徐瑞彤，孫康俊，戴冠群，徐 靜

抗雌激素治療對耐酪氨酸激酶抑制劑非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株抗增殖作用的機(jī)制探討

徐瑞彤1，孫康俊2，戴冠群1，徐 靜3

目的探討氟維司群逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株耐藥性的可能性及其機(jī)制。方法分別用不同濃度的氟維司群和吉非替尼，單藥以及聯(lián)合對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H1975[含表皮生長因子受體(EGFR) L858R amp; T790m突變]、H1650(含EGFR Del E746-A750 amp; PTEN De突變)、PC-9(含EGFR Del E746-A750突變)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后，采用MTT法檢測細(xì)胞增殖變化，Western blot法檢測EGFR、雌激素受體(ER)、磷酸化表皮生長因子受體(p-EGFR)的蛋白表達(dá)。結(jié)果①H1975、H1650、PC-9肺癌細(xì)胞中均有EGFR及ER表達(dá)；②吉非替尼及氟維司群聯(lián)合用藥較單藥可明顯抑制H1975、H1650、PC-9肺癌細(xì)胞的增殖(Plt;0.001)；③H1975耐藥細(xì)胞株內(nèi)T790m突變型EGFR的磷酸化水平可以快速地被雌激素升高或被氟維司群抑制；④ 在酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)獲得性耐藥的肺癌細(xì)胞株中雌激素、表皮生長因子(EGF)分別下調(diào)EGFR、ER的水平，氟維司群、吉非替尼分別上調(diào)EGFR、ER的水平。結(jié)論采用EGFR的靶向治療與抗雌激素治療相結(jié)合的治療方案提高EGFR和ER陽性的EGFR-TKI獲得性耐藥的NSCLC的治療效果在理論上是可行的。

氟維司群；吉非替尼；非小細(xì)胞肺癌；表皮生長因子受體；耐藥

隨著全球社會經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，環(huán)境污染愈加嚴(yán)重，加上人口老齡化、不健康的生活方式等等，使得惡性腫瘤的發(fā)病率連年增長[1]。根據(jù)最新的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，肺癌是影響我國居民健康的排名第一的惡性腫瘤,發(fā)病和死亡呈現(xiàn)逐年上升趨勢[2]。目前對于肺癌的治療有很多新的進(jìn)展,其中針對肺癌發(fā)生發(fā)展的信號通路中各個靶點的分子靶向藥物進(jìn)一步提高了腫瘤的緩解率，降低了復(fù)發(fā)率，帶來了可喜的療效。而表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是現(xiàn)階段研究最多的治療靶點。EGFR是erbB/HER家族的成員之一，多在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)腫瘤組織中過表達(dá)(40%～80%)，并與預(yù)后不良相關(guān)[3]。EGFR信號通路激活后可啟動下游多個與腫瘤細(xì)胞相關(guān)的信號級聯(lián)反應(yīng)，包括抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖、增強(qiáng)細(xì)胞侵襲性以及誘導(dǎo)血管生成等[4]。

吉非替尼和厄洛替尼作為酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)的代表藥物，結(jié)構(gòu)類似ATP，可與EGFR-TK催化區(qū)域位點競爭性結(jié)合，從而阻斷胞內(nèi)外的信號傳遞，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，目前已在全球范圍內(nèi)用于治療晚期NSCLC[5]。前瞻性和回顧性研究結(jié)果顯示，EGFR-TKI臨床受益的預(yù)測因素包括女性、無吸煙史、腺癌、亞裔、治療相關(guān)皮疹的嚴(yán)重程度、存在EGFR突變等[6-9]。約90%的NSCLC組織中存在基因突變，多表現(xiàn)為EGFR外顯子19的缺失以及外顯子21的替代突變，這兩種突變都可以增加NSCLC對EGFR-EKI的敏感性[6,10-11]。雖然在這類患者中，使用吉非替尼或厄洛替尼后疾病可獲得緩解，但是部分患者經(jīng)過一段時間后，疾病可能會出現(xiàn)再次進(jìn)展，中位時間為3～8個月，稱為獲得性耐藥現(xiàn)象[12-14]。目前已知最常見的獲得性耐藥的分子機(jī)制為EGFR T790m二次突變[15]以及MET原癌基因擴(kuò)增[16]。T790位于EGFR與ATP結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域，也稱為“gatekeeper”殘基。從臨床獲得的耐藥患者的組織標(biāo)本以及耐藥的NSCLC細(xì)胞株的分子研究顯示，T790m突變就是除一次活化性突變外，T790位點上出現(xiàn)以大量甲硫氨酸殘基替代蘇氨酸的二次替代突變，這種替代突變不影響EGFR的催化活性，因此有研究猜想大量的甲硫氨酸殘基對EGFR-TKI的結(jié)合形成了位阻，影響其與EFFR激酶區(qū)的結(jié)合，從而產(chǎn)生獲得性耐藥[17]。

