張國輝，劉德波，宋盛英，楊芩，佀勝利

(1.凱里學(xué)院環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院，貴州 凱里 556011； 2.黔東南州森林植物檢疫站，貴州 凱里 556000； 3.黔東南州林業(yè)局種苗與科技推廣站，貴州 凱里 556000)

黔東南州藍(lán)莓葉部病害的種類調(diào)查和病原鑒定

張國輝1，劉德波2，宋盛英3，楊芩1，佀勝利1

(1.凱里學(xué)院環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院，貴州 凱里 556011； 2.黔東南州森林植物檢疫站，貴州 凱里 556000； 3.黔東南州林業(yè)局種苗與科技推廣站，貴州 凱里 556000)

調(diào)查貴州省黔東南州臺江縣藍(lán)莓Vaccniumuliginosum種植地發(fā)生的多種葉部病害，采用ITS保守序列測序和形態(tài)學(xué)鑒定的方法對致病病原微生物分類鑒定。結(jié)果表明藍(lán)莓黑斑病、葉腐病、葉斑病和炭疽病的病原菌依次為互隔交鏈孢霉Alternariaalternata、大毛霉Mucormucedo、巨腔莖點霉Phomamacrostoma和膠胞炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides。

藍(lán)莓；互隔交鏈孢霉；大毛霉；巨腔莖點霉；膠胞炭疽菌

藍(lán)莓Vaccniumuliginosum又名越橘，屬杜鵑花科 Ericaceae 越橘屬Vaccinium植物。果實可直接食用，具有延緩腦神經(jīng)衰老、增強心臟功能、明目及抗癌等獨特功效，被國際糧農(nóng)組織列為人類五大健康食品之一[1]。隨著人們生活水平的提高，藍(lán)莓以風(fēng)味獨特、營養(yǎng)保健功能強日益受到關(guān)注，在市場上供不應(yīng)求，成為潛力巨大的經(jīng)濟(jì)林樹種[2]。由于我國藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)化栽培時間較短，病害報道相對較少。目前，國內(nèi)外報道的發(fā)生在藍(lán)莓營養(yǎng)生長期間的重要葉部病原菌主要有Septoria，Anthracnose，Cylindrocladium和Exobasidium等[3]。國內(nèi)現(xiàn)已做過研究報道的重要病原菌有灰霉病的致病菌灰葡萄孢菌BotrytiscinereaPers.[4]、根癌病的致病菌根癌土壤桿菌Agrobacteriumtumefaciens[5]、炭疽病的致病菌尖孢炭疽菌Colletotrichumacutatum與膠孢炭疽菌C.gloeosporioides[6]和圓斑病的病原菌細(xì)極鏈格孢Alternariatenuissma[7]等。此外，僵果病的病原菌Moniliniavaccinii-corymbosi、銹病的病原菌Pucciniastrumvaccinii、白粉病的病原菌Microsphaeravaccinii[8]等雖有報道，但是沒有進(jìn)行詳盡的病原鑒定及分析。在病害防治方面，藍(lán)莓葉部病害在很多藍(lán)莓種植基地有危害加重趨勢，應(yīng)引起重視。為減少病蟲害的危害和充實貴州省黔東南州藍(lán)莓病蟲害科研資料，本文對貴州省黔東南州臺江縣藍(lán)莓種植基地的葉部病害進(jìn)行調(diào)查及病原真菌分離鑒定。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 2014年8月在貴州省黔東南州臺江縣藍(lán)莓種植基地進(jìn)行病害調(diào)查，采集藍(lán)莓病葉標(biāo)本并記錄病害發(fā)生的特點和癥狀；室內(nèi)試驗在凱里學(xué)院微生物實驗室進(jìn)行。

供試培養(yǎng)基為 PSA培養(yǎng)基；試劑有70%乙醇、0.1%升汞溶液和工業(yè)酒精。

1.2 試驗方法

1.2.1 癥狀的觀察和描述 觀察并描述藍(lán)莓發(fā)病部位的病斑顏色、形態(tài)、大小及危害程度等，并拍照。

1.2.2 病原菌的分離純化和培養(yǎng) 采用組織分離法對藍(lán)莓發(fā)病葉片進(jìn)行病原分離，切取藍(lán)莓病葉組織3塊，接種在培養(yǎng)基上，再倒置于28 ℃培養(yǎng)2～3 d。對病原菌進(jìn)行分離純化，直至獲得純培養(yǎng)。再在顯微鏡下對病原菌進(jìn)行鏡檢拍照，同時對致病菌的菌絲和孢子大小進(jìn)行測量和記錄。

