陳 偉，王朝暉

（廈門大學(xué)附屬福州市第二醫(yī)院骨科，福建福州350007）

骨質(zhì)疏松癥是臨床上最常見的一種老年性代謝疾病，常導(dǎo)致骨折等并發(fā)癥［1］。骨形成過程涉及兩個關(guān)鍵的步驟，即骨形成過程和骨吸收過程，兩者平衡一旦打破，將會引起一系列骨代謝相關(guān)疾?。?］。研究證實，在骨質(zhì)疏松癥患者體內(nèi)抗氧化酶的活性及含量明顯偏低，而活性氧的水平明顯偏高［3］。Wnt/β-catenin 信號通路是成骨細胞最關(guān)鍵的信號通路［4］，指導(dǎo)成骨細胞的分化和成熟以及各種成骨相關(guān)的重要蛋白分子的表達，是成骨調(diào)節(jié)的主要通路［5］。

Ning J 等［6］和白曉春等［7］通過雙氧水刺激骨髓間充質(zhì)干細胞驗證了活性氧過量及氧應(yīng)激能抑制骨髓源基質(zhì)細胞（BMSC）向成骨細胞分化，并降低成骨細胞關(guān)鍵蛋白人類成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX2）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）2、Ⅰ型膠原（COLⅠ）、堿性磷酸酶（ALP）的表達，降低成骨能力。Jun J H等［8］通過體外實驗驗證抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）能降低成骨細胞由于氧應(yīng)激引起的成骨功能低下，抵抗由活性氧簇（ROS）引起的成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（OSX）、骨鈣素（OC）、COLⅠ、RUNX2、BMP2、BMP4、BMP7、ALP的下降。但是還原型谷胱甘肽（GST）參與骨合成代謝的具體機制尚不十分清楚。本研究探討GST對未經(jīng)活性氧處理的成骨細胞的具體作用，為臨床上找到一種可靠的促進成骨細胞活性的藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

小鼠前成骨細胞MC3T3-E1購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細胞庫。GST（sigma公司，美國），用二甲基亞砜（DMSO）配制成濃度為 10 mmol/L的儲存液，工作液濃度為0.1%；DMEM培養(yǎng)液（Gibco公司，美國）；胎牛血清（FBS）（HyClone公司，美國）；胰蛋白酶（Sigma公司，美國）；堿性磷酸酶染色試劑盒（南京建成科技有限公司）；茜素紅粉末（Sigama公司，美國），配成0.1%Alizarin red S-Tris-Hcl（pH 8.3） 待用；PrimeScript RTreagent kit（TaKaRa，日本）；SYBR

PrimeScriptTMRT-PCR Kit II（TaKaRa，日本）；BCA蛋白定量試劑盒（碧云天，中國）；β-catenin鼠單抗（Abcam，美國）；GAPDH 兔多抗（Abcam，美國）；HRP標(biāo)記山羊抗兔 IgG（H+L）（碧云天，中國）；HRP標(biāo)記山羊抗鼠 IgG（H+L）（碧云天，中國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) MC3T3-E1細胞于α-MEM、10%FBS培養(yǎng)基，成骨誘導(dǎo)液含100 nmol/L地塞米松，0.05 mmol/L 維生素 C，10 mmol/L β-磷酸甘油鈉。于37℃，5%CO2，飽和濕度，無菌恒溫培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)基每3 d傳代1次。培養(yǎng)分為兩組：對照組（成骨誘導(dǎo)液）與GST組（GST+成骨誘導(dǎo)液）。孵育處理7 d、14 d和21 d后取材。

1.2.2 小鼠前成骨細胞MC3T3-E1的ALP染色培養(yǎng)MC3T3-E1 7 d后進行ALP染色。傳代時加入適量的細胞懸液，培養(yǎng)皿中放入無菌玻片，等待細胞爬滿玻片后取出。用PBS洗玻片，冷丙醇溶液固定10 min，蒸餾水反復(fù)沖洗丙醇。37℃ALP孵育液中孵育4～6 h，自來水沖洗后，于2%硝酸鈷中浸泡3～5 min，蒸餾水沖洗干凈。放置于1%的硫化銨中2 min，水洗后干燥，封片，于普通光學(xué)顯微鏡下拍照。

