李井春，李 琦，黃大鵬，李雁冰，魏國生

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江大慶 163319）

新型動物精子上游分離器的研究

李井春，李 琦，黃大鵬，李雁冰，魏國生*

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江大慶 163319）

本研究旨在為動物體外受精提供具有活力的精子，運用新型精子上游分離器篩選出高活性的精子。本實驗應用3、4.5、6 mm 3種不同上浮高度的精子分離器對豬精子進行篩選，并檢測3種不同高度精子分離器對分離豬精子質量的影響，篩選出最理想的篩選高度的精子分離器。結果表明：上浮高度為4.5 mm精子分離器的精子活率（85.11%）顯著優(yōu)于篩選高度為3 mm的分離器（74.60%）和普通上游法（62.83%）（P<0.05），但與篩選高度為6 mm的分離器差異不顯著（P>0.05）；4.5 mm 精子分離器的畸形率（7.49%）顯著低于對照組和3 mm的分離器（P<0.05）； 4.5 mm精子分離器的精子直線速度和路徑速度最高（P<0.05），但分離精子的密度較普通上游法要低；各組之間豬精子其他質量參數(shù)差異不顯著（P>0.05）。綜合可知，上游高度為4.5 mm的精子分離器優(yōu)于其他高度的分離器及普通上游法，應用上游高度為4.5 mm的精子分離器能夠分離出具有活力的豬精子。

精子上游分離器；上游高度；豬精液；精子質量

近年，隨著體外受精技術的不斷發(fā)展，活力精子的分離和篩選成為體外受精過程中的關鍵環(huán)節(jié)之一?，F(xiàn)在通常采用的方法有密度梯度離心法、上游法等[1-2]。Percoll密度梯度離心法經(jīng)過離心處理對精子造成損傷，操作時間長并且有活力精子回收率低等缺點，而上游法存在回收率低、回收精子長時間上浮培養(yǎng)導致精子質量差的缺點[3-4]。如何簡化活力精子的篩選，提高活力精子的分離效率和質量成為研究的熱點。普通的上浮法分離精子容易使活力精子和死精子或弱精混合，導致精子活力低，質量差[5-6]。

針對這一問題，本實驗設計一款新型精子上游分離器，將精子置于2個腔室中一個小室的底部，有活力的精子想要游出這個小室必須得跨越一道“圍墻”——與另一個小室相通的屏障，而死或弱的精子因不能跨越而留在原小室，以此將有活力的精子和其他精子進行有效分離。本實驗利用豬精子對3種不同上游高度的精子分離器進行測試，檢測不同上浮高度的精子分離器對分離精子質量的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 精子上游分離器實物圖及示意圖見圖1（自主設計及制作）。豬精液采自黑龍江八一農墾大學養(yǎng)豬場的4頭健康長白系種公豬（精子的活力大于80%，畸形率低于20%）。試劑沒有特殊說明均購自西格瑪公司（上海）， 精液稀釋液為Modena稀釋液[7]（實驗室按照配方自己配制）。

圖1 精子上游分離器示意圖

1.2 實驗方法

1.2.1 精液的處理 將10 mL新鮮豬精液置于15 mL離心管中，700×g離心3 min，棄上清，將精子用含0.4%（w/v）BSA的Modena稀釋液懸浮，調整精子密度為1×108個/mL，將懸浮后的精液放入培養(yǎng)箱中，備用。

1.2.2 精子上游分離器的操作方法 在高度為3、4.5、6 mm的上游分離器每個孔中加入1.2 mL培養(yǎng)液，每次添加都要超過中間小室的壁高，同時要排除空氣。然后在分離器中間小室底部緩慢加入0.2 mL備用精液（注意切勿將精液混淆到上層的培養(yǎng)液），置于37℃恒溫箱中上游20 min。上游完成后，將內倉以外的精子上游液全部取出，轉移到2 mL離心管中，然后，取10 μL回收液進行精子質量檢測（邁朗全自動精子質量分析儀）。

