孫 吉吉，甄玉國 ，趙 巍 ，趙小麗 ，王 濤 ，秦貴信

（1.吉林農業(yè)大學生命科學學院，吉林長春 130118；2. 長春博瑞飼料集團有限公司技術中心，吉林長春 130118；3. 吉林農業(yè)大學動物科技學院，吉林長春 130118）

高通量測序分析酵母培養(yǎng)物對肉仔雞盲腸菌群的影響

孫 吉吉1,2，甄玉國2,3，趙 巍2,3，趙小麗2，王 濤2,3，秦貴信3*

（1.吉林農業(yè)大學生命科學學院，吉林長春 130118；2. 長春博瑞飼料集團有限公司技術中心，吉林長春 130118；3. 吉林農業(yè)大學動物科技學院，吉林長春 130118）

本實驗旨在探討酵母培養(yǎng)物對肉仔雞盲腸菌群的影響。選取336羽健康且體重相近的1 日齡AA肉仔雞，隨機分7個處理組，每組6個重復，每個重復8只。A組（對照組）飼喂基礎日糧，B、C、D、E、F組分別在基礎日糧中添加發(fā)酵時間為12、24、36、48、60 h的酵母培養(yǎng)物，G組在基礎日糧中添加“達農威益康 V XP”酵母培養(yǎng)物產品。預試期7 d，正試期42 d。采用Illumina Miseq高通量測序技術對肉仔雞盲腸內容物菌群分析。結果表明：與A組（對照組）相比，C、D組肉仔雞的平均日增重顯著提高（P<0.05），耗料增重比顯著降低（P<0.05）；而D組肉仔雞盲腸菌群物種多樣性最高，C組最低；在 Phylum（門）的水平上，各組中的Firmicutes （厚壁菌門）比例最高，而C組樣品中Verrucomicrobia（疣微菌門）含量較其他組顯著增加；在Genus（屬）的水平上，7組樣品的盲腸內容物中以Bacteroides、Faecalibacterium、Lactobacillus、Blautia等菌屬為主。綜上，不同發(fā)酵時間的酵母培養(yǎng)物對腸道菌群有顯著影響，可通過調整發(fā)酵時間來控制其代謝產物，進而影響動物的生產性能。

酵母培養(yǎng)物；盲腸菌群；高通量測序

動物腸道健康是維持其正常生長、獲取優(yōu)質動物性產品的首要因素。動物腸道內微生物數(shù)量龐大，功能復雜，介導或影響宿主營養(yǎng)物質代謝及生物活性成分和免疫等生理過程[1]。為腸道微生物提供活菌、一種或幾種益生元無法應對應激環(huán)境中多變的腸道細菌，因此腸道安全需要全面均衡的營養(yǎng)底物來維持其動態(tài)平衡。

酵母培養(yǎng)物通過向動物消化道微生物提供“全價”的營養(yǎng)底物，促進代謝平衡，有效緩解因各類應激引發(fā)的消化功能障礙，能夠保障腸道安全。近年來，酵母培養(yǎng)物逐步成為替代抗生素的微生態(tài)制劑之一[2]。本試驗利用目前研究腸道微生物的前沿技術——Illumina Miseq高通量測序技術，分析不同發(fā)酵時間產生的酵母培養(yǎng)物對肉仔雞盲腸菌群的影響，并初步探討酵母培養(yǎng)物的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及材料 AA肉仔雞購自吉林德詳公司；釀酒酵母培養(yǎng)物為吉林農業(yè)大學吉農博瑞研發(fā)中心實驗室自主篩選配制的糖蜜培養(yǎng)基培養(yǎng)的釀酒酵母培養(yǎng)物，其主要成分包括酵母細胞外代謝產物、經(jīng)發(fā)酵后變異的培養(yǎng)基、自溶后的酵母細胞壁和酵母細胞內容物等。達農威益康V XP（達農威中國有限公司）；免疫指標ELISA試劑盒（上海研生生物科技有限公司）。

