抑制炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α的合成和釋放，減輕輻射誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),改善卵巢儲(chǔ)備功能。

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2017-04-30;

2017-10-20)

(本文編輯：葉華珍; 英文編輯：王建東)

Experimentalstudyoftheeffectsofoleuropeinonirradiation-inducedovarianinjury

CHEN Gui-lian1, HUANG Hui-juan1, TIAN Li-ming2

(1.DepartmentofObestetricsandGynecology,ClinicalMedicalSchool,FuzhouGeneralHospitalofFujianMedicalUniversity/FuzhouGeneralHospitalofChinesePLA,Fuzhou350025,Fujian,China; 2.DepartmentofObstetricsandGynecology,EastHospitalAffiliatedtoXiamenUniversity,Fuzhou350025,Fujian,China)

ObjectiveTo study the effects of oleuropein on irradiation-induced ovarian injury.Methods32 femal SD rats were randomly assigned to 4 groups of 8 rats each: control group, oleuropein group, irradiation group and irradiation + oleuropein group. Rats in control group and irradiation group

distilled water 10 mL/(kg·d) intragastrically. Rats in oleuropein group and irradiation + oleuropein group received oleuropein 100 mg/(kg·d) intragastrically. 12 weeks later, rats in group irradiation group and irradiation + oleuropein group were exposed to pelvic irradiation at a dose of 5 Gy when they were in the estrus. After 7 days for radiation, the concentration of AMH, IL-1, IL-6 and TNF-α were detected and the number of growing follicles in ovarian tissue were counted.ResultsCompared with the control group, the serum AMH concentration in the radiation group was significantly decreased (Plt;0.05), and IL-1, IL-6 and TNF-α were increased (Plt;0.05) and the number of follicles in the ovaries was reduced. Compared with the radiation group, the serum AMH concentration were increased in the radiation + peridol group, and IL-1, IL-6 and TNF-α decreased (Plt;0.05). The total number of follicle was increased.ConclusionIt was concluded that oleuropein could inhibit the radiation-induced inflammatory response to reduce the radiation damage of the ovaries.

Oleuropein; Irradiation; Ovarian reserve; Cytokines

R711.4

A

1672-271X(2017)06-0576-05

10.3969/j.issn.1672-271X.2017.06.005

福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014Y5008);全軍醫(yī)藥衛(wèi)生科研項(xiàng)目(14MS129)

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陳桂蓮，黃惠娟，田黎明.橄欖苦甙對卵巢輻射損傷的防治效果[J].東南國防醫(yī)藥，2017,19(6):576-580.