雷華明，李 偉

( 長江大學(xué) 濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心，湖北 荊州 434025 )

黃鱔血清轉(zhuǎn)鐵蛋白多克隆抗體的制備及檢測

雷華明，李 偉

( 長江大學(xué) 濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心，湖北 荊州 434025 )

為實現(xiàn)黃鱔血清轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的原核表達并制備其多克隆抗體，利用基因特異性引物從黃鱔肝臟cDNA中擴增黃鱔轉(zhuǎn)鐵蛋白的C端序列，亞克隆至原核表達載體pET-28a(+)中，構(gòu)建pET/Tf-C重組表達載體；轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后進行IPTG誘導(dǎo)。利用Ni離子親和層析技術(shù)純化Tf-C蛋白，并免疫新西蘭兔制備多克隆抗體；通過間接ELISA技術(shù)和組織蛋白印跡對制備的多克隆抗體進行檢測。試驗結(jié)果表明，成功構(gòu)建pET/Tf-C原核表達載體，并實現(xiàn)了蛋白的表達和純化；制備的多克隆抗體效價大于1∶25 600，并能特異性地識別來源于黃鱔不同組織的血清轉(zhuǎn)鐵蛋白。研究結(jié)果對黃鱔血清轉(zhuǎn)鐵蛋白功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

黃鱔; 轉(zhuǎn)鐵蛋白; 多克隆抗體; 制備

血清轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin, Tf)是存在于動物血清中的一種重要鐵離子結(jié)合蛋白，在機體鐵離子代謝和平衡調(diào)節(jié)中起重要的作用[1]，還作用于呼吸、細胞生長和增殖及免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)等過程[2]。典型的轉(zhuǎn)鐵蛋白分子是一條分子量約80 ku的單鏈多肽，由N端、C端和鉸鏈區(qū)組成[3]。魚類的血清轉(zhuǎn)鐵蛋白在魚類健康養(yǎng)殖方面具有重要的應(yīng)用前景[4]。近幾年就有包括尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[5]、白氏文昌魚 (Branchiostomabelcheri)[6]、斑點叉尾(Ictaluruspunctatus)[7]和魚(Miichthysmiiuy)[8]等魚類的轉(zhuǎn)鐵蛋白基因被克隆，其重組蛋白的鐵離子結(jié)合能力、抗菌活性及遺傳多樣性也成為重要的研究內(nèi)容。黃鱔(Monopterusalbus)是我國重要的經(jīng)濟魚類，在全國范圍內(nèi)廣泛分布。開展黃鱔免疫相關(guān)分子的研究對于黃鱔養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。沈志民等[9]開展了黃鱔血清轉(zhuǎn)鐵蛋白的分離純化及結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的初步分析。王博文等[10]從黃鱔血液中提取了血清轉(zhuǎn)鐵蛋白，并對其分子量、表面形貌、二級結(jié)構(gòu)進行了表征。但是，目前國內(nèi)外尚未見在體外重組表達黃鱔血清轉(zhuǎn)鐵蛋白基因并制備其多克隆抗體的相關(guān)報道。

筆者通過構(gòu)建黃鱔血清轉(zhuǎn)鐵蛋白的原核表達載體，利用大腸桿菌(Escherichiacoli)表達重組蛋白，經(jīng)過親和層系技術(shù)純化該蛋白，同時免疫新西蘭兔制備多克隆抗體，分析多克隆抗體的效價及特異性。將為進一步研究黃鱔血清轉(zhuǎn)鐵蛋白在鐵離子代謝和免疫系統(tǒng)中的作用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

含黃鱔轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的質(zhì)粒pE-Tf(本實驗室保存)；限制性內(nèi)切酶、LA Taq DNA 聚合酶(大連寶生物)；T1感受態(tài)細胞、BL21(DE3)感受態(tài)細胞、pEASY-T1克隆載體、蛋白質(zhì)分子量標準(北京全士金)；IPTG、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑(Sigma公司)；HRP標記羊抗兔IgG(Proteintech公司)；DAB顯色試劑盒(武漢谷歌生物)；動物組織總蛋白提取試劑盒(上海貝博生物)；Ni離子親和層系柱(上海七海生物)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 原核表達載體的構(gòu)建

