聶光偉，王恩森，李明楊，毛 翠，毛慧敏，王國(guó)水，左 波，徐在言*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)科動(dòng)醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430070；2. 浙江天蓬集團(tuán)有限公司，浙江江山324111）

大白豬群中CTSL基因多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

聶光偉1，王恩森1，李明楊1，毛 翠2，毛慧敏2，王國(guó)水2，左 波1，徐在言1*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)科動(dòng)醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430070；2. 浙江天蓬集團(tuán)有限公司，浙江江山324111）

組織蛋白酶L（CTSL）基因?qū)儆诮M織蛋白酶（cathepsin）家族成員之一，該基因在調(diào)控肉質(zhì)嫩度上發(fā)揮著重要作用，可以作為豬生長(zhǎng)和胴體性狀的候選基因。實(shí)驗(yàn)采用PCR-RFLP技術(shù)在大白豬群體中對(duì)CTSL基因第5外顯子g.143 C>T單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，分析該位點(diǎn)與生長(zhǎng)及胴體性狀的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果表明：在大白豬群體中共有3種基因型，分別是TT、TC和CC基因型，CC基因型個(gè)體達(dá)100 kg體重日齡天數(shù)顯著小于TT基因型個(gè)體（P<0.05），但其他性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果未達(dá)到顯著水平。

豬；CTSL基因；多態(tài)性；關(guān)聯(lián)分析；生長(zhǎng)性狀

組織蛋白酶（cathepsin）屬于肽酶家族，主要存在于骨骼肌的溶酶體中，以肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白及其相關(guān)蛋白作為其反應(yīng)基質(zhì)[1]。不僅能水解肌纖維中的蛋白，而且還能使動(dòng)物的結(jié)締組織變松散，進(jìn)而影響動(dòng)物屠宰后肌肉嫩度[2]。組織蛋白酶主要分為天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶四大類(lèi)[3]。同時(shí)，組織蛋白酶種類(lèi)很多，從組織蛋白酶A到Z都已有報(bào)道。組織蛋白酶L（CTSL）屬于溶酶體木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶成員，其空間結(jié)構(gòu)主要由α螺旋構(gòu)成的L結(jié)構(gòu)域以及由β折疊構(gòu)成的R結(jié)構(gòu)域組成[4]。組織蛋白酶L參與促進(jìn)激素的生成和降解過(guò)程，可能涉及到脂肪的生成與肌肉質(zhì)量的增加[5]。Yamazaki等[6]在小鼠骨骼肌中研究發(fā)現(xiàn)，CTSL是FOXO1發(fā)揮作用的直接靶基因，闡明了FOXO1/CTSL通路在快速誘導(dǎo)骨骼肌代謝變化和肌萎縮過(guò)程中，所起的關(guān)鍵作用。

據(jù)報(bào)道，豬組織蛋白酶基因多態(tài)性與平均日增重、背膘厚、瘦肉量和肌內(nèi)脂肪含量具有相關(guān)性。汪亮亮等[7]對(duì)豬CTSL基因啟動(dòng)子區(qū)篩查出7個(gè)SNPs位點(diǎn)，其中T-1129C、T-1137C、T-1463C 3個(gè)位點(diǎn)中TT基因型頻率在本地豬種中要高于外國(guó)豬種，為優(yōu)勢(shì)基因型。Fontanesi等[8]在豬CTSL基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)1個(gè)SNP位點(diǎn)（g.143 C>T），在意大利大白豬群體中關(guān)聯(lián)分析結(jié)果得出，與平均日增重、背膘厚和瘦肉量具有顯著相關(guān)性。Russo等[9]研究了部分蛋白酶基因單核苷酸多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)與豬生長(zhǎng)及胴體性狀存在相關(guān)性。因此，對(duì)CTSL基因多態(tài)性的深入研究，為其作為豬重要經(jīng)濟(jì)性狀候選基因標(biāo)記，將具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)豬群及性狀測(cè)定 美系大白豬（586頭），體重在85～135 kg，使用一次性采血器在前腔靜脈處采集血液?；蚪MDNA采用血液基因組DNA中量提取試劑盒（離心柱型）提取，于-80℃超低溫冰箱中保存。樣本采集及數(shù)據(jù)收集于浙江開(kāi)盛生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司。性狀記錄包括達(dá)100 kg體重日齡、體長(zhǎng)、初生重、活體背膘厚和眼肌面積?；铙w背膘厚和眼肌面積采用B超儀測(cè)定，測(cè)定部位在倒數(shù)第3、4肋骨間，距離背中線(xiàn)4～5 cm處。所有數(shù)據(jù)經(jīng)GBS5.0育種軟件校正之后，用于關(guān)聯(lián)分析。

表1 基因引物序列

1.2 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 根據(jù)Fontanesi等[5]已發(fā)表的引物序列由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物。

