胡善明，李家俊，孫 浩，趙 瑩，馬金友，張艷紅，余 燕

（河南科技學院動物科技學院，河南新鄉(xiāng)453003）

Ghrelin及其相關(guān)基因 mRNA在海蘭褐蛋雞不同產(chǎn)蛋階段的表達變化

胡善明，李家俊，孫 浩，趙 瑩，馬金友，張艷紅，余 燕*

（河南科技學院動物科技學院，河南新鄉(xiāng)453003）

本文旨在探討海蘭褐蛋雞Ghrelin、Ghrelin受體（GHSR）和Ghrelin?；D(zhuǎn)移酶（GOAT）在產(chǎn)蛋周期不同階段的表達變化規(guī)律，為通過誘導Ghrelin表達促進蛋雞卵泡生長發(fā)育以提高產(chǎn)蛋率及延長產(chǎn)蛋周期提供理論依據(jù)。應用ELISA檢測蛋雞產(chǎn)蛋周期血漿和卵巢Ghrelin含量，實時定量PCR檢測腺胃與卵巢Ghrelin、GHSR和GOAT表達變化。結(jié)果表明：不同產(chǎn)蛋階段外周血Ghrelin的含量和腺胃中Ghrelin、GHSR和GOATmRNA的表達變化不明顯；產(chǎn)蛋高峰期卵巢中GhrelinmRNA表達水平比產(chǎn)蛋前期升高98.2%（P<0.05），而產(chǎn)蛋后期Ghrelin表達水平比產(chǎn)蛋高峰期有所下降（P>0.05）；GHSR和GOAT的表達模式和Ghrelin基本一致，均表現(xiàn)為產(chǎn)蛋高峰期表達量最高，產(chǎn)蛋后期略有下降，產(chǎn)蛋高峰期GHSR和GOATmRNA表達水平顯著高于產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋后期（P<0.05），但產(chǎn)蛋前期和后期差異不顯著（P>0.05）。推測海蘭褐蛋雞卵巢中Ghrelin、GHSR和GOAT的轉(zhuǎn)錄表達水平與產(chǎn)蛋周期具有一定的相關(guān)性。

Ghrelin；Ghrelin受體；Ghrelin?；D(zhuǎn)移酶；產(chǎn)蛋周期；海蘭褐蛋雞

Ghrelin是具有多種生物學功能的多肽，它與生長激素促分泌素的受體（GHSR）結(jié)合，在生長激素分泌、生殖、攝食、能量代謝等方面起作用[1]，Ghrelin?；D(zhuǎn)移酶（GOAT）可調(diào)節(jié)Ghrelin在血液中的水平[2-3]。哺乳動物的研究發(fā)現(xiàn)，Ghrelin及其受體GHS-R1a能夠在卵巢的不同細胞上表達，表明Ghrelin對卵巢生理具有直接的調(diào)控作用[4-5]。

雞Ghrelin是具有26個氨基酸殘基的多肽，主要由雞腺胃分泌，但在雞卵巢組織中也有表達，且通過與GHS-R1a結(jié)合參與雞卵巢組織中一些重要功能的調(diào)節(jié)，培養(yǎng)的卵巢粒細胞添加Ghrelin的量可以降低凋亡相關(guān)蛋白如CASPASE-3和BCL-2的含量，提高增殖細胞核抗原、細胞周期蛋白B1和p53蛋白在卵巢濾泡細胞的表達，促進孕酮、雌二醇和精氨酸催產(chǎn)加壓素釋放[6]。Ghrelin還能夠促進雞等級前卵泡顆粒細胞的增殖，協(xié)同卵泡刺激素（FSH）調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育[7]，通過卵巢濾泡的粒細胞影響卵巢激素的分泌[8]。由此可見，Ghrelin對雞卵泡發(fā)育也具有一定的調(diào)節(jié)功能，然而蛋雞產(chǎn)蛋不同階段Ghrelin的表達水平尚未見直接報道。本實驗運用實時定量PCR（Quantitative Real Time PCR，qRTPCR）和ELISA方法對Ghrelin、GHSR和GOATmRNA在雞卵巢和腺胃的表達水平及血漿和卵巢中Ghrelin的含量變化進行檢測和分析，以探討其表達水平與海蘭褐蛋雞產(chǎn)蛋各時期的對應關(guān)系，為通過誘導Ghrelin表達提高產(chǎn)蛋率及延長產(chǎn)蛋高峰期提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及樣品采集 從河南省新鄉(xiāng)市某雞場選取產(chǎn)蛋前期、產(chǎn)蛋高峰期和產(chǎn)蛋后期的海蘭褐母雞各3批，每批12只，各時期每批隨機選取3只雞，肝素與血液比例1:10，心臟采血4 mL，低溫4℃5 000 r/min 離心5 min，收集血漿待測。然后按100 mg/100 g 體重烏拉坦麻醉，頸動脈放血處死，解剖分別取其部分腺胃和卵巢組織，預冷的PBS沖洗后放入液氮冷凍，放置于超低溫冰箱內(nèi)保存，用于后續(xù)的ELISA分子生物學實驗，取材后的母雞投入實訓中心化糞池。