Stabile等[18]曾報道聯(lián)合吉非替尼及抗雌激素藥物氟維司群同時作用于NSCLC細(xì)胞的EGFR及雌激素受體(estrogen receptor ER)2個靶點，可較單藥明顯增強(qiáng)其抗腫瘤細(xì)胞增殖的作用；并證明吉非替尼可持續(xù)上調(diào)肺癌細(xì)胞內(nèi)ER的表達(dá)。這提示我們在體內(nèi)可能存在EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和雌激素信號通路的交叉，共同影響吉非替尼的活性和療效。考慮EGFR-TKI使用的優(yōu)勢人群包括女性、腺癌[6-9]，并且用藥治療一段時間后經(jīng)常會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象[12-13,19]，我們推測這可能也是由于吉非替尼持續(xù)上調(diào)了腫瘤細(xì)胞內(nèi)ER的表達(dá)水平，通過ER介導(dǎo)的其他途徑補(bǔ)償了被抑制的EGFR介導(dǎo)的信號通路，從而表現(xiàn)出耐藥。本實驗在細(xì)胞水平上比較了吉非替尼和氟維司群聯(lián)合與單一用藥對EGFR-TKI獲得性耐藥的NSCLC細(xì)胞生長的影響，并初步探討了與之相關(guān)的ER/EGFR信號通路相互作用的分子機(jī)制，希望為EGFR-TKI獲得性耐藥的NSCLC的分子靶向治療提供新的途徑及理論支持。

1 材料與方法

1.1材料 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H1975(含EGFR L858R amp; T790m突變)采購自ATCC(United States)，H1650(含EGFR Del E746-A750 amp; PTEN De突變)由本實驗室保存，PC-9(含EGFR Del E746-A750突變)由上海肺科醫(yī)院周彩存教授贈送。藥品吉非替尼購自Tocris公司(United Kingdom)，氟維司群及17β-雌二醇購自Cayman Chemical 公司(United States)。2種藥品粉劑溶于DMSO(GIBCO公司)，加入RPMI1640培養(yǎng)基稀釋成所需濃度用于實驗。重組人表皮生長因子(EGF)購自Pep Rotech公司 (United States)，溶于無菌去離子水，加入RPMI1640培養(yǎng)基稀釋成所需濃度用于實驗。RPMI1640、胎牛血清(Hyclone公司)，anti-EGFR單克隆抗體(Monoclonal Antibody，MAb),anti-ERαMAb、phospho-EGFR Y1068 MAb(Cell Signaling Technology)，anti-ERβ多克隆抗體(Polyclonal Antibody，PAb)(PanVera)，其余實驗試劑為國產(chǎn)分析純試劑。HERA cell 細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國Heraers公司)，低溫高速離心機(jī)(德國Heraers公司)，酶標(biāo)儀(美國Clinibio公司)，Gel Doc 1000凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)，紫外分光光度計(NanoDrop公司)，PCR儀(Applied Biosystems公司)。

1.2 方法

1.2.1MTT法檢測吉非替尼、氟維司群單藥及聯(lián)合用藥作用后肺癌細(xì)胞的存活率 采用MTT法觀察氟維司群和吉非替尼單藥和聯(lián)合用藥對肺癌細(xì)胞增殖的影響。實驗時，取對數(shù)生長期細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，以4×104/mL的濃度，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔200 μL(邊緣孔用無菌PBS填充)，在37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h貼壁后，加入濃度梯度的吉非替尼、氟維司群、吉非替尼+氟維司群,每組濃度設(shè)5個復(fù)孔，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h(濃度梯度的確定方法為：結(jié)合文獻(xiàn)，先采用10個濃度梯度，根據(jù)所得結(jié)果，采用細(xì)胞存活率分布于20%～80%之間的藥物濃度，再定5個濃度梯度)。實驗結(jié)束后每個孔內(nèi)加入20 μL的MTT(5 mg/mL)，37 ℃培養(yǎng)4 h后，終止培養(yǎng)，棄上清，每孔加入150 μL的DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使藍(lán)色結(jié)晶充分溶解。用自動酶標(biāo)儀測定490 nm波長處每孔的吸光度A，計算各實驗組腫瘤細(xì)胞的存活率。細(xì)胞存活率(%) = [(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%。其中As：試驗孔(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、MTT、吉非替尼/氟維司群)，Ac：對照孔(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、MTT)，Ab：空白孔(不含細(xì)胞的培養(yǎng)基、MTT)。運用SPSS10.0軟件根據(jù)藥物濃度與細(xì)胞存活率求出不同時間的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.2Western blot檢測ER、EGFR在肺癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況以及吉非替尼、氟維司群對EGFR信號通路的調(diào)控 取實驗用細(xì)胞，以冰PBS洗滌3遍，加入RIPA細(xì)胞裂解液，鏡下觀察細(xì)胞充分裂解后，收集細(xì)胞總蛋白。經(jīng)過SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將膜置入5%脫脂牛奶中封閉，4 ℃過夜。次日，將膜置于37 ℃復(fù)溫 30 min后，加入一抗(一抗以5%脫脂牛奶TBST液稀釋，一抗稀釋濃度1∶1000，β-actin為1∶500)，與膜反應(yīng)，37 ℃ 2 h，TBST漂洗3遍后，加入二抗(二抗以5%脫脂牛奶TBST液稀釋，均為1∶3000)，37 ℃ 30 min?；瘜W(xué)發(fā)光顯影成像。所有實驗均重復(fù)3次。EGFR介導(dǎo)的信號通路的開啟是需要通過EGFR的快速活化來實現(xiàn)的，其重要標(biāo)志是EGFR磷酸化急劇上升。

