袁小遠(yuǎn)，楊金興，張玉霞，孟凱，李莉，王友令，艾武

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，山東 濟(jì)南 250023）

NDV和A PMV-4的F和HN蛋白糖基化位點(diǎn)的差異分析比較*

袁小遠(yuǎn)，楊金興，張玉霞，孟凱，李莉，王友令**，艾武**

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，山東 濟(jì)南 250023）

本文就禽副黏病毒的兩種不同血清型APMV-1（以NDV為代表）和APMV-4的F和HN蛋白糖基化位點(diǎn)進(jìn)行分析比較。分析顯示：F蛋白糖基化位點(diǎn)NDV強(qiáng)弱毒株毒株均有6處糖基化位點(diǎn)，而APMV-4毒株則只有4處潛在的糖基化位點(diǎn)，而且位置與APMV-1略有不同。同時，NDV強(qiáng)毒株GM的HN蛋白有5個潛在的糖基化位點(diǎn)，而La Sota弱毒株有6個潛在的糖基化位點(diǎn)，即538～540位為NKT；APMV-4毒株有7處潛在的糖基化位點(diǎn)，且位置與APMV-1完全不一致。

新城疫病毒；禽副黏病毒；F/HN蛋白；糖基化位點(diǎn)

禽副黏病毒病 (Avain Paramyxoviridae virus，APMV)是當(dāng)今危害全球養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病之一，其病原共有九個血清型(APMV 1～9)[1]。禽副粘病毒1型最常見的是新城疫病毒（NDV），ND是引起家禽等的一種急性、烈性傳染性疾病，發(fā)病率和死亡率均很高，并且多種禽類等都可以感染。NDV是禽副黏病毒1型的代表，也是各型禽副黏病毒型中研究最為透徹的，而對禽副黏病毒APMV 2～9的分子特性和致病性知之甚少[2-4]。GenBank數(shù)據(jù)庫關(guān)于APMV-4型的分離毒株信息只有數(shù)株，相關(guān)研究非常有限。對于APMV-4的研究現(xiàn)在已獲悉：APMV-4可以從水禽中分離到，可導(dǎo)致病禽的肺炎、支氣管炎等呼吸道癥狀，而且可以在雞胚和 部分 細(xì) 胞上 增 殖[5，6]。

糖基化作為一種主要的翻譯后修飾作用對蛋白質(zhì)的功能有著重要影響；糖基化位點(diǎn)能夠參與影響病毒蛋白的合成，進(jìn)而影響其活性和功能。因此，通過分析比較APMV-1和APMV-4的F和HN蛋白糖基化位點(diǎn)的不同，為兩者作用機(jī)理的研究提供科學(xué)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株及背景資料 NDV的GM強(qiáng)毒株、疫苗株La Sota和APMV-4 QY毒株均由山東省SPF雞研究中心分離鑒定保存。GM強(qiáng)毒株為雞源基因VII型強(qiáng)毒株，La Sota為基因II型弱毒疫苗株，APMV-4的QY毒株為鴨源弱毒株。

1.1.2 試劑 PCR試劑盒、膠回收試劑盒、載體等均購自寶生物工程（大連）有限公司，Simple RNA kit購自博日生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參照GenBank中NDV和APMV4的全基因組序列 （No：KU342001和 KC439346）設(shè)計(jì)4對引物，分別用于擴(kuò)增F和HN全長基因。引物由華大基因公司合成，PAGE plus級別純化。

表1 F/HN基因擴(kuò)增引物

1.2.2 RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 GM、La Sota、QY毒株的病毒RNA的提取按照Simple RNA試劑盒使用操作說明進(jìn)行，最后用20μl DEPC水溶解RNA，立即進(jìn)行RT操作。反轉(zhuǎn)錄RT按照文獻(xiàn)[7]的操作進(jìn)行，cDNA產(chǎn)物-20℃保存。