1.2.3 病原鑒定 采用形態(tài)學(xué)鑒定和ITS保守序列測定對致病的病原微生物進(jìn)行分類鑒定。ITS保守序列測定時，先將純化后的病原菌在鋪有玻璃紙的PSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4～5 d，刮取菌絲于滅菌研缽內(nèi)研磨至粉狀，DNA提取采用常規(guī)CTAB法。真菌ITSrDNA片段擴增使用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR反應(yīng)在ABI2720 PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系為25 μL。各組分如下：ddH2O 14.0 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，引物ITSI和ITS4各2.0 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL，DNA模板 2.0 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，53℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；最后72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取10.0 μL擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，用凝膠成像系統(tǒng)檢測結(jié)果。將擴增產(chǎn)物利用凝膠回收試劑盒回收純化后送北京諾塞基因組研究中心有限公司進(jìn)行雙向測序。根據(jù)測序結(jié)果，將菌株的ITS-rDNA序列與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行序列比對與同源性分析，結(jié)合病原菌形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，最終確定病原菌種類。

1.2.4 病原回接 純化后的致病菌于PSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～4 d，用無菌水洗下，配制成濃度為106個/mL的孢子懸浮液，采用針刺法接種3片藍(lán)莓健康葉片。發(fā)病后，再從病斑上分離病原菌并鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓黑斑病

癥狀 臺江縣藍(lán)莓黑斑病侵染發(fā)病高峰期在4—5月，主要危害葉片。受害藍(lán)莓的葉片大多都是從葉尖或葉緣發(fā)病，向中央部分?jǐn)U展。發(fā)病部位褐色，發(fā)病嚴(yán)重時會影響藍(lán)莓的生長發(fā)育(圖1 a)。

形態(tài)鑒定 病原菌分生孢子梗褐色，具隔，頂端稍膨大，單生或叢生。分生孢子著生于分生孢子梗頂端，褐色，近橢圓形或倒棍棒形，壁磚狀分隔，橫隔膜1～4個，縱隔膜1～4個，分隔處略縊縮，頂端無喙?fàn)罴?xì)胞，(3.5～8.5)μm×(1.5～4.0)μm。菌絲淡褐色，1～2μm(圖1 b)。根據(jù)形態(tài)特征初步鑒定該病原菌為鏈孢霉Alternariasp。

菌株的ITS鑒定 利用通用引物ITS1和ITS4，通過PCR擴增得到522bp的ITS片段。對其進(jìn)行測序后(見附件1)，在NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST比對分析可知，該菌株的ITS片段與來源于大豆Glycinemax的AlternariaalternataF185 (Genebank NO.KM979936)相似性最高，為100%。

結(jié)合ITS的序列特征和形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果，最終確定該病原菌為互隔交鏈孢霉Alternariaalternata。

a.初期癥狀；b.Alternaria alternata分生孢子圖1 藍(lán)莓黑斑病初期癥狀及其病原菌特征

2.2 藍(lán)莓葉腐病

癥狀 該病主要危害葉片。葉尖或葉緣部位均可發(fā)病，引起葉部變色腐爛。發(fā)病部位褐色，葉緣發(fā)病部位往往出現(xiàn)皺縮變形，葉尖發(fā)病常出現(xiàn)深褐色軟腐現(xiàn)象(圖2 a)。

形態(tài)鑒定 病原菌菌落灰色，氣生菌絲旺盛。病原菌的孢囊梗無色，無隔，不分支。頂端著生的孢子囊灰色，單生，表面有突起，圓形，直徑60～90 μm(圖2 b)。孢囊孢子無色，長橢圓形，大小為(15～20)μm×(7～10) μm。(圖2 c)。根據(jù)形態(tài)特征鑒定該病原菌為大毛霉Mucormucedo。

2.3 藍(lán)莓葉斑病

癥狀 藍(lán)莓葉斑病主要危害葉尖。受害藍(lán)莓的葉片大多都是從葉尖向中央擴展。發(fā)病部位褐色，發(fā)病嚴(yán)重時葉尖變褐皺縮死亡(圖3 a)。