PCR 反應(yīng)體系為10 μL ：2×Es Taq Master Mix（含染料）5.0 μL ；ddH2O 3.0 μL ；Sense primer（10 mmol/L）0.5 μL；Antisense primer（10 mmol/L） 0.5 μL；DNA 1.0 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃，5 min；35個(gè)循環(huán)（95℃，30 s；64℃，30 s；72℃，30 s）；72℃，5 min；25℃，1 min。PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以5 μL的DNA Marker DL2000 作為參照。電泳結(jié)束后利用凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察擴(kuò)增結(jié)果。

1.3 酶切反應(yīng) 本研究采用PCR-RFLP方法對(duì)多態(tài)性位點(diǎn)基因分型。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行酶切，其體系為 20 μL：PCR production 10.0 μL；10×FastDigest Green buffer 2.0 μL；FastDigestTaqI0.5 μL；ddH2O 7.5 μL。65℃消化1 h。然后利用3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)下拍照并保存圖片，統(tǒng)計(jì)基因型。

1.4 基因效應(yīng)分析 采用SAS統(tǒng)計(jì) 軟件中的一般線(xiàn)性模型（GLM）自編程序進(jìn)行基因型和表型值之間的關(guān)聯(lián)分析及顯著性檢驗(yàn)，同時(shí)采用reg程序計(jì)算基因加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)。分析模型為T(mén)ijkl=u+Gi+Fj+Sk+Pl+eijklm。式中，Tijkl為性狀表型值；u為平均值；Gi為基因型效應(yīng)（包括基因加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)；加性效應(yīng)用-1,0和1分別代表純合子TT、雜合子TC和純合子CC基因型，顯性效應(yīng)用1和-1分別代表純合子TT和CC基因型、雜合子TC基因型）；Fj、Sk、Pl作為固定效應(yīng)，分別代表家系、性別、批次，eijklm為殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1CTSL基因的PCR-TaqI-RFLP多態(tài)性檢測(cè) 本研究用于檢測(cè)CTSL基因多態(tài)性的擴(kuò)增片段產(chǎn)物長(zhǎng)度為380 bp（圖1）。利用TaqI限制性?xún)?nèi)切酶酶切后產(chǎn)生218 bp和162 bp的片段，根據(jù)條帶類(lèi)型的不同共檢測(cè)到3種基因型（圖2），分別命名為T(mén)T基因型（380 bp）、TC基因型（380 bp+218 bp+162 bp）和CC基因型（218 bp+162 bp）。

圖1 CTSL基因PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

圖2 CTSL基因PCR-TaqI-RFLP酶切分型結(jié)果

2.2CTSL基因在大白豬中的基因頻率分布及與生長(zhǎng)和胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析

2.2.1CTSL基因在大白豬群體中的基因頻率分布 采用PCR-TaqI-RFLP技術(shù)對(duì)大白豬CTSL基因第5外顯子g.143 C>T單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，在該群體中共檢測(cè)到3種基因型。由表2可見(jiàn)，在美系大白豬群體中CTSL基因的CC基因型頻率高于TT和TC基因型，且C等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因。經(jīng)哈迪-溫伯格平衡檢驗(yàn)，CTSL基因在美系大白豬群體中處于遺傳平衡狀態(tài)（P>0.05）。

2.2.2CTSL基因多態(tài)性與美系大白豬生長(zhǎng)及胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析 由表3得出，CC基因型個(gè)體達(dá)100 kg體重日齡顯著低于TT和TC基因型個(gè)體（P<0.05），且加性效應(yīng)達(dá)到顯著水平（P<0.05）。說(shuō)明CC基因型豬生長(zhǎng)性能要優(yōu)于TT和TC基因型。另外，CC基因型豬活體背膘厚低于TT基因型，眼肌面積則大于TT基因型；而TT基因型豬體長(zhǎng)和初生重則要高于TC和CC基因型，但是均未達(dá)到顯著水平。

表2 大白豬CTSL基因TaqI-RFLP基因型頻率和等位基因頻率

表3 CTSL基因多態(tài)性與大白豬生長(zhǎng)、胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)CTSL基因的SNP（g.143 C>T）位點(diǎn)，及在美系大白豬群體中的基因型分布頻率進(jìn)行了檢測(cè)。在該群體中TT、TC和CC基因型均有分布，其中C等位基因頻率為0.82，是優(yōu)勢(shì)等位基因。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，與達(dá)100 kg體重日齡顯著相關(guān)，但與體長(zhǎng)、活體背膘厚、初生重和眼肌面積各性狀間沒(méi)有達(dá)到顯著水平，這與Fontanesi等[8]的研究結(jié)果不同。其原因可能是兩者研究所用實(shí)驗(yàn)群體和環(huán)境效應(yīng)不同以及分析模型、個(gè)體數(shù)量上的差異所致。