1.2.3 普通上游法操作方法 吸取1.2 mL培養(yǎng)液加到普通上游器圓底試管內，然后用移液器將0.2 mL預分離的精液從液滴底部緩慢加入，置37℃恒溫培養(yǎng)20 min，然后取液面以下1/3上游液到2 mL離心管中，取上懸液10 μL利用邁朗豬精子分析儀進行精子質量檢測。

1.3 統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)應用Stat View 5.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，采用方差分析中的多重比較分析實驗結果。當P<0.05時差異顯著。數(shù)據(jù)結果以平均值±標準差來表示，實驗重復4次。

2 結 果

2.1 3、4.5、6 mm上游高度的分離器對精子活率、密度、畸形率、線性度的影響 由表 1可以看出，上游高度為4.5 mm的分離器的精子活率（85.11% ）顯著高于普通上游法和3 mm的分離器（P<0.05），但與6 mm分離器的精子活率差異不顯著（P>0.05）。在精子密度上，普通上游法分離出的精子密度顯著高于上浮高度為4.5、6 mm的分離器（P<0.05），但與3 mm的分離器的差異不顯著（P>0.05）。在精子畸形率上，4.5、6 mm分離器組要顯著低于普通上游法和3 mm分離器組（P<0.05），但4.5、6 mm分離器組之間差異不顯著（P>0.05）。此外，在線性度上，各組之間差異均不顯著（P>0.05）。

2.2 不同高度分離器對精子各種速度及前向性的影響 由表2可見，在精子的直線速度（VSL）和路徑速度（VAP）上，4.5 mm的分離器組顯著高于其他各組（P<0.05），而普通上游法的最低。各組之間精子的曲線速度（VCL）及前向性（STR）參數(shù)不存在顯著差異（P>0.05）。

2.3 不同高度分離器對精子側擺幅值、鞭打頻率及移動角度的影響 由表3可知，上游高度為4.5 mm的分離器的側擺幅值（ALH）、鞭打頻率（BCF）及移動角度（MAD）與高上游高度為3、6 mm以及普通上游法差異都不顯著（P>0.05），但上游高度為4.5 mm分離器的精子的ALH、BCF及MAD的數(shù)值在各組中最高。

3 討 論

上游法分離活力精子是比較常用的精子篩選法之一。Mahadevan等[8]描述，上游法的基本工作原理是基于精子在精漿中自主移動并進入上層介質中實現(xiàn)分離的，可顯著提高精子活力。本實驗中，上游高度的設計是根據(jù)Li等[9]在用孕酮誘導精子和Zhao等[10]在上游法篩選精子這兩種方法得出的。上游高度為4.5 mm的精子上游分離器分離出的精子活率達到85.11%，顯著高于普通上游法（62.83% ）。其原因在于只有活力的精子才能越過設置的高度的“圍墻”，然而死的或弱的精子不能上浮到這個高度，從而分離出有活力的精子，進而提高了分離活力精子的效率。

表1 3、4.5、6 mm高度分離器對精子活率、密度、畸形率、線性度的影響

表2 不同高度分離器對精子各種速度及前向性的影響

表3 不同高度分離器對精子側擺幅值、鞭打頻率及移動角度的影響

上游法對精液密度的影響目前認識不一，蔣敏等[5]報道處理后精子密度顯著增大，劉新雄等[11]則認為處理前后精子密度無顯著差別。本實驗研究結果顯示，高度為4.5 mm的精子分離器分離出的精子密度為1.30×104個/mL，而普通上游法分離出的精子密度為8.68×104個/mL。其主要原因可能普通上游法吸取回收精液時，將死精或弱精一起回收，從而導致精子密度較大，但活率較低。本實驗中4.5 mm的分離器回收精液時，是在獨立的小室回收，不至于導致死精或弱精與活力精子混合，使得回收的精子相對密度較低，但活率較原精液要高。此外，隨著上浮高度的增加，精子的密度出現(xiàn)減小的趨勢，主要是由于能夠跨越“圍墻”的精子數(shù)量應該呈現(xiàn)遞減的趨勢。