根據(jù)筆者實驗室克隆的黃鱔轉(zhuǎn)鐵蛋白基因(序列號：KF500526)，設(shè)計了基因特異性引物rc-F(5′-CGGGAATTCGAATGGTGTAATGTGGGC-3′)和rc-R (5′-CACGCGGCCGCCT GTCTGAGTGATTTCATGGC-3′)以擴增轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的C端序列。上游引物添加了EcoRⅠ酶切位點，而下游引物添加了NotⅠ酶切位點。將擴增產(chǎn)物經(jīng)過酶切后回收純化，與進行同樣雙酶切的pET-28 a進行T4連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T1感受態(tài)細胞后進行菌液PCR擴增、雙酶切和序列測定驗證，經(jīng)過測序正確的質(zhì)粒命名為pET/Tf-C。

1.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達

將重組表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，涂布于50 μg/mL的卡那霉素平板上進行37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取陽性轉(zhuǎn)化子于卡那霉素50 μg/mL的液體LB培養(yǎng)基中37 ℃、230 r/min搖培至指數(shù)生長期后添加IPTG，至濃度為0.1 mmol/L，培養(yǎng)4 h。取適量菌液進行超聲破碎，加入5×上樣緩沖液進行12% SDS-PAGE電泳檢測目標蛋白的表達情況。

1.4 重組蛋白的純化

將上述陽性菌株按照1∶100的比例接種于1 L含有50 μg/mL的卡那霉素的新鮮液體培養(yǎng)基中200 r/min 37 ℃恒溫培養(yǎng)8 h。離心收集菌體，用50 mmol/L的PBS(pH 8.3)懸浮菌液，進行超聲波破碎。超聲波破碎后收集沉淀部分，用裂解緩沖液(6 mol/L鹽酸胍，20 mmol/L咪唑，50 mmol/L PBS pH=8.3)洗滌3次后，加入適量裂解緩沖液溶解，上清液經(jīng)過濾后用5 mL 的親和層析鎳柱His-Binding-Resin 進行純化，純化的蛋白經(jīng)含6、3、1.5、0.5、0.1 mol/L的鹽酸胍緩沖液梯度透析復(fù)性后，使用透析袋濃縮，用BCA法測定蛋白含量。

1.5 多克隆抗體的制備

將500 μg經(jīng)純化的蛋白和等體積弗氏完全佐劑進行充分乳化后采用皮下多點注射法免疫新西蘭大白兔。每次間隔1周，共免疫5次。自第2次免疫開始，用500 μg融合蛋白混合不完全弗氏佐劑進行加強免疫。最后一次加強免疫后1周采全血分離抗血清，并于-80 ℃分裝保存。

1.6 多克隆抗體的效價分析

以純化的融合蛋白為包被抗原，以第一次免疫前采集的兔血清為陰性對照，將兔抗Tf-C蛋白多克隆抗體進行1∶200～1∶51 200倍比稀釋，以HRP標記的羊抗兔IgG為二抗，以3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺為底物顯色液，進行間接ELISA分析。以免疫血清樣品D450值/陰性對照血清D450值≥2時為陽性作為判定標準，制備的多克隆抗體的最大稀釋度作為該抗體的有效效價。

1.7 多克隆抗體特異性的Western Blot分析

首先將含有空白質(zhì)粒的菌株總蛋白、陽性菌株總蛋白和純化的蛋白進行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜上。用制備的抗血清進行1∶200倍稀釋后作為一抗，用HRP標記的羊抗兔IgG為二抗進行多抗的特異性檢測。

