孟 吉吉,于農(nóng)淇，高 源，鄔明麗，樊英智，雷初朝，劉武軍，黨瑞華*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

伊犁馬GHR基因多態(tài)性及其與泌乳性能的關(guān)聯(lián)分析

孟 吉吉1,于農(nóng)淇1，高 源1，鄔明麗1，樊英智1，雷初朝1，劉武軍2，黨瑞華1*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

馬奶具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，但目前關(guān)于馬泌乳性能方面的研究很少。本實(shí)驗(yàn)對(duì)伊犁馬生長(zhǎng)激素受體（GHR）基因外顯子和啟動(dòng)子設(shè)計(jì)13對(duì)引物，以DNA混合池為模板，采用PCR-RFLP法檢測(cè)188匹伊犁馬GHR基因多態(tài)基因型，并分析有產(chǎn)奶量記錄的73匹伊犁馬GHR基因多態(tài)性與泌乳性狀之間的關(guān)系。結(jié)果表明：在伊犁馬中檢測(cè)到GHR基因啟動(dòng)子T-562C突變，CC、TC、TT 3種基因型，其基因型頻率分別0.309、0.676、0.016；C為優(yōu)勢(shì)等位基因，頻率為0.646，T基因頻率為0.354；雖然各基因型間產(chǎn)奶量并沒(méi)有顯著差異（P>0.05），但各基因型的產(chǎn)奶量依次為TT>CC>TC，基因C突變?yōu)門可使產(chǎn)奶量有上升趨勢(shì)，研究結(jié)果可為我國(guó)乳用馬的選育提供一定的參考。

伊犁馬；生長(zhǎng)激素受體基因；泌乳性能；多態(tài)性

生長(zhǎng)激素（GH）是一種由腦垂體前葉嗜酸性細(xì)胞分泌的單一肽鏈蛋白質(zhì)類激素[1]，本身不能直接穿過(guò)細(xì)胞膜，必須通過(guò)與靶細(xì)胞膜表面上的生長(zhǎng)激素受體結(jié)合，通過(guò)介導(dǎo)將信息傳遞到細(xì)胞內(nèi)才能發(fā)揮生理學(xué)功能[2]。生長(zhǎng)激素受體（GHR）基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其遺傳變異意義重大，很容易造成下游基因表達(dá)水平的變化，進(jìn)而引起生理功能的變化[3]。垂體-GH-GHR軸是泌乳性狀調(diào)控的主要機(jī)制之一，此過(guò)程相關(guān)基因也很可能參與泌乳等性狀的調(diào)控。

GHR基因在馬21號(hào)染色體上，有10個(gè)外顯子。Rahmatalla等[4]研究發(fā)現(xiàn)，荷斯坦牛GHR基因在第836位發(fā)生T/A突變，產(chǎn)奶量顯著增加；Blott等[5]的研究也證明了這一觀點(diǎn)。王凱等[6]研究結(jié)果表明，南方荷斯坦奶?；蚨鄳B(tài)性對(duì)乳蛋白率有顯著影響，但對(duì)產(chǎn)奶量影響不顯著，邱崢艷等[7]的研究也證明了這一點(diǎn)。還有許多研究表明，GHR可能是影響泌乳性狀的候選基因。

馬奶具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，與人乳相近，并且易消化吸收[8]。我國(guó)地方品種馬產(chǎn)奶量較低，且不能穩(wěn)定遺傳。目前，畜禽育種已進(jìn)入分子選育時(shí)代，但關(guān)于馬泌乳性能的分子標(biāo)記研究少有報(bào)道。本研究采用DNA混合池、PCR-RFLP等技術(shù)對(duì)伊犁馬GHR基因進(jìn)行多態(tài)檢測(cè)并揭示其是否與產(chǎn)奶量相關(guān)。這也是首次對(duì)伊犁馬GHR基因進(jìn)行相關(guān)研究，對(duì)我國(guó)馬奶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 在新疆伊犁昭蘇馬場(chǎng)選擇188匹母馬為研究對(duì)象。選取年齡約為5～6歲、胎次3～4胎，放牧、飼養(yǎng)和管理?xiàng)l件相同的73匹伊犁馬，記錄其日產(chǎn)奶量。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)馬GHR基因的相關(guān)序列（GenBank號(hào)：NC_009164），利用NCBI Primer Designing Tool 設(shè)計(jì)13對(duì)引物，擴(kuò)增伊犁馬GHR基因目的序列，引物送上海生工生物工程有限公司合成（表1）。

1.3 血樣采集 對(duì)188匹伊犁馬成年母馬采用枸櫞酸鈉抗凝管對(duì)其進(jìn)行頸靜脈采血，裝于真空采血管中，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因組DNA的提取 采用酚-氯仿法提取血液中的基因組DNA，并用1%瓊脂糖電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的純度，-20℃冷凍保存。