1.2 試驗設計 試驗采用完全隨機分組設計，將購自長春德詳公司的1日齡AA肉仔雞336只，隨機分為7個處理組，每組6個重復，每個重復8只雞，且各處理組之間肉仔雞的體重差異不顯著（P>0.05）。日糧參照NRC（1994）和AA 肉雞飼養(yǎng)標準配制，各階段對照組和處理組飼糧營養(yǎng)水平保持一致，且不含藥物成分。試驗預試7 d，正試期42 d。A組為對照組，開始B、C、D、E、F組從第7天開始，分別在基礎日糧中添加發(fā)酵時間為12、24、36、48、60 h的酵母培養(yǎng)物，G組在基礎日糧中添加“達農威益康 V XP”酵母培養(yǎng)物產品，各處理組添加量為0.192%（發(fā)酵液干物質質量/飼料質量）。試驗日糧配方見及營養(yǎng)成分見表1。

表1 基礎日糧組成及營養(yǎng)成分（風干基礎)

1.3 方法

1.3.1 樣品采集 肉仔雞以每個重復為單位，每天記錄投料量、剩料量和損失量，分別于21 d和42 d的前1 d晚上禁食12 h，但不禁水，第2天08:00對每個重復的肉仔雞進行稱重，并記錄各重復的采食量，計算平均日采食量（ADFI）、平均日增重（ADG）和耗料增重比（F/G）。收集屠宰42 d各組肉仔雞盲腸內容物，每組 0.5 g。置于干燥的滅菌試管中，-40℃的冰箱中保存。

1.3.2 DNA 提取和測序 采用腸道內容物基因組DNA 提取試劑盒提取各組肉仔雞盲腸內容物中微生物的總DNA，且每組高通量測序樣本數(shù)為6個。所提取的 DNA 于-40℃的冰箱中保存，干冰條件下送往上海生工生物工程股份有限公司，對樣品進行 PCR 擴增及測序。按指定測序區(qū)域，合成帶有barcode 的特異引物：515F（5'-GTGCCAGCMGCCG CGGTAA -3'）和 806R（5'-GGACTACHVGGGTWT CTAAT-3'），對樣本的16S rRNA基因 V4 區(qū)域進行擴增。

1.3.3 生物信息分析 PCR 產物采用 Miseq 高通量測序平臺進行高通量測序。測序得到的 PE reads 首先使用FLSAH進行拼接，并對序列質量進行質控，在去除低質量堿基及接頭污染序列等操作過程后完成數(shù)據(jù)過濾，得到可供后續(xù)分析的高質量目標序列。生物信息學操作使用QIIME[3]、Mothur[4]、R[5]等軟件對樣本進行Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析以及菌群的結構差異分析。其中，Alpha多樣性是對單個樣品中物種多樣性的分析，包括ACE值、Chaol值、Shannon指數(shù)等。Chaol值和ACE值是根據(jù)所測得的OTU數(shù)量預測樣品中微生物的種類，Shannon指數(shù)是一個多樣性指數(shù)，Shannon指數(shù)越大，則表示該樣品中的物種越豐富。Beta多樣性分析是研究度量時空尺度上物種組成的變化情況。Beta分析有的聚合PCoA、PCA或NMDS等。

1.4 統(tǒng)計分析 采用Excel整理與統(tǒng)計數(shù)據(jù)，結果以平均值±標準差表示，用SPSS19.0軟件進行比較，多重比較用Duncan's 法，用ANOVA過程進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同發(fā)酵時間的酵母培養(yǎng)物對肉雞生長性能的影響 由表2可知，在整個試驗期，C、D 組的ADG和F/G顯著高于對照組（P<0.05）；7～42 d，各試驗組的ADFI與對照組相比變化不顯著。

2.2 菌群Alpha多樣性分析 OTU 數(shù)量可以表示樣品物種的豐度[6]。稀釋性曲線用于判斷測序數(shù)量不同的樣本物種的豐富度及樣本的取樣大小的合理性。從圖1可以看出，飼喂不同發(fā)酵時間的酵母培養(yǎng)物對肉仔雞腸道菌群產生了影響，說明建模成功。隨著所測序列數(shù)量的增加，各組樣品的 OTU 數(shù)量也隨之增大，但增大的幅度呈遞減趨勢，說明測序質量較好，具有一定的深度。