1.2 總RNA提取和cDNA合成 總RNA提取：將收集的各時期卵巢和腺胃，同一時期的3只雞組織樣品為一組，置于液氮中研磨，稱取少于0.1 g研磨樣品加入TRIzol（15596018，Invitrogen）1 mL裂解細胞，將RNA釋放到溶液中，加入氯仿室溫放置15 min，12 000 ×g 4℃離心后吸取上層水相到一新管并加入異丙醇沉淀RNA 8 min，12 000 ×g 4℃離心后棄上清，75%乙醇（DEPC水配）洗沉淀2次，室溫干燥5 min，加入Rnase free water 充分溶解沉淀，檢測RNA濃度和OD值（A260/A280），分裝放置于超低溫冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

cDNA合成：取1 μg總RNA，根據(jù)PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047A，TaKaRa）說明配制10 μL反應體系去除總RNA中的基因組DNA，反應在PCR儀上進行，條件： 42℃ 2 min，4℃保持；反應完畢后進行反轉(zhuǎn)錄反應，總體系20 μL，前述反應液10 μL，加入配制的反轉(zhuǎn)錄混合液10 μL，混勻后立即放入PCR儀進行反應，條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保持，反應完畢后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ELISA實驗

1.3.1 組織勻漿 將產(chǎn)蛋前期、產(chǎn)蛋高峰期和產(chǎn)蛋后期的雞卵巢按1:1比例加入遇冷的PBS冰上勻漿，5 000 ×g 離心 10 min，取上清備用。

1.3.2 ELISA檢測 按下述步驟采用ELISA法檢測血漿和卵巢中Ghrelin含量：①取出試劑盒（Chicken Ghrelin ELISA Kit， CSB-E14230C，CUSABIO），于室溫（20～25℃）放置15～30 min復溫，實驗過程在室溫（20～25℃）下進行；②每孔加入100 μL順序標記的標準品溶液；③實驗孔中加入100 μL待測血漿或卵巢勻漿上清，對照孔加入100 μL滅菌雙蒸水；④每孔加入50 μL酶標液；⑤將酶標板密封后，37℃反應1 h；⑥磷酸緩沖液（PBS，pH=7.32）洗滌酶標板3次后徹底拍干；⑦分別加A、B液顯色劑各50 μL，避光反應15 min；⑧加入50 μL終止液停止反應；⑨30 min內(nèi)在酶標儀上讀取各孔的OD值，計算Ghrelin含量。

1.4 qTR-PCR 為了研究海蘭褐蛋雞產(chǎn)蛋周期不同階段基因變化情況，qTR-PCR方法被用來檢測腺胃和卵巢GHRELIN、GHSR和GOAT基因的轉(zhuǎn)錄表達變化，引物和實驗程序參照文獻[9]。GHSR的引物根據(jù)GenBank的序列（序列號：NM_204394）設計，F(xiàn)：TCTTTTTCCTGCCCGTATTCTGC，R：AGTCTGCTTGTTGTTCTTGTCCCTG。

1.5 統(tǒng)計分析 Excel錄入數(shù)據(jù)，用平均值±標準差表示，采用單因子方差分析，數(shù)據(jù)應用SAS軟件（Version 8.01，SAS Institute）進行多重比較，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 海蘭褐蛋雞產(chǎn)蛋周期各階段血漿和卵巢中Ghrelin含量變化 如表1所示，產(chǎn)蛋前期、產(chǎn)蛋高峰期和產(chǎn)蛋后期血漿中Ghrelin的含量分別是149.26、153.57、173.90 pg/mL（P>0.05）， 而 卵巢中沒有檢測到Ghrelin。

2.2 海蘭褐蛋雞產(chǎn)蛋周期各階段腺胃中Ghrelin、GHSR和GOATmRNA的轉(zhuǎn)錄表達變化 由表2可見，腺胃中Ghrelin、GHSRmRNA的表達水平在產(chǎn)蛋前期、產(chǎn)蛋高峰和產(chǎn)蛋后期均沒有明顯變化（P>0.05），產(chǎn)蛋高峰期腺胃Ghrelin的轉(zhuǎn)錄表達水平比產(chǎn)蛋前期略有升高（P>0.05）。腺胃中GOAT的表達模式與Ghrelin和GHSR基本一致，表現(xiàn)為隨產(chǎn)蛋時間的增加而升高（P>0.05）。