1.5 DNA池PCR擴(kuò)增 利用構(gòu)建的DNA池進(jìn)行PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)體系為 12.5 μL：Mix 6.25 μL，上游和下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 4.25 μL。

PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4 min，95℃變性30 s；退火45 s（退火溫度見(jiàn)表1）。72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min；4℃保存?zhèn)溆?。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 直接測(cè)序及BLAST檢測(cè) 選取條帶分明、無(wú)雜帶、產(chǎn)量高的PCR產(chǎn)物送西安擎科有限公司測(cè)序。測(cè)序完成后利用SeqMan程序校正測(cè)序結(jié)果并分析有無(wú) SNPs。

1.7 PCR-RFLP分析 根據(jù)基因序列，選用限制酶HinfI來(lái)進(jìn)行酶切分型，酶切反應(yīng)體系為15 μL，包括 PCR 產(chǎn)物 5 μL，ddH2O 8.7 μL，限制酶 0.3 μL，限制酶緩沖液1 μL，在37℃恒溫條件下酶切10 h。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析 整理匯總酶切分型結(jié)果，進(jìn)行基因頻率計(jì)算，根據(jù)結(jié)果進(jìn)行Hardy—Weinberg平衡適合性檢驗(yàn)并計(jì)算多態(tài)信息含量（PIC）、雜合度和有效等位基因數(shù)（Ne），并用SPSS20.0軟件進(jìn)行產(chǎn)奶量與基因型的關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果 使用1%瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物特異性強(qiáng)、產(chǎn)量高、無(wú)拖尾現(xiàn)象（如圖1），可以送樣測(cè)序并用于RFLP檢測(cè)。

表1 伊犁馬GHR基因引物序列及擴(kuò)增區(qū)域

圖1 GHR基因引物擴(kuò)增結(jié)果

2.2 PCR產(chǎn)物序列分析 選取特異性強(qiáng)、產(chǎn)量高的PCR產(chǎn)物送西安擎科公司進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果用DNAStar軟件的SeqMan程序進(jìn)行分析。分析發(fā)現(xiàn)，在GHR基因外顯子上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)突變，而在啟動(dòng)子區(qū)上檢測(cè)到了1個(gè)SNP位點(diǎn)（T-562C）（圖2）。

圖2 GHR基因SNP測(cè)序檢測(cè)結(jié)果

2.3 PCR-RFLP分型 分析結(jié)果表明（圖3），在伊犁馬GHR基因啟動(dòng)子第-562 bp處檢測(cè)到2種等位基因C和T，3種基因型，分別命名為CC、CT和TT。

對(duì)不同基因型個(gè)體的PCR產(chǎn)物測(cè)序后結(jié)果表明，CC型基因序列與GenBank（GenBank號(hào)：NC_009164）上一致，將其定義為野生型，而TT型定義為突變型。

圖3 GHR基因擴(kuò)增產(chǎn)物酶切分型

2.4GHR基因啟動(dòng)子的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析 進(jìn)行遺傳參數(shù)的SNPs位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)（表2），3種基因型的分布表現(xiàn)為TC>CC>TT，其頻率分別為0.676、0.309、0.016，C為優(yōu)勢(shì)等位基因頻率為0.646，T基因頻率為0.354。對(duì)其進(jìn)行卡方適合性檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)該基因不處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)，可能由于樣本量太少所致。另外，其多態(tài)信息含量（PIC）為0.352 7，屬于中度多態(tài)。雜合度為0.457，純合度為0.543，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.842 3。

2.5GHR基因啟動(dòng)子多態(tài)性與產(chǎn)奶量關(guān)聯(lián)分析 對(duì)73只伊犁馬的產(chǎn)奶量按不同基因型兩兩比較進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果表明T-562C位點(diǎn)各種基因型之間差異不顯著（P>0.05），但等位基因C突變?yōu)門后產(chǎn)奶量有上升的趨勢(shì)（表3）。