a:吉非替尼；b：氟維司群圖2 MTT法檢測不同濃度的吉非替尼或氟維司群對H1975、H1650及PC-9的抗增殖效應(yīng)

2 結(jié) 果

2.1H1975、H1650及PC-9肺癌細(xì)胞中ER和EGFR的表達(dá)情況 WB結(jié)果顯示EGFR和ER在3株肺癌細(xì)胞株中均有表達(dá)，EGFR的表達(dá)量PC-9細(xì)胞要明顯高于H1975細(xì)胞，在H1650細(xì)胞中僅微弱表達(dá)。ERα在H1650細(xì)胞及PC-9細(xì)胞中表達(dá)量近似，均略高于H1975，而ERβH1650細(xì)胞及H1975中表達(dá)量相近，在PC-9細(xì)胞中表達(dá)量較少。見圖1。

圖1 EGFR、ERα、ERβ在H1975、H1650及PC-9肺癌細(xì)胞株的基礎(chǔ)表達(dá)量

2.2吉非替尼和氟維司群單藥對H1975、H1650及PC-9細(xì)胞增殖的影響 不同濃度吉非替尼/氟維司群作用下，H1975、H1650及PC-9細(xì)胞的細(xì)胞存活率見圖2。隨著藥物濃度增加，細(xì)胞存活率減少。實驗中所用H1975、H1650及PC-9肺癌細(xì)胞株的EGFR均含有不同位點的突變，在單藥實驗中也體現(xiàn)出了這些突變對吉非替尼敏感性的影響：H1975及H1650因分別含有二次突變T790m及PTEN Del表現(xiàn)出耐藥(IC50gt;10 μmol/L)，PC-9細(xì)胞株僅含有位于exon19的一次突變而表現(xiàn)出對藥物的敏感(IC50≈0.03 μmol/L)。

2.3吉非替尼和氟維司群聯(lián)合用藥對比單藥對H1975、H1650及PC-9細(xì)胞抗增殖的影響 采用MTT比色法檢測的結(jié)果顯示，1 μmol/L的吉非替尼和3 μmol/L的氟維司群聯(lián)合或單藥處理細(xì)胞48 h后，PC-9細(xì)胞的增殖率明顯低于單獨使用吉非替尼或氟維司群的實驗組(Plt;0.001)，處理H1650細(xì)胞得到的結(jié)果一致(Plt;0.001)，而這種差異在含有EGFR T790m突變的H1975細(xì)胞株中體現(xiàn)得更加突出(Plt;0.0001)。見圖3。

圖3 MTT法檢測吉非替尼與氟維司群聯(lián)合與單一用藥對H1975、H1650及PC-9細(xì)胞的抗增殖作用的比較

2.4雌激素及其拮抗劑對T790m突變型EGFR信號通路的調(diào)控 以10 nmol/L 17β-雌二醇處理H1975細(xì)胞10 min發(fā)現(xiàn)EGFR磷酸化水平明顯增高，以1 μmol/L的吉非替尼和3 μmol/L的氟維司群分別處理H1975細(xì)胞10 min可以下調(diào)EGFR的磷酸化水平，當(dāng)疊加這2種處理時這種變化更加顯著。表明EGFR及雌激素信號通路間存在交叉現(xiàn)象。見圖4。