1.2.3 PCR擴(kuò)增、連接和驗(yàn)證 APMV-1和APMV-4 的 cDNA 產(chǎn)物 5μl、2×pfu PCR Buffer（含Mg2+、dNTP plus）25μl、pfu DNA Polymerase(5U/μl)1μl、不同的 F 和 R primer(20pmol/μl)各 1μl，加水補(bǔ)至 50μl。PCR反應(yīng)經(jīng)摸索確定為：95℃預(yù)變性4min；第一步 94℃變性 60s、第二步 48～52℃退火60s、第三步 72℃延伸 90s，共進(jìn)行 33個循環(huán)；72℃后延伸 4min；4℃保存。將擴(kuò)增得到的 GM、La Sota、QY的F和HN產(chǎn)物純化后與PMD-19T進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、PCR反應(yīng)驗(yàn)證后，陽性質(zhì)粒送至華大基因測序。

1.2.4 糖基化位點(diǎn)的比較分析 各毒株F和HN序列進(jìn)行拼接后利用DNAStar v6.13和Mega6.0進(jìn)行分析，比較各個片段的糖基化位點(diǎn)的不同。

2 結(jié)果

2.1 F和HN基因序列測定和同源性分析 經(jīng)序列測定，APMV-1的GM分離毒F和HN的ORF長度分別為 1662、1716bp；La Sota 為 1662bp 和1734bp，而APMV-4 F和HN的ORF長度分別為1701、1698bp。就 F基因而言，APMV-4的 QY與GM、La Sota的氨基酸同源性為 30%、31.6%；就HN基因而言，QY與GM、La Sota的氨基酸同源性為 33.2%、32.6%。綜上，APMV-1和APMV-4的F和HN基因的同源性較低。

2.2 F蛋白糖基化位點(diǎn)分析 分析各毒株F蛋白的糖基化位點(diǎn)（即N-X-S/T）的不同之處，結(jié)果見表2。F蛋白糖基化位點(diǎn)La Sota和GM毒株均有6處糖基化位點(diǎn)，而APMV-4毒株則缺少2處位點(diǎn)，只有4處潛在的糖基化位點(diǎn)，而且位置與APMV-1略有不同。

表2 F蛋白糖基化位點(diǎn)的位置

2.3 HN蛋白糖基化位點(diǎn)分析 分析各毒株HN蛋白的糖基化位點(diǎn)不同之處，結(jié)果見表3。NDV強(qiáng)毒株GM HN蛋白有5個潛在的糖基化位點(diǎn)，而La Sota弱毒株有6個潛在的糖基化位點(diǎn)，即538～540位為NKT。APMV-4毒株完全與APMV-1不同，共有7處潛在的糖基化位點(diǎn)。從表3可以看出APMV-4與APMV-1的HN蛋白糖基化位點(diǎn)的數(shù)量與位置完全不一致。

表3 HN蛋白糖基化位點(diǎn)的位置

3 討論

APMV-1的HN、F蛋白是兩大糖基化蛋白，也是宿主保護(hù)性抗原。F蛋白是病毒感染細(xì)胞的必需蛋白，以非活性前體F0的形式存在；經(jīng)宿主細(xì)胞特異性的蛋白酶水解后F蛋白才能表現(xiàn)出融合活性，通過促進(jìn)病毒穿入宿主細(xì)胞膜而發(fā)揮融合作用[8]。HN蛋白是NDV中較大的糖蛋白，在識別唾液酸受體、促進(jìn)細(xì)胞融合等方面有重要作用[9,10]。HN蛋白在融合的過程能夠識別并結(jié)合細(xì)胞受體。APMV-4毒株基因組全長是15054bp，與副黏病毒的“六規(guī)則”一致；基因組包含6個非重疊的基因，也是按NP/VMF-HN-L的順序排列。每個基因的兩側(cè)是高度保守的轉(zhuǎn)錄起始和停止信號，并且有長度為9～42nt的間隔序列。

蛋白質(zhì)的糖基化是指在糖基轉(zhuǎn)移酶作用下將糖轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)，隨即和蛋白質(zhì)上的氨基酸殘基形成糖苷鍵的過程。糖基化作為一種主要的翻譯后修飾作用對蛋白質(zhì)功能有著重要修飾作用，例如它對于蛋白質(zhì)的折疊、運(yùn)輸、定位以及調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能等方面起著重要作用[11,12]。因此，對于糖基化位點(diǎn)的研究意義重大。

