郭曉龍， 張青峰， 野慶松， 莫鎮(zhèn)濤， 李文娜， 高書穎

(遵義醫(yī)學院珠海校區(qū) 生物工程系， 珠海 519041)

靶向ezrin增強子關(guān)鍵區(qū)的CRISPR/Cas9載體的構(gòu)建

郭曉龍， 張青峰， 野慶松， 莫鎮(zhèn)濤， 李文娜， 高書穎

(遵義醫(yī)學院珠海校區(qū) 生物工程系， 珠海 519041)

構(gòu)建靶向人ezrin增強子關(guān)鍵區(qū)的CRISPR/Cas9載體并檢測其基因敲除功能。設(shè)計2個gRNA，分別靶向人ezrin增強子關(guān)鍵區(qū)的上、下游。合成gRNA寡核苷酸序列，連接至質(zhì)粒pX459構(gòu)建重組質(zhì)粒pX459-sgRNA-EL和pX459-sgRNA-ER。將鑒定正確的CRISPR/Cas9重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至食管癌EC109細胞中，提取細胞基因組DNA，針對gRNA靶位點兩側(cè)進行PCR擴增和亞克隆測序分析。經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切和測序鑒定表明，CRISPR/Cas9重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。在共轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細胞基因組DNA中檢測到ezrin增強子關(guān)鍵區(qū)的缺失。成功構(gòu)建了靶向人ezrin增強子關(guān)鍵區(qū)的CRISPR/Cas9載體，能夠?qū)崿F(xiàn)目標序列的定向敲除。

靶向敲除；ezrin增強子；CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated)是很多細菌和大部分古生菌的天然免疫系統(tǒng)，通過對入侵的病毒和核酸進行特異性的識別，利用Cas蛋白進行切割，從而達到對自身的免疫[1]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)借鑒細菌的防御策略，由gRNA(guide RNA)尋找特定的DNA序列，然后利用Cas9核酸內(nèi)切酶對靶DNA進行切割，造成雙鏈斷裂，在沒有模板的情況下，發(fā)生非同源末端連接，造成DNA缺失突變[2]。目前，CRISPR/Cas技術(shù)已廣泛應用于多種細胞和模式生物的基因編輯[3-5]。

腫瘤相關(guān)基因ezrin在人食管癌[6]、胰腺癌[7]、前列腺癌[8]、乳腺癌[9]等多種腫瘤中存在異常表達現(xiàn)象，其表達上調(diào)與腫瘤細胞的移動侵襲相關(guān)。以往采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，在人ezrin編碼區(qū)的上游存在啟動子和增強子區(qū)，ezrin增強子關(guān)鍵區(qū)-1297/-1186序列很可能對于Ezrin在腫瘤細胞中的高表達起重要作用[10-11]。人ezrin增強子關(guān)鍵區(qū)為非轉(zhuǎn)錄區(qū)域，不能用傳統(tǒng)的RNA干擾的方法進行研究。本研究擬采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，在人ezrin增強子關(guān)鍵區(qū)的上游和下游分別設(shè)計篩選1個特異性gRNA靶位點，構(gòu)建靶向ezrin增強子關(guān)鍵區(qū)的CRISPR/Cas9載體，對2個靶位點同時進行雙鏈斷裂，實現(xiàn)人ezrin增強子關(guān)鍵區(qū)的靶向敲除，為進一步構(gòu)建基因編輯細胞系，研究ezrin增強子的生物學功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒、細胞及主要試劑

質(zhì)粒pX459購自Addgene公司；食管癌EC109細胞購自中國科學院上海細胞庫；感受態(tài)細菌DH5α由本實驗室保存；質(zhì)粒抽提及PCR純化回收試劑盒購自Axygen公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；Guide-it mutation detection kit購自Clontech公司；BbsI核酸內(nèi)切酶購自NEB公司；pMD18-T載體、AgeI核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、PCR Mix購自Takara公司；Annealing Buffer(10×)購自O(shè)rigene公司；胎牛血清購自Hyclone公司；DMEM培養(yǎng)基和Opti-MEM培養(yǎng)基購自Gbico公司。引物合成和測序由Lifetech公司完成。