圖4 吉非替尼與氟維司群聯(lián)合與單一用藥以及雌激素對H1975細(xì)胞株中EGFR磷酸化水平的影響

2.5在EGFR-TKI獲得性耐藥的肺癌細(xì)胞株中雌激素、EGF分別下調(diào)EGFR、ER的水平，氟維司群、吉非替尼分別上調(diào)EGFR、ER的水平 以10 nmol/L 17β-E2的處理H1975細(xì)胞7 d發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)EGFR的蛋白量與對照組相比均明顯減少，加入3 μmol/L氟維司群處理的細(xì)胞EGFR則呈現(xiàn)相反的表達(dá)趨勢。表明雌激素除了可以激活EGFR信號通路，也能抑制EGFR的表達(dá)。H1975細(xì)胞分別給予10 ng/mL表皮生長因子(EGF)，1 μmol/L 吉非替尼培養(yǎng)7 d，檢測發(fā)現(xiàn)與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，EGF下調(diào)ERs的表達(dá)，而吉非替尼則上調(diào)ER的表達(dá)。見圖5。

圖5 吉非替尼、氟維司群、雌激素、表皮生長因子長時間作用后(7 d)對H1975細(xì)胞EGFR及ER表達(dá)量的影響

3 討 論

近年來有越來越多的證據(jù)表明，類固醇激素(包括雌激素)在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用[20-21]。雌激素可以刺激NSCLC細(xì)胞的增殖，并且可以促使細(xì)胞中的EGFR發(fā)生快速磷酸化，從而激活其下游信號通路[22]。此外，一些研究也表明雌激素受體(estrogen receptor, ERαamp;β)，尤其是ERβ在肺腫瘤的發(fā)生和存活中扮演著重要的角色[23-24]。無論從男性還是女性患者肺癌組織中分離所得的肺癌細(xì)胞株均可檢測出ERs，并受到雌激素的調(diào)控[25]。ER一方面可通過形成雌激素-受體復(fù)合物，與細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)的特定部位結(jié)合，刺激mRNA轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生多種影響細(xì)胞生長及代謝的蛋白質(zhì)[22]；另一方面，通過蛋白與蛋白間的作用與其他轉(zhuǎn)錄因子信號通路產(chǎn)生交叉，對細(xì)胞的增殖和分化產(chǎn)生重要調(diào)控。比如生長因子EGF可以替代雌激素，通過ERK通路激活ER的促轉(zhuǎn)錄活性[26]；另外，最近有研究也表明存在非核的ER可以激活PI3K和EGFR家族受體[27]。這些研究揭示在ER和EGFR共表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中，ER和EGFR均可能通過這些相互交叉的信號通路促進(jìn)細(xì)胞增殖，同時增強(qiáng)雌激素和表皮生長因子的生物學(xué)效應(yīng)。因此有科學(xué)家猜想結(jié)合EGFR-TKI與抗雌激素同時靶向兩個信號通路對于治療肺癌可能是可行的方案，2013年Garon等[20]就曾在一個Ⅱ期臨床試驗中應(yīng)用厄洛替尼聯(lián)合氟維司群治療晚期NSCLC患者，并獲得了一定的療效。

考慮到雌激素及ER在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，以及EGFR-TKI的使用優(yōu)勢人群和獲得性耐藥現(xiàn)象，我們推測EGFR-EKI可能持續(xù)上調(diào)了腫瘤細(xì)胞內(nèi)ER的表達(dá)，通過ER介導(dǎo)的其他途徑補(bǔ)償了被抑制的EGFR介導(dǎo)的信號通路，從而表現(xiàn)出耐藥。因此，我們猜想聯(lián)合EGFR-TKI和抗雌激素治療能有利于阻斷EGFR-TKI耐藥肺癌細(xì)胞株中交叉的生長途徑間的信號傳導(dǎo)，有助于推遲吉非替尼耐藥性的出現(xiàn)。為此，我們選取了3株NSCLC細(xì)胞株：H1975(T790m 耐藥)、H1650(PTEN 耐藥)和PC-9(Del E746-A750 敏感)，聯(lián)合或單獨使用EGFR-TKI吉非替尼與雌激素受體拮抗劑氟維司群分別處理3株細(xì)胞，在細(xì)胞水平上比較兩藥聯(lián)合對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制效果，希望為兩藥聯(lián)合治療對EGFR-TKI獲得性耐藥的NSCLC提供一些理論上的依據(jù)。我們首先從分子學(xué)水平檢測了3株NSCLC細(xì)胞株中EGFR及ER的表達(dá)，Western Blot顯示H1975、H1650和PC-9細(xì)胞中均有EGFR和ER表達(dá)，但兩種蛋白在不同細(xì)胞株中的表達(dá)量有所差異。隨后的細(xì)胞增殖的檢測結(jié)果證明，兩藥聯(lián)合與單獨一種藥物處理比，3株細(xì)胞的增殖率明顯降低。以上這些實驗結(jié)果從細(xì)胞水平上表明：吉非替尼聯(lián)合氟維司群可放大對ER陽性T790m突變型EGFR的NSCLC的抗增殖效應(yīng)。