本文在對APMV-1和APMV-4的HN、F基因進(jìn)行全基因測序的基礎(chǔ)上，對其潛在的糖基化位點(diǎn)進(jìn)行分析。最終確定APMV-4毒株與APMV-1的強(qiáng)毒株和弱毒株F和HN蛋白糖基化位點(diǎn)存在差異，尤其是HN蛋白，糖基化位點(diǎn)的數(shù)量與位置完全不一致。以上研究數(shù)據(jù)為禽副黏病毒的不同血清型病毒感染和作用機(jī)制提供了科學(xué)的研究基礎(chǔ)。

[1] Alexander D J.Avian Paramyxoviridae recent developments[J].VeterinaryMicrobiology,1990,23(1-4):103-114.

[2] Liu X F,Wan H Q,Ni X X,et al.Pathotypical and genotypical characterization of strains of Newcastle disease virus,isolated from outbreaks in chicken and goose flocks in some regions of China during 1985-2001 [J].Archives ofVirology,2003,148(7):1387-1403.

[3] Wang KC,Chen GQ,Jiang WM,et al.Complete Genome Sequence ofa Hemagglutination-Negative Avian Paramyxovirus Type 4 Isolated from China [J].Genome Announcements,2013,1(2):e0004513.

[4] Molouki A,Peeters B.Rescue of recombinant Newcastledisease virus:a shorthistoryofhow it all started[J].Archives of Virology,2017,162(7):1-10.

[5] Khattar S K,Nayak B,Kim S H,et al.Evaluation of the Replication,Pathogenicity,and Immunogenicity of Avian Paramyxovirus(APMV)Serotypes 2,3,4,5,7,and 9 in Rhesus Macaques[J].Plos One,2013,8(10):e75456.

[6] Choi K S,Kim J Y,Kye S J,et al.Genetic diversity of avian paramyxovirus type 4 isolatesfrom wild ducks in Korea from 2006 to 2011[J].Virus Genes,2013,46(2):302-308.

[7] 袁小遠(yuǎn),楊金興,王友令,等.一株野禽新城疫強(qiáng)毒分離株的分子特性及其對不同宿主的致病性[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報,2014,22(3):273-279.

[8] Cardenas-Garcia S,Afonso C L.Reverse Genetics of NewcastleDiseaseVirus[J].Methodsin Molecular Biology,2017,1602:141.

[9] Liu J,Zhu J,Xu H,et al.Effects of the HN Antigenic Difference between the Vaccine Strain and the Challenge Strain ofNewcastle Disease Virus on VirusSheddingand Transmission[J].Viruses,2017,9(8):225-229.

[10] Chu F,Wen H,Zhang W,et al.'a'-Position Mutated and G4-Mutated Hemagglutinin Neuraminidase Proteins of Newcastle Disease Virus Impair Fusion and Hemagglutinin -Neuraminidase -Fusion Interaction by Different Mechanisms [J].Intervirology,2013,56:27-36.

[11] Panda A,Elankumaran S,Krishnamurthy S,et al.Loss of N ～Linked Glycosylation from the Hemagglutinin ～Neuraminidase Protein Alters Virulence ofNewcastle Disease Virus[J].J.Virol,2004,76:4965-4975.

[12] Pegg C L,Hoogland C,Gorman J J.Site-specific glycosylation of the Newcastle disease virus haemagglutinin -neuraminidase [J].Glycoconjugate Journal,2016:1-17.

S858.312.65+9.5

B

1673-1085（2017）12-0008-03

2017-11-17

山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年基金項(xiàng)目（2014QNM15）、 山東省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（ZR2015CM009）；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（CXGC2016A10）。

袁小遠(yuǎn)（1980.01-），女，漢，山東榮成人，博士，研究方向：禽病分子生物學(xué)與免疫學(xué)。E-mail：xyyuan1980@163.com。

**通訊作者：王友令（1974-），男，副研究員，研究方向：家禽疫病防控研究。E-mail：wangyouling71@163.com。

艾武（1964-），女，研究員，研究方向：家禽疫病診斷與防治。 E-mail：767068849@qq.com.cn。