在所有樣品中，D組 OTU 數(shù)量最多，C組最少，表明D組菌群多樣性較高，各處理組間的菌群豐度存在差異不大。Simpson 值越低表示群落多樣性高，對照組的 Simpson 值在樣品中最小，為 0.91，其余樣品的 Simpson 值在0.94～0.97，樣品間的 Simpson值差異不顯著。ACE、Chao1、Shannon 指數(shù)是對菌群豐度進行的評估，值越大表明群落多樣性越高。其中，D組樣品中菌群多樣性指數(shù)最高（ACE值為1187.24，Chaol值為 1183.84），C組最低（ACE值 為 867.51，Chaol值 為 840.33）。D組 的 ACE值和Chaol值顯著高于C組（P<0.05）。同時，Alpha 多樣性分析也表明，與對照組相比，A至F組，隨著添加發(fā)酵時間增加的酵母培養(yǎng)物，肉仔雞腸道菌群的多樣性呈先下降再上升的趨勢，節(jié)點在D組。并且肉仔雞腸道菌群除C組外，A、B、D、E、F組菌群豐度均高于G組。 7組樣品中D、F組的 Shannon 值較大，除C組外，其余各組 Shannon值均高于對照組，說明飼喂發(fā)酵時間為36 h的酵母培養(yǎng)物時，盲腸微生物種類最為豐富。以上數(shù)據(jù)表明，飼喂不同發(fā)酵時間的酵母培養(yǎng)物對肉仔雞腸道菌群多樣性有一定影響。

表 2 酵母培養(yǎng)物對肉仔雞生長性能的影響

圖 1 各組盲腸內容物樣品菌群稀疏曲線

2.3 菌群Beta多樣性分析 根據(jù)測序結果繪制PCA，進一步從宏觀角度了解飼喂不同發(fā)酵時間的酵母培養(yǎng)物各組雞腸道菌群結構差異。由圖2可知，相對于對照組，試驗組的菌群結構組成均發(fā)生一定變化。其中，C組與其他試驗組相比，樣本的距離相對較遠，其菌群結構組成變化較大。說明在飼喂不同發(fā)酵時間的酵母培養(yǎng)物后，試驗組與對照組樣本之間D的菌群結構產生了差異。

圖2 肉仔雞腸道菌群結構PCA

2.4 菌群結構分析 根據(jù)分類學在門及屬水平上對樣品中群落結構進行菌群種類和豐度分析。如圖3所示，7組樣品的菌群組成在 Phylum（門）的水平上，肉仔雞的盲腸微生物以Firmicutes（厚壁菌門）（0.55±0.12）、Bacteroidetes（擬桿菌門）（0.37±0.21）、Verrucomicrobia（ 疣 微 菌 門 ）（0.033±0.023）等3個菌門為主。 其中，C組樣品中疣微菌門含量較其他組顯著增加，占盲腸內容物菌群的50%以上，各組中的厚壁菌門在總菌群中比例最高。而Tenericutes（無壁菌類）在各組中含量較低，但與其他組相比，E組中無壁菌類所占比例相對較大。而只在BEG組中檢測出含量較低的Actinobateria（放線菌門）。在整個盲腸菌群中，在D組和G組中檢測出 Cyanobacteria（藍細菌）、Deferribacteres（脫鐵桿菌門），是這2組特有的菌群。盲腸微生物的優(yōu)勢菌門相對豐度比較結果均為厚壁菌門>擬桿菌門>疣微菌門>變形菌門 。

由圖4可知 , 在Genus（屬）的水平上，7組樣品的盲腸內容物中均包含的優(yōu)勢菌屬為Bacteroides、Faecalibacterium、Lctobacillus、Blautia等屬微生物，比例均在20%左右，而這些菌屬均與維持腸道平衡有關[7]。其中C組中Akkermansia“減肥細菌”顯著高于其他組，而 F組中含量最少。與F組相比，C組Lactobacillus（乳酸桿菌屬）低于F組，可見酵母培養(yǎng)物有助于肉仔雞腸道中Lactobacillus屬的增加。