表1 海蘭褐蛋雞產(chǎn)蛋各階段血漿Ghrelin含量變化 pg/mL

2.3 海蘭褐蛋雞產(chǎn)蛋周期各階段卵巢中Ghrelin、GHSR和GOATmRNA的轉(zhuǎn)錄表達變化 如表2所示，產(chǎn)蛋高峰期卵巢內(nèi)GhrelinmRNA的表達水平最高，為產(chǎn)蛋前期的1.98倍（P<0.05），產(chǎn)蛋后期GhrelinmRNA的表達水平較產(chǎn)蛋高峰期有所下降，比產(chǎn)蛋前期升高（P>0.05）。卵巢中GHSR和GOATmRNA的表達水平在產(chǎn)蛋高峰期最高，產(chǎn)蛋后期出現(xiàn)下降，且產(chǎn)蛋高峰期卵巢內(nèi)GHSR和GOATmRNA表達水平顯著高于產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋后期（P<0.05），但產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋后期差異不顯著（P<0.05）。

表2 海蘭褐蛋雞產(chǎn)蛋各階段腺胃和卵巢中Ghrelin、GHSR和GOAT mRNA的表達豐度

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，海蘭褐蛋雞產(chǎn)蛋周期不同階段血漿中Ghrelin含量變化無明顯差異，各階段腺胃中Ghrelin、GHSR和GOAT基因的轉(zhuǎn)錄表達也無顯著差異，而卵巢Ghrelin、GHSR和GOAT基因在產(chǎn)蛋周期的高峰期表達水平最高，與產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋后期有顯著差異（除Ghrelin在產(chǎn)蛋后期變化不明顯），表明產(chǎn)蛋周期各階段卵巢Ghrelin、GHSR和GOATmRNA的轉(zhuǎn)錄表達模式與外周血和腺胃不一致。這與哺乳動物中的研究較為相似，即大鼠發(fā)情周期血清中的Ghrelin水平波動較小[4]，而GhrelinmRNA在卵巢黃體期表達最高，在動情前期表達最低[10]。杜晨光等[11]研究發(fā)現(xiàn)，綿羊卵巢中的GhrelinmRNA在成熟卵泡中的表達水平顯著高于未成熟卵泡，且在發(fā)育階段中呈現(xiàn)一定變化規(guī)律，人、大鼠、豬和綿羊等均發(fā)現(xiàn)隨著黃體形成到成熟過程中，黃體Ghrelin表達逐漸升高，在退化期表達較低[12]。以上研究表明，哺乳動物卵巢Ghrelin對黃體的形成和卵泡的發(fā)育均有促進作用。本研究結(jié)果與哺乳動物卵巢Ghrelin的表達變化類似，即海蘭褐蛋雞在產(chǎn)蛋高峰期時，產(chǎn)蛋量最高，此時卵巢活動應最旺盛，卵巢Ghrelin的表達水平也最高，說明GhrelinmRNA的表達水平隨著卵巢機能的增強而升高、隨著卵巢機能的衰退而下降。在外周器官中，Ghrelin具有廣泛的生物功能，從胃腸的分泌和運動到細胞的增殖調(diào)控，但在較小范圍內(nèi)，Ghrelin也能調(diào)控生長激素、黃體生成素（LH）、FSH、催乳激素、促腎上腺皮質(zhì)激素和抗利尿激素等的分泌[6]，Ghrelin通過GHSR起作用[13]，推測下丘腦除調(diào)控外周血和腺胃Ghrelin外，可能通過調(diào)節(jié)卵巢Ghrelin來影響LH和FSH等生殖激素，以自分泌或旁分泌的方式調(diào)節(jié)卵巢的活動。Kaiya等[14]研究發(fā)現(xiàn)，雞小腦和下丘腦中有GhrelinmRNA的表達，Ghrelin的免疫陽性細胞在禽類的大腦和小腦中有分布，也推測了Ghrelin可能以自分泌或旁分泌的方式調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)。Caminos等[4]在小鼠卵巢發(fā)現(xiàn)Ghrelin有自分泌或旁分泌的作用。