1.2 gRNA靶位點設(shè)計及寡核苷酸鏈的合成

從GenBank中查找人ezrin序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7430)，利用在線軟件http://www.e-crisp.org/E-CRISP/設(shè)計gRNA靶位點，分別位于人ezrin增強子關(guān)鍵區(qū)(-1297/-1186)的上游和下游。gRNA對應的寡核苷酸鏈(Oligo DNA)按照5′-G(N)20NGG-3′的PAM結(jié)構(gòu)(protospacer adjacent motif)為設(shè)計原則，選擇分值較高的序列，如果序列的正向寡核苷酸鏈(Forward oligo)5′端第一個堿基不是G，則在5′端添加一個G，相應地在反向寡核苷酸鏈(Reverse oligo)的3′端添加一個C。同時在每對互補序列的正向寡核苷酸鏈的5′端添加CACC，反向寡核苷酸鏈的5′端添加AAAC，使其退火后形成的末端與pX459經(jīng)BbsⅠ酶切后形成的黏性末端互補。本研究合成的gRNA對應的Oligo DNA見表1，gRNA-EL和gRNA-ER分別靶向ezrin的-1319/-1300和-1192/-1173序列，NGG分別位于-1319上游和-1173下游。

1.3 pX459-gRNA重組質(zhì)粒構(gòu)建

將Oligo DNA稀釋至終濃度為100 μmol/L，進行退火反應。反應體系如下：兩條互補Oligo DNA各0.5 μL，Annealing Buffer(10×)2 μL，ddH2O 17 μL。將以上體系瞬時離心后，置于65℃水浴中孵育10 min，隨后取出，室溫下緩慢冷卻1～2 h。取2 μL雜交后的雙鏈DNA與載體pX459的BbsⅠ酶切回收片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，在氨芐青霉素抗性平板上篩選陽性克隆，經(jīng)PCR進一步篩選后，提取重組質(zhì)粒進行酶切和測序鑒定。測序鑒定引物為pX459序列，5′-CCAAGTAGGAAAGTCCCATAAG-3′。

表1 gRNA對應的寡核苷酸序列Table 1 Oligo DNA for gRNA

ezrin序列用大寫字母表示，在序列兩端添加的堿基用小寫字母表示

1.4 細胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

人食管癌EC109細胞在含10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中貼壁生長，用含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的消化液消化細胞，進行傳代培養(yǎng)。將細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板，當細胞匯合率為60%～80%時，進行質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染步驟參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明進行。

1.5 細胞基因組DNA突變位點PCR測序鑒定

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EC109細胞48 h后收取細胞，用Guide-it mutation detection kit進行基因組DNA PCR擴增。PCR引物列位于擬刪除序列的上、下游，引物序列如下，PCR-F：5′-CACAAACGTGCCACTTAACCA-3′(ezrin-1543/-1523序列)；PCR-R：5′-AACCGTCAAGCCTTTGAGAAA-3′(ezrin-798/-778序列)。將PCR產(chǎn)物連接至pMD18-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，在氨芐青霉素抗性平板上篩選陽性克隆。隨機取20個克隆進行測序鑒定。測序引物為M13F(-47)：5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′。