利用動物組織總蛋白提取試劑盒提取黃鱔肝臟、脾臟、肌肉、腸和血液共5種組織的總蛋白。取50 μg各組織總蛋白進行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜上。用制備的抗血清進行1∶200倍稀釋后作為一抗，用HRP標記的羊抗兔IgG為二抗進行多抗的特異性檢測。

2 結(jié) 果

2.1 原核表達載體的構(gòu)建

采用含有限制性酶切位點的基因特異性引物rc-F和rc-R從pE-Tf質(zhì)粒上可擴增993 bp的條帶，而對重組菌進行的菌液PCR擴增發(fā)現(xiàn)也可擴增相符大小的片段(圖1a)。提取的重組質(zhì)粒用EcoRⅠ和NotⅠ進行酶切結(jié)果獲得了1條約1000 bp的條帶和1條約5000 bp的條帶(圖1b)，結(jié)果表明，黃鱔Tf-C序列已經(jīng)成功克隆至pET-28a(+)中。

圖1 重組表達載體的驗證

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達及純化

將測序驗證過的質(zhì)粒pET/Tf-C轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后，用0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4 h后發(fā)現(xiàn)重組菌表達了1條約37 ku的蛋白條帶，與預(yù)期Tf-C分子量相符，主要以包涵體形式存在。進一步將該菌株大量擴繁超聲破碎后，進行包涵體蛋白的純化和復(fù)性，12%SDS-PAGE電泳檢測發(fā)現(xiàn)，使用Ni-NTA瓊脂糖親和層系柱獲得的樣品蛋白所含雜帶較少，說明最終純化的目的蛋白純度較高，可用于下一步的多抗制備(圖2)。

圖2 黃鱔Tf-C重組蛋白的誘導(dǎo)表達及純化

ck1:空白質(zhì)粒菌株; ck2:重組菌未誘導(dǎo); 1:重組菌IPTG誘導(dǎo); 2:純化的Tf-C.

2.3 多克隆抗體的效價檢測

純化的蛋白免疫新西蘭大白兔后獲得的超免疫血清通過間接ELISA方法進行檢測，當D450(陽性血清)/D450(陰性血清)≥2.1時，結(jié)果為陽性。檢測結(jié)果顯示，陽性血清的最高稀釋度為1∶25 600(圖3)。該結(jié)果表明，成功獲得了較高效價的兔抗Tf-C蛋白的免疫血清。

圖3 間接ELISA檢測多抗血清的效價

2.4 多克隆抗體的Western Blot檢測

多抗血清對純化重組蛋白特異性的檢測結(jié)果表明，自制的多抗可以與純化的蛋白只產(chǎn)生1條特異帶，而與陽性重組菌的總蛋白產(chǎn)生較特異的反應(yīng)；空白質(zhì)粒的總蛋白并未與多抗產(chǎn)生特異性反應(yīng)，說明制備的多抗血清具備較好的特異性(圖4)。

圖4 Western Blot 分析多抗的特異性

CK:轉(zhuǎn)空白質(zhì)粒菌株總蛋白; 1:轉(zhuǎn)重組質(zhì)粒菌株總蛋白; 2: 純化的Tf-C蛋白.

2.5 多抗與組織來源的總蛋白的特異性反應(yīng)檢測

為進一步分析多抗是否與動物組織總蛋白產(chǎn)生特異性反應(yīng)，將制備的多抗血清作為一抗，用HRP標記的羊抗兔IgG作為二抗進行了Western Blot分析。結(jié)果表明，制備的抗血清也可較特異性地與來源于黃鱔肝臟、脾臟、肌肉、腸和血液中的總蛋白產(chǎn)生特異性條帶，各組織帶型、大小一致，進一步說明制備的兔抗Tf-C血清具備良好的特異性和應(yīng)用價值(圖5)。