禽類產(chǎn)蛋周期各階段卵巢中多數(shù)生殖激素的表達水平有明顯的變化。研究發(fā)現(xiàn)，禽類產(chǎn)蛋周期的產(chǎn)蛋高峰期卵巢中FSH和雌激素的表達水平最高，顯著高于產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋后期[15]，與本研究結(jié)果一致。慈光新等[7]研究發(fā)現(xiàn)，Ghrelin可促進雞等級前卵泡顆粒細胞的增殖，協(xié)同F(xiàn)SH調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育，這也進一步說明卵巢Ghrelin可受到其他激素影響，并可與其他性腺激素起到協(xié)同作用。

Sirotkin等[6]研究表明，Ghrelin和GHS-R1amRNAs在雞卵巢的表達直接影響雞卵巢顆粒細胞的增殖和凋亡，可能是卵巢分泌活動的調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)卵巢功能，如增殖、凋亡和激素分泌等。本研究結(jié)果也表明，Ghrelin、GHSR和GOATmRNA的表達水平在產(chǎn)蛋高峰期明顯增加，推測卵巢Ghrelin可能協(xié)同其他激素對蛋雞產(chǎn)蛋高峰期開始時間或蛋雞產(chǎn)蛋高峰期持續(xù)時間起到調(diào)控作用，這對探索蛋雞生產(chǎn)等方面的研究有一定的指導作用。

此外，本實驗未檢測到卵巢中Ghrelin的存在，推測卵巢自身分泌的Ghrelin量較低，用現(xiàn)有的ELISA試劑盒（檢測范圍：25 ～ 400 pg/mL）未能檢出。Ghrelin是一種肽激素，微量的蛋白表達變化可能會對蛋雞的產(chǎn)蛋情況帶來意想不到的效果，因而出現(xiàn)產(chǎn)蛋周期的不同階段產(chǎn)蛋量的變化。

4 結(jié) 論

本實驗結(jié)果表明，卵巢中Ghrelin、GHSR和GOAT基因的表達與產(chǎn)蛋周期的不同階段具有一定的相關(guān)性，推測Ghrelin及其相關(guān)基因在卵巢中的表達可能調(diào)節(jié)產(chǎn)蛋量和產(chǎn)蛋時間，這對研究養(yǎng)禽業(yè)提前蛋雞產(chǎn)蛋高峰期時間和延長蛋雞產(chǎn)蛋高峰期有很大的幫助。

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Expression Changes of Ghrelin and Ghrelin-Related Genes during Different Laying Stages of Hyline Brown Hens

HU Shan-ming, LI Jia-jun, SUN Hao, ZHAO Ying, MA Jin-you, ZHANG Yan-hong, YU Yan*
(College of Animal Science and Veterinary Medicine, Henan Institute of Science and Technology, Henan Xinxiang 453003, China)

In this study, Ghrelin content in plasma and ovarian, the expression level ofGhrelin,GHSR(growth hormone secretagogue receptor) andGOAT(ghrelin O-acyltransferase) mRNAs in ovarian and proventriculus of Hy-Line Brown chickens were detected using ELISA and qRT-PCR assays to explore the change regularity of chickenGhrelin,GHSRandGOATduring pre laying period, laying peak and late laying period. We hoped it would provide the theory basis for inducing the expression ofGhrelinto promote the growth and development of follicle and laying rate, and prolong the laying cycle. The results demonstrated that there were no obvious changes in plasma Ghrelin and the expression levels ofGhrelin,GHSRandGOATmRNA in proventriculus in the different laying period. In ovarian, however, the expression ofGhrelinmRNA in Laying peak period increased by 98.2% than that of pre-laying period (P<0.05), while the expression ofGhrelinmRNA in late laying period decline by 25% than that of laying peak, but there was no signi fi cant difference between them (P>0.05). The pattern ofGHSRandGOATmRNA expression in ovarian was the similar asGhrelinmRNA, which was higher expression levels in laying peak than pre-laying period and late laying period (P<0.05), but there was no signi fi cant difference between Pre laying period and late laying period (P>0.05). These results suggested that the expression levels ofGhrelin,GHSRandGOATmRNA in Hy-Line Brown chickens ovarian were related with its laying period.

Ghrelin;GHSR;GOAT; Laying period; HyLine brown layers

S831.1

A

10.19556/j.0258-7033.2017-12-022

2017-07-10；

2017-10-12

河南省高?？萍紕?chuàng)新團隊項目（18IRTSTHN019）；河南省科技攻關(guān)項目（162102110038）；新鄉(xiāng)市科技攻關(guān)項目（CXGG16026）

胡善明（1996-），男，河南光山人，本科生，E-mail：605526327@qq.com

*通訊作者：余燕（1972-），主要從事發(fā)育與繁殖生理研究，E-mail:yymtt03@163.com