2 結(jié)果

2.1 CRISPR/Cas9重組質(zhì)粒的酶切鑒定

gRNA-EL和gRNA-ER分別識別ezrin增強子關(guān)鍵區(qū)(-1297/-1186)的上游(-1319/-1300)和下游序列(-1192/-1173)，其對應的oligo DNA經(jīng)退火反應后分別與質(zhì)粒pX459的BbsⅠ酶切回收片段與連接，構(gòu)建CRISPR/Cas9重組質(zhì)粒pX459-sgRNA-EL和pX459-sgRNA-ER。質(zhì)粒pX459含1個AgeⅠ酶切位點，2個BbsⅠ酶切位點。重組質(zhì)粒pX459-sgRNA-EL含1個AgeⅠ酶切位點，無BbsⅠ酶切位點；pX459-sgRNA-ER含2個AgeⅠ酶切位點，無BbsⅠ酶切位點。經(jīng)AgeⅠ單酶切和經(jīng)BbsⅠ/AgeⅠ雙酶切后，pX459能夠分別形成9175 bp 1條帶和8185 bp+972 bp+18 bp 3條帶片段；而pX459-sgRNA-EL則形成相同的9178 bp 1條帶；pX459-sgRNA-ER形成相同的8183 bp+994 bp 2條帶。重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果(圖1)顯示，酶切片段位置與預計一致。

圖1 重組質(zhì)粒pX459-sgRNA-EL和pX459-sgRNA-ER的酶切鑒定Fig 1 Identification of recombination plasmids pX459-sgRNA-EL and pX459-sgRNA-ER by restriction enzyme

M：DL 10000 DNA marker；1：pX459經(jīng)AgeⅠ單酶切；2：pX459經(jīng)BbsⅠ/AgeⅠ雙酶切；3：pX459-sgRNA-EL經(jīng)AgeⅠ單酶切；4：pX459-sgRNA-EL經(jīng)BbsⅠ/AgeⅠ雙酶切；5：pX459-sgRNA-ER經(jīng)AgeⅠ單酶切；6：pX459-sgRNA-ER經(jīng)BbsⅠ/AgeⅠ雙酶切

2.2 CRISPR/Cas9重組質(zhì)粒的測序鑒定

進一步對重組質(zhì)粒進行測序分析，結(jié)果(圖2)顯示，分別位于人ezrin增強子關(guān)鍵區(qū)上游和下游的gRNA-EL和gRNA-ER模板序列在載體pX459上的連接位置和方向完全正確，重組質(zhì)粒pX459-sgRNA-EL和pX459-sgRNA-ER構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒pX459-sgRNA-EL和pX459-sgRNA-ER測序鑒定Fig 2 Sequencing analysis of recombination plasmids pX459-sgRNA-EL and pX459-sgRNA-ER

A：pX459-sgRNA-EL，實框為gRNA-EL模板序列；B：pX459-sgRNA-ER，虛框為gRNA-ER模板序列

2.3 重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染EC109細胞

重組質(zhì)粒pX459-sgRNA-EL和pX459-sgRNA-ER共轉(zhuǎn)染食管癌EC109細胞48 h后，不經(jīng)抗性篩選直接收取細胞。以轉(zhuǎn)染細胞基因組DNA為模板，PCR擴增包含ezrin增強子關(guān)鍵區(qū)在內(nèi)的DNA序列。gRNA-EL和gRNA-ER識別序列分別位于ezrin增強子關(guān)鍵區(qū)的兩側(cè)，預計非突變基因組DNA擴增片段長766 bp(-1543/-778)；突變基因組DNA刪除147 bp(-1319/-1173)，擴增片段長約619 bp。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖3。由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后未經(jīng)藥物抗性篩選，存在ezrin增強子關(guān)鍵區(qū)未被敲除的細胞，因此在對照組和轉(zhuǎn)染組均能檢測到與預計766 bp相符的目的條帶，為ezrin增強子關(guān)鍵區(qū)非缺失突變片段。而轉(zhuǎn)染組還檢測到小于700 bp的微弱條帶，有可能是CRISPR/Cas9系統(tǒng)在EC109細胞基因組上導致了定點突變，需要進一步鑒定。

圖3 轉(zhuǎn)染細胞ezrin增強子關(guān)鍵區(qū)的PCR鑒定Fig 3 PCR amplification of ezrin enhancer key region from transfected cells

M：DL 1000 DNA marker；1：EC109細胞；2：共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pX459-sgRNA-EL和pX459-sgRNA-ER的EC109細胞