圖5 抗血清與組織蛋白的Western blot檢測

3 討 論

鐵離子代謝平衡對機體維持活性氧運輸、電子傳遞和DNA合成等過程至關(guān)重要。血清轉(zhuǎn)鐵蛋白和其受體一起在調(diào)控細胞內(nèi)鐵離子代謝平衡及降低Fe3+離子轉(zhuǎn)化為Fe2+對細胞造成細胞毒性的解毒過程中具有重要作用；并且它們還是重要的免疫相關(guān)分子[11]。國內(nèi)外魚類育種學(xué)家已開展了諸多魚類轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的分離、遺傳多樣性分析及與先天免疫關(guān)系等的研究[5-8,12]。魚體中的轉(zhuǎn)鐵蛋白也被認為是抗菌性非特異性體液免疫機制的重要組成部分[13]。黃鱔作為我國淡水養(yǎng)殖業(yè)中重要的經(jīng)濟魚類，其健康養(yǎng)殖和可持續(xù)性發(fā)展受到了出血病等多種細菌性病害的影響[14]。黃鱔抗病分子育種的研究亟需分離和鑒定黃鱔免疫相關(guān)基因并開展功能研究以應(yīng)用于養(yǎng)殖實踐。黃鱔血清轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的分離和鑒定為這種需求提供了基本條件。

人類的血清轉(zhuǎn)鐵蛋白蛋白結(jié)構(gòu)是由一個N端和一個C端及中間短小的鏈接區(qū)組成的兩個相對獨立的功能單位構(gòu)成的[15]。N端和C端都具有Fe3+的高親和性和可逆的結(jié)合位點；造成這個現(xiàn)象的原因很可能是因為早期的轉(zhuǎn)鐵蛋白基因進行了加倍和融合，從而提高了鐵離子結(jié)合能力[16]。黃鱔血清轉(zhuǎn)鐵蛋白也和其他脊椎動物一樣具有N端和C端結(jié)構(gòu)。筆者利用其C端重組蛋白制備的多克隆抗體能夠特異性地識別各組織總蛋白中的血清轉(zhuǎn)鐵蛋白，一方面證實了血清轉(zhuǎn)鐵蛋白的組織分布是較為廣泛的，另外一方面也提示只采用C端基因序列進行重組表達蛋白進而制備多抗是可行的。黃鱔血清Tf-C多克隆抗體的制備為進一步研究黃鱔血清轉(zhuǎn)鐵蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。

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PreparationandIdentificationofPolyclonalAntibodyofSerumTransferrininSwampEelMonopterusalbus

LEI Huaming, LI Wei

( Engineering Research Center of Ecology and Agricultural Use of Wetland，Ministry of Education，Yangtze University, Jingzhou 434025, China )

This study was performed to express swamp eel transferrin C-lobe inEscherichiacoliin swamp eelMonopterusalbusand to generate rabbit polyclonal antibody of the protein. A pair of primers was used to amplify the C-lobe sequence of swamp eel tranferrin gene from the liver cDNAs. Subsequently, the purified fragments were subcloned into pET 28a(+), and then, the constructed plamid was introduced into BL21(DE3). After it was induced and expressed, recombinant protein was purified by one step affinity chromatography with a Ni-NTA agarose column. New Zealand white rabbits were immunized with the purified protein to generate polyclonal antibodies. Indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was applied to examine the titers of the polyclonal antibody, and Western-blotting was used to detect the specificity of the antibody. Results showed that the titer of the polyclonal antibody was more than 1∶25 600 with indirect ELISA and combined specifically with the overexpressed protein inEscherichiacoliand crude proteins from different tissues of swamp eel. The polyclonal antibody with high affinity and specificity was generated successfully and used for further research on biological function of transferrin in fish.

Monopterusalbus; transferrin; polyclonal antibody; preparation

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.21.019

2016-03-08；

2016-05-12.

國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201510489007)；濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心開放課題(KF2015016).

雷華明(1994—)男，本科生;研究方向:生化與分子生物學(xué). E-mail: 1049810861@qq.com.通訊作者:李偉(1976—)男, 副教授；研究方向:魚類分子生物學(xué). E-mail:wetli@yangtzeu.edu.cn.

S917.4

A

1003-1111(2017)02-0220-04