形態(tài)鑒定 病原菌分生孢子器黑色，散生、埋生或半埋生于培養(yǎng)基中，球型或近球形，頂端有孔，直徑為70～150 μm。分生孢子橢圓形或卵形，無色，單胞，部分細(xì)胞中部有溢縮，大小為(4.0～6.0)μm×(1.5～2.0)μm,有1～2個油球(圖3 b)。

圖2 藍(lán)莓葉腐病初期癥狀及其病原菌Mucor mucedo特征

a.發(fā)病癥狀；b.Phoma macrostoma的分生孢子器圖3 藍(lán)莓葉斑病癥狀及其病原菌特征

菌株的ITS鑒定 利用通用引物ITS1和ITS4，通過PCR擴增得到522bp的ITS片段。對其進(jìn)行測序后(見附件2)，在NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST比對分析可知，該菌株的ITS片段與來源于波葉大黃Rheumrhabarbarum的PhomamacrostomaWAC 7881(Genebank NO.DQ474117)相似性最高，為99%。

結(jié)合ITS的序列特征和形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，最終確定該病原菌為巨腔莖點霉Phomamacrostoma。

2.4 藍(lán)莓炭疽病

癥狀 該病主要危害葉片、枝條和果實。葉片沿葉尖及葉緣形成不規(guī)則形或橢圓形凹陷斑，病斑初為黃褐色，后擴展為深褐色，且中央灰褐色，其上散布有小黑點，交界線明顯，棕紅色(圖4 a)。

形態(tài)鑒定 病原菌分生孢子無色，單胞，卵圓形或橢圓形，有2個油球，圓柱狀，頂端鈍圓，(9.5～27.0)μm×(3.5～7.0)μm(圖4 b)。根據(jù)形態(tài)特征初步鑒定該病原菌為膠胞炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides。

a.發(fā)病葉片癥狀；b.Colletotrichum gloeosporioides分生孢子圖4 藍(lán)莓炭疽病初期癥狀及其病原菌特征

菌株的ITS鑒定 利用通用引物ITS1和ITS4，通過PCR擴增得到560 bp的ITS片段。對其進(jìn)行測序后(見附件3)，在NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST比對分析可知，該菌株的ITS片段與來源于茶樹Camelliasinensis的ColletotrichumgloeosporioidesCS32 (Genebank NO.KU145153)相似性最高，為99%。

結(jié)合ITS的序列特征和形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，最終確定該病原菌為膠胞炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides。

2.5 致病性測定 采用針刺法用孢子懸浮液接種3 d后，藍(lán)莓葉片發(fā)病，發(fā)病率95%以上。再從病斑上采用組織分離法分離病原菌并鑒定，結(jié)果表明分離菌株與以上接種菌株相同，根據(jù)柯赫氏法則，證明接種菌株為藍(lán)莓葉部病害的致病菌。即藍(lán)莓黑斑病、葉腐病、葉斑病和炭疽病的病原菌分別為互隔交鏈孢霉、大毛霉、巨腔莖點霉和膠胞炭疽菌。

3 結(jié)論與討論

本文研究結(jié)果表明黔東南州葉部病害藍(lán)莓黑斑病、葉腐病、葉斑病和炭疽病的病原菌分別為互隔交鏈孢霉、大毛霉、巨腔莖點霉和膠胞炭疽菌。

藍(lán)莓葉部病害的鑒定各地結(jié)果并不一致。云南省引起藍(lán)莓葉斑病的病原菌鑒定為細(xì)極鏈格孢菌Alternariatenuissima，該菌不但可以侵染藍(lán)莓葉部引起葉斑病，同時也侵染藍(lán)莓嫩枝和果實[8]。遼寧省對藍(lán)莓炭疽病發(fā)病枝條及葉片的病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子學(xué)鑒定，基本明確遼寧省部分地區(qū)的藍(lán)莓炭疽病是由尖孢炭疽菌和膠孢炭疽菌侵染所致[6]。吉林省的研究表明是由石楠擬盤多毛孢Pestalotiopsisphotiniae引起的藍(lán)莓圓斑病[3]。本文研究的結(jié)果為貴州省藍(lán)莓葉部病害的鑒定提供了科學(xué)依據(jù)。