圖 3 樣品在門水平上的相對豐度

3 討 論

圖 4 樣品在屬水平上的相對豐度

酵母培養(yǎng)物是經(jīng)過有氧環(huán)境下的酵母細胞擴繁和厭氧環(huán)境下酵母細胞發(fā)酵2個不同的工藝控制過程而形成的微生態(tài)制品，主要包括酵母細胞外代謝產物、經(jīng)過發(fā)酵后變異的培養(yǎng)基和少量已無活性的酵母細胞。在生產過程中，所采用培養(yǎng)基的成分和發(fā)酵過程中對肽、酯和有機酸等因素的控制直接導致了酵母細胞發(fā)酵時產生的代謝產物成分的不同[8]。本試驗采用的酵母培養(yǎng)物是由試驗室自主篩選配制的糖蜜培養(yǎng)基培養(yǎng)，選用釀酒酵母種經(jīng)過有氧酵母細胞擴繁12 h，再厭氧發(fā)酵48 h而得到。而目前“達農威益康 V XP”酵母培養(yǎng)物產品也是選用釀酒酵母，通過特配的液體培養(yǎng)液和谷物培養(yǎng)基發(fā)酵而成。

在本試驗條件下，與對照組相比，在基礎日糧中添加不同發(fā)酵時間的釀酒酵母培養(yǎng)物可以改善肉仔雞的生長性能，與多數(shù)研究結果基本一致[9-10]。其中添加發(fā)酵24 h（C組）和36 h（D組）的酵母培養(yǎng)物組提高效果最明顯，且優(yōu)于G組。可能與發(fā)酵24 h和36 h的酵母培養(yǎng)物中含有甘露寡糖、蛋白質螯合物、維生素、酶類、增味物質等一些協(xié)同因子有關[10]。而添加不同發(fā)酵時間的酵母培養(yǎng)物對肉仔雞盲腸菌群的影響也不盡相同。腸道菌群多樣性分析表明，酵母培養(yǎng)物組肉仔雞盲腸菌群多樣性高于對照組，說明酵母培養(yǎng)物影響了肉仔雞腸道微生態(tài)的動態(tài)平衡，且增加了盲腸菌群的多樣性，菌群多樣性的變化與肉仔雞的生長性能存在一定的關聯(lián)。

腸道微生物種類繁多，在門的水平上可分為 6大類，即厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、梭桿菌門和疣微菌門[11-12]，其中90%以上由厚壁菌門和擬桿菌門構成。本研究中，在門水平上，肉仔雞腸道的優(yōu)勢菌群主要包含厚壁菌門、擬桿菌門，這與相關文獻的研究結果相似[12]。與空白對照組和陽性對照組相比，C、D組對肉仔雞的生長性能呈現(xiàn)最佳正效應影響。而F組的生長性能最低，C組的菌群多樣性低于F組。其原因是發(fā)酵24 h的酵母培養(yǎng)物中富含的益生菌不斷增加，增加了乳酸菌等有益菌的有效濃度，選擇性地抑制有害菌繁殖，促進胃腸道有益菌群增殖，從而改善了機體微生態(tài)結構，提高動物對營養(yǎng)物質的利用率[13]，提高了飼料轉化率，對肉仔雞生產性能產生了一定正向影響。這也可能與酵母培養(yǎng)物中的寡糖有關，寡糖具有促進有益菌如雙歧桿菌、乳酸桿菌等增殖作用[14]。C組樣品中疣微菌門含量較其他組顯著增加，占盲腸內容物菌群的50%以上，而F組中疣微菌門含量顯著低于C組。厚壁菌門在各組樣品中的比例變化不明顯，可見不同發(fā)酵時間酵母培養(yǎng)物中的成分對厚壁菌門影響不大。在屬水平上，Bacteroides、Faecalibacterium、Lactobacillus、Blautia比例較高。研究進一步發(fā)現(xiàn)，Blautia、Faecalibacterium、Bacteroides等3個具有產短鏈脂肪酸能力的細菌屬存在于所有的動物個體中，是腸道菌群中的有益菌， 在維持動物健康方面具有至關重要的作用[16]。這也說明飼喂酵母培養(yǎng)物可在一定程度上改善菌群結構。而添加發(fā)酵24 h的酵母培養(yǎng)物組中AKK（Akkermansia） 菌屬顯著高于其他各組，AKK作為益生元，能增厚腸道黏液層，改善代謝，改變脂肪的處理方式，它能特異性地刺激某一種或幾種對健康有益的細菌生長，進而提高動物的生長性能[15-16,18]。