精子畸形率與受精率密切相關，是常規(guī)精液分析中重要的形態(tài)學指標。據(jù)文獻報道，采用嚴格精子形態(tài)學標準評價精子形態(tài)對預測體外受精率很有意義，在精子優(yōu)選方面，通過精子分離處理提高正常形態(tài)精子數(shù)目，可以大大提高受精率[12]。本實驗中，這種精子上游分離器分離后的精子的畸形率呈下降的趨勢，可提高精子質量。

一種良好的精液分離技術首先要能保證獲得足夠數(shù)量的活動精子。從精子運動速度和方式判斷，尤其是前向運動精子的平均速度，是預測動物體外受精成功率的重要指標。王利紅等[13]認為，改良上游法可顯著增加前向運動精子的比例。本實驗中，上浮高度為4.5 mm的分離器STR為1.1，而對照組STR為0.93，結果達到了精子進一步優(yōu)化的效果，證明此上游分離器比普通上游器篩選更有效。精子的VAP與VSL也是評判精子質量的重要指標。Donnelly等[14]應用計算機輔助精液自動分析研究結果表明，精子動態(tài)性參數(shù)與精子活率顯著相關。從本研究結果可以看出，高度為4.5 mm的精子分離器活率最高，畸形率最低，分離前后精子的VSL和VAP有明顯改善和提高，且明顯高于對照組，說明這種新型的精子上游分離器可分離出運動能力強的活力精子。

在本實驗中，各組精子的ALH、BCF、MAD、LIN均沒有顯著差異，但是上游高度為4.5 mm分離器的精子的ALH、BCF、MAD的數(shù)值在各組中最高。

4 結 論

本實驗結果表明，上游高度為4.5 mm的精子分離器優(yōu)于其他高度的分離器及普通上游法，應用上游高度4.5 mm 分離器能夠分離出具有活力較高的豬精子。

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Study on a New Sperm Separator by Sperm Flowing Upstream in Animals

LI Jing-Chun, LI Qi, HUANG Da-peng, LI Yan-bing , WEI Guo-sheng*

(College of Animal Science&Veterinary Medicine, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Heilongjiang Daqing 163319, China)

In order to isolate high motility sperm for in vitro fertilization, to screen out the highly effective selection method of viable sperm. In this study, we used three different sperm separators (3, 4.5, 6 mm) to isolate high motility sperm, and test that the effect of three different sperm separators on quality of separated boar sperm. The results showed that 4.5 mm sperm separator in sperm motility (85.11%) was signi fi cantly better than the 3 mm sperm separator (74.60%) and (62.83%) swimup method (P<0.05), but no difference between 6 mm and 4.5 mm sperm separator (P>0.05); However, malformation rate of 4.5 mm sperm separator (7.49%) was signi fi cantly lower than that of the other groups (P<0.05). In addition, 4.5 mm sperm separator in sperm VSL and VAP in all groups was the highest (P<0.05), but the separation of sperm density is lower than swim-up group; In the other quality parameters, there were no signi fi cant difference among the groups (P>0.05). Above the results showed that the sperm separator with a height of 4.5 mm was superior to the other sperm separator and the common swim-up method, and it could separate viable sperm for IVF.

Sperm separator; Upstream height; Boar semen; Sperm quality parameter

S828.3

A

10.19556/j.0258-7033.2017-12-049

2017-03-06；

2017-05-17

國家自然科學基金項目（31402136）；黑龍江省自然科學基金資助項目（C2017053）；黑龍江省農墾總局科研計劃項目（HNK135-04-06）；黑龍江八一農墾大學博士啟動基金（B2012-06、XYB-2016-04）；大慶市指導性科技計劃項目（zd-2016-087）；黑龍江八一農墾大學青年創(chuàng)新人才項目（CXRC2017004）

李井春（1979-），男，吉林長春人，講師，博士，研究方向為動物遺傳育種與繁殖技術，E-mail: ljchun112@163.com

*通訊作者：魏國生（1963-），男，黑龍江青岡人，教授，碩士，研究方向為動物遺傳育種與繁殖技術，E-mail: weigs63@163.com