據(jù)在杜洛克豬種上的研究結(jié)果顯示，CTSL基因多態(tài)性與背膘厚和日增重具有顯著性趨勢(shì)，對(duì)瘦肉量的影響達(dá)到顯著性水平，且具有明顯的加性效應(yīng)[10]。Russo等[9]選擇意大利大白豬、長(zhǎng)白豬、杜洛克豬、皮特蘭豬、比利時(shí)長(zhǎng)白豬、漢普夏豬和梅山豬7個(gè)不同豬種，研究了CTSL基因的多態(tài)性及各基因型分布頻率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有杜洛克豬種存在3種基因型（TT、TC和CC）。所以實(shí)驗(yàn)群體的不同，也是影響關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的原因。由于CTSL基因標(biāo)記的突變堿基雖然位于第5外顯子，但并沒(méi)有引起氨基酸的改變，因此不是功能性突變。此外，CTSL基因圖譜位于豬10號(hào)染色體，是豬重要經(jīng)濟(jì)性狀平均日增重和背膘厚的QTLs定位區(qū)域。本研究結(jié)果也證明，CTSL基因多態(tài)性與豬達(dá)100 kg體重日齡具有相關(guān)性。因此，對(duì)CTSL基因重測(cè)序?qū)ふ移渌哂泄δ苄缘腟NP位點(diǎn)，在更大群體中驗(yàn)證標(biāo)記的效應(yīng)，將會(huì)對(duì)該基因在豬遺傳育種上的研究提供更多理論支撐。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，CTSL基因第5外顯子g.143 C>T單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與美系大白豬達(dá)100 kg體重日齡具有顯著性差異，但與初生重、活體背膘厚、眼肌面積和體長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果不顯著。

[1]Etherington D J. The contribution of proteolytic enzymes to postmortem changes in muscle[J]. J Anim Sci, 1984,59(6):1644-1650.

[2]Virgili R, Schivazappa C, Parolari G,et al. Proteases in fresh pork muscle and their influence on bitter taste formation in dry-cured ham[J]. J Food Biochem, 1998,22(1):53-63.

[3]Chwieralski C E, Welte T, Bühling F. Cathepsin-regulated apoptosis[J]. Apoptosis, 2006, 11(2):143-149.

[4]楊東輝, 劉宇, 肖蓉,等. 組織蛋白酶L的結(jié)構(gòu)與功能[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2012, (12):1093-1099.

[5]Funkelstein L, Toneff T, Mosier C,et al. Major role of cathepsin L for producing the peptide hormones ACTH,beta-endorphin, and alpha-MSH, illustrated by protease gene knockout and expression[J]. J Biol Chem, 2008,283(51):35652.

[6]Yamazaki Y, Kamei Y, Sugita S,et al. The cathepsin L gene is a direct target of FOXO1 in skeletal muscle[J]. Biochem J, 2010, 427(1):171.

[7]汪亮亮, 梅盈潔, 李加琪. 豬CTSL基因啟動(dòng)子區(qū)SNP檢測(cè)及多態(tài)性分析[C]. 第十一次全國(guó)畜禽遺傳標(biāo)記研討會(huì), 青島: 中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)畜禽遺傳標(biāo)記學(xué)分會(huì),2008.

[8]Fontanesi L, Speroni C, Buttazzoni L,et al. Association between cathepsin L ( CTSL ) and cathepsin S ( CTSS )polymorphisms and meat production and carcass traits in Italian Large White pigs[J]. Meat Sci, 2010, 85(2):331.

[9]Russo V, Fontanesi L, Scotti E,et al. Single nucleotide polymorphisms in several porcine cathepsin genes are associated with growth, carcass, and production traits in Italian Large White pigs[J]. J Anim Sci, 2008,86(12):3300-3314.

[10]Fontanesi L, Speroni C, Buttazzoni L,et al. Association between polymorphisms in cathepsin and cystatin genes with meat production and carcass traits in Italian Duroc pigs: confirmation of the effects of a cathepsin L ( CTSL )gene marker[J]. Mol Biol Rep, 2012, 39(1):109.

Association Analysis of Polymorphism of CTSL with Growth Traits in Large White Pigs

NIE Guang-wei1, WANG En-sen1, LI Ming-yang1, MAO Cui2, MAO Hui-min2, WANG Guo-shui2, ZUO Bo1, XU Zai-yan1*

(1. College of Animal Science and Veterinary Medicine,Huazhong Agricultural University, Hubei Wuhan 430070, China;2. Zhejiang tianpeng group co, LTD, Zhejiang Jiangshan 324111, China)

CTSLgene, one member of cathepsin family, plays an important role in the regulation meat tenderness and can be used as candidate genes for growth and carcass traits of in pigs. In this study we used PCR-RFLP to detect the SNP g.143 C>T in 5th exon ofCTSLgene in Large White pigs, and analyzed the association of SNP with growth and carcass traits. The results showed that three genotypes (TT, TC and CC) existed in Large white group, and pigs with genotype CC had lower values of days at 100 kg than those with TT genotype (P<0.05), while no signi fi cant difference was observed for other traits.

Pig;CTSLgene; Polymorphism; Association analysis; Growth traits

S828.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-12-026

2017-06-01；

2017-08-03

國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2014BAD20B01）；湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助

聶光偉（1992-），男，河南商丘人，農(nóng)業(yè)推廣（養(yǎng)殖）碩士，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖方面的研究，E-mail：1101799071@qq.com

*通訊作者：徐在言（1976-），女，山東海陽(yáng)人，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)樨i分子生物學(xué)，E-mail：xuzaiyan@mail.hzau.edu.cn