綜上所述，飼糧中添加酵母培養(yǎng)物可促進機體的生長發(fā)育，提高有益菌群的數(shù)量，可能是其自身及發(fā)酵代謝產物中某些成分在發(fā)揮作用，從而改善和維持腸道菌群區(qū)系平衡。酵母培養(yǎng)物中的營養(yǎng)代謝物（如氨基酸、糖類、維生素、有機酸等）能夠為胃腸道內的菌群微生物提供生長代謝底物，從而促進微生物的新陳代謝，并調整菌群結構，提高有益菌群繁殖能力[17,19-20]，但其有效成分及作用機制仍有待驗證。

4 結 論

日糧中添加不同發(fā)酵時間的酵母培養(yǎng)物提高了肉仔雞的生長性能，其中添加發(fā)酵24 h（C組）和36 h（D組）的酵母培養(yǎng)物組提高效果最顯著。酵母培養(yǎng)物能夠提高肉仔雞腸道菌群的豐度，在一定程度上可促進有益菌群數(shù)量的增加。攝入適量酵母培養(yǎng)物有利于調節(jié)腸道菌群的平衡，且添加發(fā)酵24 h的酵母培養(yǎng)物組中AKK菌屬顯著高于其他各組，其作為益生元，能夠改善代謝，促進有益菌生長。

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Effect of Different Fermentation Duration of Yeast (Saccharomyces cerevisiae) Culture on the Intestinal Microbiota by Miseq High-throughput Sequencing

SUN Zhe1,2, ZHEN Yu-guo2,3, ZHAO Wei2,3, ZHAO Xiao-li2, WANG Tao2,3, QIN Gui-xin3*
(1.College of Life Science, Jilin Agricultural University, Jilin Changchun 130118, China;2. Technology Center of Changchun Borui Feed Co. LD, Jilin Changchun, 130114, China;3. College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Jilin Changchun 130118, China)

This study was conducted to investigate the effect of different fermentation time of Yeast (Saccharomyces cerevisiae) Culture on the intestinal microbiota. One-day-old AA 336 broilers with the comparable relative quality were randomly assigned to 7 groups with 6 replicates of 8 broilers each. The broilers in the control treatment A were only fed a basal diet ,and treatment B, C, D , E, F were yeast culture groups, supplemented with fermentation time at 12 h, 24 h, 36 h, 48 h and 60 h of yeast culture,and treatment G was Diamond V XP , respectively. The experiment was based on 42 d to 7 d preliminary trial period. After 42 d. Cecum contents were collected and the intestinal microbiota was detected by Miseq high-throughput sequencing technology. The results showed as follow: Compared with the control group, at 7～42 d, averaged daily gain (ADG)in C and D group were signi fi cantly higher (P<0.05), and that two groups of feed to gain ratio(F/G)were signi fi cantly lower.D group had the highest intestinal microbiota diversity while C group, exhibited the lowest species diversity. In the phylum level, Firmicutes was the most abundant bacterial in 7 groups, while the proportion of Verrucomicrobia was higher in C group was against the other group. In the genus level,Bacteroides, Faecalibacterium, lactobacillus, Blautiawere the more abundant bacterial in 7 groups. In conclusion, different time of fermentation of yeast culture has a signi fi cant effect on intestinal fl ora,and thus we can control composition metabolites of yeast culture by adjusting the fermentation time, in turn, adjusting the structure of intestinal fl ora, affect the production performance of animal.

Yeast culture(YC); Intestinal microbiota; High-throughput sequencing technology

S831.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-12-067

2017-10-27；

2017-11-06

吉林省教育廳“十二五”科學技術研究項目（2015181））

孫吉吉（1986-），女，吉林長春人，博士研究生，講師，主要從事動物營養(yǎng)與代謝調控研究，E-mail：sunzhe198615@163.com

*通訊作者：秦貴信，教授，博士生導師，E-mail：qgx@jlau.edu.cn