鑒于藍(lán)莓葉部病害的癥狀相似性很高，為確保藍(lán)莓病害鑒定的可靠性，必須加大室內(nèi)分離純化鑒定的工作量，糾正以病害特征為主的鑒定方法。要保證藍(lán)莓生產(chǎn)走有機方向，就必須提前預(yù)防和綜合防治病害。在病害預(yù)防方面，應(yīng)采用抗病蟲品種、培育壯苗、加強栽培管理、清潔田園等一系列措施[5]。在藍(lán)莓葉部病害的防治方面，主要有以下措施可行：越冬前清除果園落葉，結(jié)合修剪剪除帶病枝條集中處理[7]。同時，在國外藍(lán)莓品種引進(jìn)方面要加強苗木的檢疫檢驗，防止帶病菌植株流入國內(nèi)[9]；篩選高效菌根真菌和制備菌根制劑對藍(lán)莓的生產(chǎn)也有深遠(yuǎn)的影響[10]。

志謝：感謝中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所范成明副研究員和中國科學(xué)院微生物研究所王龍老師提供的病原菌分子鑒定結(jié)果。

附件1:

TCTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACACAAATATGAAGGCGGGCTGGAACCTCTCGGGGTTACAGCCTTGCTGAATTATTCACCCTTGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCTTGGTGGGTTCGCCCACCACTAGGACAAACATAAACCTTTTGTAATTGCAATCAGCGTCAGTAACAAATTAATAATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCACTTTGAACCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTCTTGTCTCTAGCTTTGCTGGAGACTCGCCTTAAAGTAATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGTCGCACTCTCTATCAGCAAAGGTCTAGCATCCATTAAGCCTTTTTTCAACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAA

附件2:

TTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCTAGAGTTGTAGGCTTTGCCTGCTATCTCTTACCCATGTCTTTTGAGTACCTTCGTTTCCTCGGCGGGTCCGCCCGCCGATTGGACAATTTAAACCCTTTGCAGTTGCAATCAGCGTCTGAAAAAACTTAATAGTTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGTGTTTGTCTCGCCTTTGCGCGCAGACTCGCCTCAAAACAATTGGCAGCCGGCGTATTGATTTCGGAGCGCAGTACATCTCGCACTCTGCCTTCAGAACGACGGCGTCCAGAAGTACATTTTTACACTCTTGACCTCTCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAA

附件3:

TCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACTGAGTTTACGCTCTATAACCCTTTGTGAACATACCTATAACTGTTGCTTCTGTTTGTGGTAGGGTCTCCGCGACCCTCCCGGCCTCCCGCCTCCGGGCGGGTCGGCGCCCGCCGGAGGATAACCAAACTCTGATTTAACGACGTTTCTTCTGAGTGGTACAAGCAAATAATCAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGGCCCTACAGCTGATGTAGGCCCTCAAAGGTAGTGGCGGACCCTCCCGGAGCCTCCTTTGCGTAGTAACTTTACGTCTCGCACTGGGATCCGGAGGGACTCTTGCCGTAAAACCCCCCAATTTTCCAAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAA

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SpeciesinvestigationandpathogenidentificationofblueberryleafdiseasesinsoutheastGuizhou/

ZHANG Guohui，et al.

( Department of Environment & Biological Sciences,Kaili College,Kaili Guizhou 556011,China)

The leaf diseases ofVaccniumuliginosumplanted in Taijiang county of Guizhou province were investigated.The pathogenic fungi were identified by ITS conserved sequence and morphological method.The results showed that the pathogen wereAlternariaalternata,Mucormucedo,Phomamac-rostomaandColletotrichumgloeosporioides.Those pathogenic fungi respectively lead to black spot disease,leaf mould,leaf blight and anthracnose.

Vaccniumuliginosum;Alternariaalternata;Mucormucedo;Phomamacrostoma;Colletotrichumgloeosporioides

2016-04-26

貴州省普通高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(黔教合人才團(tuán)隊字[2014]48)；貴州省教育廳“125 計劃”重大科技專項項目(黔教合重大專項字[2013]028)

張國輝(1978—)，女，遼寧東港人，碩士，副教授，主要從事植物病理教學(xué)和研究，E-mail：59833259@qq.com。

S763.15

A

1671-0886(2017)02-0042-05

(責(zé)任編輯 楊靜莉)