2.4 突變位點的測序鑒定

將共轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的EC109細胞基因組PCR產(chǎn)物與pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，在氨芐青霉素抗性平板上篩選陽性克隆。隨機取20個克隆進行測序鑒定。在測序的20個克隆中，有2個克隆(編號為CL-3和CL-20)在人ezrin增強子關(guān)鍵區(qū)發(fā)生了堿基的缺失。部分克隆的測序比對分析結(jié)果見圖4，測序結(jié)果見圖5，由圖4和5中可見，CRISPR/Cas9重組質(zhì)粒pX459-sgRNA-EL和pX459-sgRNA-ER分別在預定位點對基因組DNA進行的切割，實現(xiàn)人ezrin基因增強子關(guān)鍵區(qū)的靶向敲除。

圖4 亞克隆測序的序列比對分析Fig 4 Alignment of subclones sequencing

陰影斜體為gRNA-EL靶位點，陰影正體為gRNA-ER靶位點

圖5 亞克隆測序圖Fig 5 The sequencing profile of subclones

A：克隆CL-10；B：克隆CL-3；C：克隆CL-20；D：克隆CL-19。黃色填充為ezrin增強子gRNA靶位點兩側(cè)序列，實框為gRNA-EL靶位點，虛框為gRNA-ER靶位點

3 討論

對于基因增強子功能的研究通常采用報告基因的方法，將目標序列克隆至報告基因表達載體，根據(jù)報告基因的表達情況間接判斷增強子功能。我們以往采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)研究腫瘤相關(guān)基因ezrin的表達調(diào)控機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，位于基因啟動子上游的-1541/-706序列具有轉(zhuǎn)錄增強作用[11-12]，而-1297/-1186序列為增強子關(guān)鍵區(qū)[10,13]，很可能對Ezrin在腫瘤細胞中的高表達起重要作用。采用報告基因方法時，僅克隆目標序列對其進行分離檢測。實際上，細胞中增強子功能受其上下游序列影響，有可能會出現(xiàn)報告基因檢測結(jié)果與實際情況不一致的現(xiàn)象。

隨著近年來CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的發(fā)展完善，由sgRNA引導Cas9核酸內(nèi)切酶可以實現(xiàn)細胞中定向刪除目標序列[2,14]，使研究結(jié)果更為真實可靠。本研究構(gòu)建的CRISPR/Cas9載體pX459-sgRNA-EL和pX459-sgRNA-ER，分別識別ezrin增強子關(guān)鍵區(qū)的上游和下游序列，靶向敲除DNA序列范圍設(shè)計在增強子關(guān)鍵區(qū)的兩側(cè)。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染食管癌細胞后，可以在預定范圍敲除增強子關(guān)鍵區(qū)。后續(xù)工作將在本研究基礎(chǔ)上，篩選靶向敲除ezrin增強子關(guān)鍵區(qū)的細胞系，研究增強子對Ezrin蛋白的表達及腫瘤細胞生物學行為的影響。

[1]CHYLINSKI K, MAKAROVA K S, CHARPENTIER E, et al. Classification and evolution of type II CRISPR-Cas systems[J]. Nucleic Acids Res, 2014, 42(10): 6091-6105.

[2]SHALEM O, SANJANA N E, HARTENIAN E, et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells[J]. Science, 2014, 343(6166): 84-87.

[3]CAO J, WU L, ZHANG S M, et al. An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting[J]. Nucleic Acids Res, 2016, 44(19): e149.

[4]YE L, WANG J, TAN Y, et al. Genome editing using CRISPR-Cas9 to create the HPFH genotype in HSPCs: an approach for treating sickle cell disease and β-thalassemia[J]. PNAS, 2016, 113(38): 10661-10665.

[5]WALTON J, BLAGIH J, ENNIS D, et al. CRISPR/Cas9-mediated Trp53 and Brca2 knockout to generate improved murine models of ovarian high-grade serous carcinoma[J]. Cancer Res, 2016, 76(20): 6118-6129.