為了從分子水平上研究ER與T790m突變型EGFR信號通路的交叉關(guān)聯(lián)，我們用表皮生長因子(EGF)和雌激素分別處理H1975細(xì)胞，觀察到處理后的H1975細(xì)胞中ER和EGFR的表達(dá)量下調(diào)，以吉非替尼和氟維司群分別處理后，上述受體的表達(dá)量則明顯上調(diào)，這提示我們耐藥細(xì)胞株內(nèi)ER和T790m突變型EGFR交叉的信號通路存在不同的時間效應(yīng)：一方面，雌激素可通過與ER結(jié)合快速激活T790m突變型EGFR下游的信號通路；另一方面，兩者在較長時間相互作用后，可通過互逆的表達(dá)調(diào)控相互影響。這揭示了吉非替尼聯(lián)合氟維司群逆轉(zhuǎn)EGFR-TKI耐藥肺癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制：氟維司群阻斷吉非替尼上調(diào)ER表達(dá)量進(jìn)而導(dǎo)致的ER信號通路的增強(qiáng)，抑制ER介導(dǎo)的EGFR信號通路的激活。這樣一種兩個通路之間相互調(diào)控的機(jī)制為嘗試聯(lián)合兩種藥物進(jìn)行治療提供了有力的理論依據(jù)。

總之，我們的研究初步證明了針對ER和EGFR的信號交叉，采用EGFR的靶向治療與抗雌激素治療相結(jié)合的治療方案提高EGFR和ER陽性的EGFR-TKI獲得性耐藥的NSCLC的治療效果在理論上是可行的。

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2017-05-15;

2017-07-14)

(本文編輯：葉華珍; 英文編輯：王建東)

Theantitumoreffectofanti-estrogentherapyonnon-smallcelllungcancercelllineswithacquiredresistancetoEGFR-TKI

XU Rui-tong1,SUN Kang-jun2,DAI Guan-qun1,XU Jing3

(1.DepartmentofGeneralPractice，JiangsuProvinceHospital，Nanjing210029，Jiangsu，China;2.SchoolofPublicHealth，NanjingMedicalUniversity，Nanjing211166,Jiangsu，China;3.DepartmentofOncology，JiangsuProvinceHospital，Nanjing210029,Jiangsu，China)

ObjectiveTo investigate the antitumor effects of combination of gefitinib and fulvestrant on NSCLC cell lines with acquired resistance to gefitinib.MethodsThe antitumor effect of gefitinib and fulvestrant on the growth of NSCLC cell lines was observed at different concentrations by MTT assay. The expression levels of EGFR, ER and p-EGFR were determined by Western blot.Results① All three lung cancer cell lines expressed both EGFR and ERs although to different extents. ② Compared with treatment of either fulvestrant or gefitinib alone, drug combination obviously decreased proliferation of H1976,H1650 and PC-9 cells lines (Plt;0.001). ③ Rapid activations of EGFR pathway by estrogen were observed in H1975 cells with T790M mutation. ④ EGFR and ERs expression were down-regulated respectively in response to estrogen and EGF but up-regulated in response to fulvestrant and gefitinib in vitro.ConclusionThese results suggest that there is a functional crosssignaling between the EGFR/ER pathways in NSCLC with acquired resistance to gefitinib, possibly providing rationale for combining gefitinib with anti-estrogen therapy for advanced NSCLC treatment.

Gefitinib；Fulvestrant；Non-small cell lung cancer；Epidermal growth factor receptor；Acquired resistance

R365；R735.37

A

1672-271X(2017)06-0581-06

10.3969/j.issn.1672-271X.2017.06.006

江蘇省六大人才高峰資助項目(2015-WSW-022)

1. 210029南京，江蘇省人民醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科；2.211166南京，南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院；3. 210029南京，江蘇省人民醫(yī)院腫瘤科

徐 靜，E-mail：517068680@qq.com

徐瑞彤，孫康俊，戴冠群,等.抗雌激素治療對耐酪氨酸激酶抑制劑非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株抗增殖作用的機(jī)制探討[J].東南國防醫(yī)藥，2017,19(6):581-586.