表3 伊犁馬GHR不同基因型與日平均產(chǎn)奶量的關(guān)聯(lián)分析

3 討 論

本研究以 188頭伊犁馬為實(shí)驗(yàn)樣本，對(duì)GHR基因進(jìn)行了多態(tài)調(diào)查，在啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)多態(tài)，群體遺傳學(xué)分析顯示此位點(diǎn)處于哈代-溫伯格平衡、中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5）。此突變位點(diǎn)存在3種基因型，且堿基T對(duì)C的替換對(duì)產(chǎn)奶量有一定的提升作用，這可能是由于該突變影響了GHR基因的轉(zhuǎn)錄。群體不處于哈代-溫伯格平衡可能是由于實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量偏少，或者本伊犁馬群由于人工選擇使帶有T等位基因的個(gè)體被保留下來(lái)。另外本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)處于中度多態(tài)，遺傳變異較大，這表明GHR基因此多態(tài)位點(diǎn)有可能用于伊犁馬的選育。目前，GHR基因在許多報(bào)道上都被證明為泌乳性狀的候選基因，如馬彥男等[9]驗(yàn)證GHR基因F279Y位點(diǎn)突變對(duì)中國(guó)荷斯坦牛泌乳性狀的影響的結(jié)果顯示，該位點(diǎn)突變AA型305 d產(chǎn)奶量顯著高于AT型。馬妍等[10]對(duì) 1 145頭中國(guó)荷斯坦牛GHR基因F279Y位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于產(chǎn)奶量和乳脂率，TT與AT基因型之間差異顯著。孫瑞萍等[11]采用PCR-SSCP技術(shù)檢測(cè)西農(nóng)莎能奶山羊發(fā)現(xiàn)，在exon9上檢測(cè)到了NN型和NT型2種基因型，在241 bp處發(fā)生了G→T的突變，并且在某些胎次的產(chǎn)奶量NN和NT基因型產(chǎn)奶量差異顯著。而郭曉飛等[12]采用PIRA-PCR和RFLP法的研究也驗(yàn)證了上述研究的結(jié)論。不過(guò)也有許多研究發(fā)現(xiàn)，GHR基因多態(tài)性與產(chǎn)奶量并沒(méi)有顯著相關(guān)，而只與乳脂率、乳蛋白率等泌乳性狀有顯著相關(guān)；王麗娟等[13]的研究也印證了這一觀點(diǎn)。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)馬GHR基因的研究比較少，尤其對(duì)GHR基因與泌乳性狀的關(guān)聯(lián)研究更是空白。

表2 伊犁馬GHR基因型頻率、有效等位基因數(shù)、雜合度、多態(tài)信息含量

泌乳性狀作為一個(gè)數(shù)量性狀，它的表現(xiàn)不僅受基因的影響，還有環(huán)境作用。而產(chǎn)奶量是一個(gè)遺傳力極低的性狀，常規(guī)的選育并不能使其大幅度提高，現(xiàn)如今分子遺傳學(xué)的發(fā)展使得開(kāi)展標(biāo)記輔助選擇更加便捷，而目前最重要的工作就是找到影響產(chǎn)奶量性狀的候選基因。目前，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)了大量存在于外顯子和內(nèi)含子中的變異，而這些突變也為標(biāo)記輔助選擇（MAS）提供了參考，但關(guān)于馬泌乳性能的有效標(biāo)記還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，這也需要進(jìn)行大量研究來(lái)尋找。

4 結(jié) 果

本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)伊犁馬GHR基因的啟動(dòng)子區(qū)和外顯子區(qū)進(jìn)行了SNPs檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明啟動(dòng)子區(qū)（T-562C）存在多態(tài)并且可以分為CC、CT、TT 3種基因型，雖然各基因型間產(chǎn)奶量差異不顯著，但各基因型產(chǎn)奶量依次為TT>CC>TC，表明該突變與產(chǎn)奶量有一定的相關(guān)，可為我國(guó)乳用馬的選育提供一定參考，但由于實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量較少，還需要大量實(shí)驗(yàn)來(lái)證明。

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Polymorphism of GHR Gene and Its Correlation with Lactation Performance in Yili Horse

MENG Zhe1, YU Nong-qi1, GAO Yuan1, WU Ming-li1, FAN Ying-zhi1, LEI Chu-zhao1, LIU Wu-jun2, DANG Rui-hua1*

(1.College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Shaanxi Yangling 712100, China;2. College of Animal Science, Xinjiang Agricultural University, Xinjiang Urumqi 830052, China)

Mare's milk has a high nutritional value, but there are few research reports on lactation performance of horse until now. This trial was conducted to study the polymorphism of growth hormone receptor (GHR) gene in Yili horse and its relationship with lactation performance. 13 pairs of primers were designed for the exons and promoter ofGHRgene of Yili horse. DNA pooling was used as the template, and PCR product was directly sequenced. PCR-RFLP method was used to genotype the polymorphic sites in 188 Yili horses, and then the relationship between genotypes and lactation traits based on 73 of them was analyzed. The result showed that a T-562C mutation inGHRgene promoter was detected in Yili horse. The frequencies of genotype CC, TC and TT were respectively 0.309, 0.66 and 0.016, and C allele was dominant and its frequency was 0.646. The frequency of T gene was 0.354. The results showed that although the milk yield of each genotype was not signi fi cantly different (P>0.05), it was found that there seems to be a trend in the milk production of each genotype (TT> CC>CT). The mutation (C>T) could increase the milk yield. The results can provide an identi fi able ground for the Chinese dairy horse breeding ef fi ciently.

Yili horse;GHRgene; Lactation performance; Polymorphism

S821.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-12-029

2017-05-27；

2017-07-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81270439）；引進(jìn)人才科研啟動(dòng)費(fèi)（Z111021202）

孟吉吉（1996-），男，山東濟(jì)寧人，本科生，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種，E-mail：nwsuaf_mengzhe@126.com

*通訊作者：黨瑞華（1976-），男，陜西漢中人，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種，E-mail：dangruihua@nwsuaf.edu.cn