[6]XIE J J, XU L Y, WU Z Y, et al. Prognostic implication of ezrin expression in esophageal squamous cell carcinoma[J]. J Surg Oncol, 2011, 104(5): 538-543.

[7]ZHONG Z Q, SONG M M, HE Y, et al. Knockdown of ezrin by RNA interference reverses malignant behavior of human pancreatic cancer cells in vitro[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2012, 13(8): 3781-3789.

[8]陽 寧, 王 玲, 陳 仙, 等. 埃茲蛋白(ezrin)基因沉默抑制人前列腺癌PC-3細胞增殖和侵襲[J]. 細胞與分子免疫學雜志, 2016, 32(6): 821-824.

[9]HOSKIN V, SZETO A, GHAFFARI A, et al. Ezrin regulates focal adhesion and invadopodia dynamics by altering calpain activity to promote breast cancer cell invasion[J]. Mol Biol Cell, 2015, 26(19): 3464-3479.

[10]GAO S, DAI Y, YIN M, et al. Potential transcriptional regulatory regions exist upstream the human ezrin gene promoter in esophageal carcinoma cells[J]. Acta Biochim Biophys Sin, 2011, 43(6): 455-464.

[11]張青峰, 衛(wèi)金岐, 張芳婷, 等. 幾種腫瘤細胞中ezrin基因增強子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控特性的研究[J]. 中國細胞生物學學報, 2014, 36(5): 610-616.

[12]GAO S Y, LI E M, CUI L, et al. Sp1 and AP-1 regulate expression of the human gene VIL2 in esophageal carcinoma cells[J]. J Biol Chem, 2009, 284(12): 7995-8004.

[13]GAO S Y, DAI Y P, LONG X, et al. Identification of the VIL2 enhancer in human embryonic kidney cells[J]. Cell Biol Int, 2011, 35(10): 967-971.

[14]RAN F A, CONG L, YAN W X, et al. In vivo genome editing usingStaphylococcusaureusCas9[J]. Nature, 2015, 520(7546): 186-191.

ConstructionofCRISPR/Cas9vectorstargetingtoezrinenhancerkeyregion

GUO Xiao-long, ZHANG Qing-feng, YE Qing-song, MO Zhen-tao, LI Wen-na, GAO Shu-ying

(Department of Bioengineering, Zhuhai Campus of Zunyi Medical University, Zhuhai 519041, China)

The aim of this study is to construct CRISPR/Cas9 vectors, which targets the key region of human ezrin enhancer, and assays knockout function of the vectors. Two gRNAs, aiming at upstream and downstream of human ezrin enhancer key region respectively, were designed, synthesized and ligated into plasmid pX459 to construct pX459-sgRNA-EL and pX459-sgRNA-ER. Then, the correct CRISPR/Cas9 recombinant plasmids were co-transfected into human esophageal carcinoma EC109 cells. Genomic DNA was extracted for PCR amplification of a region flanking the CRISPR target sites and subclonal sequencing analysis. By restriction enzyme digestion and DNA sequencing assay, it was confirmed that CRISPR/Cas9 recombinant plasmids were constructed successfully. Deletion of the ezrin enhancer key region was found in co-transfection cells genomic DNA. Therefore, CRISPR/Cas9 vectors targeting human gene enhancer key region were constructed and could create fixed sequence knockout.

target knockout; ezrin enhancer; CRISPR/Cas9

2016-10-31；接受日期2016-11-10

國家自然科學基金(31360212)；貴州省科技廳聯(lián)合基金(LKZ[2013]04)；貴州省科學技術(shù)基金(黔科合J字[2014]2180號)

郭曉龍，專業(yè)方向為基因表達調(diào)控機制，E-mail: 1406049005@qq.com

高書穎，博士，教授，研究方向基因表達調(diào)控機制，E-mail：shuyinggao@163.com

10.3969/j.issn.2095-1736.2017.06.019

Q78

A

2095-1736(2017)06-0019-04