1.2.3 小鼠前成骨細胞MC3T3-E1的茜素紅染色 培養(yǎng)MC3T3-E1 7 d后進行茜素紅染色。傳代時加入適量的細胞懸液，培養(yǎng)皿中放入無菌玻片，等待細胞爬滿玻片后取出。用PBS洗玻片，冷丙醇溶液固定10 min，蒸餾水反復(fù)沖洗丙醇。取適量茜素紅染色液 0.1%Alizarin red S-Tris-Hcl（pH 8.3）覆蓋滿細胞，置于37℃培養(yǎng)箱孵育30 min。吸棄液體，PBS洗滌3次/3 min，晾干，拍照。

1.2.4 Real-time PCR基因引物由生工生物公司合成，結(jié)果見表1。細胞消化收集，酚氯仿法提取總RNA，驗證總RNA完整性，Nano-drop2000測定總RNA樣品純度和濃度。內(nèi)參基因GAPDH作為內(nèi)標(biāo)。

表1 基因引物

1.2.5 Western Blotting 采用RIPA提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒定量，10%SDS-PAGE電泳分離后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，各自分別按照1∶1 000的稀釋比例加入一抗，4℃孵育過夜。TBST洗滌5 min×6次后，山羊抗鼠二抗（1∶5 000）和山羊抗兔二抗（1∶10 000）室溫?fù)u晃孵育1 h，TBST洗滌5 min×6次。化學(xué)發(fā)光試劑盒（Thermo）A液和B液混合并覆蓋于PVDF膜上，于凝膠成像系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)，并進行后續(xù)灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS中文版22.0進行分析，滿足正態(tài)性分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多個樣本均數(shù)的比較采用One-way ANOVA進行檢驗，兩兩比較采用 Dunnett′st檢驗和SNKq檢驗進行檢驗；計數(shù)資料組間比較采用行×列的卡方檢驗。相關(guān)分析據(jù)數(shù)據(jù)類型，采用Spearman相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠前成骨細胞

MC3T3-E1的培養(yǎng)、ALP染色及鈣鹽沉積，見圖1。成骨細胞合成、分泌ALP，當(dāng)骨內(nèi)沉積增加磷酸鈣鹽時，ALP的合成分泌也隨之增加，因此ALP是成骨細胞開始向成熟骨細胞分化的重要標(biāo)志。當(dāng)成骨前體細胞進入細胞外的基質(zhì)礦化期，表明細胞已進入成熟分化的后期，成骨細胞可將合成的堿性磷酸酶和鈣鹽結(jié)晶體分泌至細胞外基質(zhì)中，與前期表達的膠原結(jié)合，這有助于提高細胞表面微環(huán)境的鈣鹽和磷的含量使基質(zhì)礦化。茜素紅染色液可將復(fù)合物染色（Ca2+與Alizarin Red鰲和呈桔紅色，所以鈣鹽沉積檢測是反映骨細胞成骨功能的另一個標(biāo)志）。顯微鏡下觀察，小鼠前成骨細胞MC3T3-E1為柱狀形、多邊形，位于細胞質(zhì)中部的細胞核較大，細胞生長活躍（圖1A）。細胞ALP染色陽性（圖1B），有鈣鹽沉積于細胞外基質(zhì)（圖1C），細胞成骨功能良好。

2.2 GST提高成骨相關(guān)基因的表達

RUNX2、OSX、COLⅠ、OCN 基因都是成骨分化的指標(biāo)，其表達水平能反映成骨細胞的分化程度。用 GST 干預(yù) MC3T3-E1 細胞 7、14、21 d 后，Realtime PCR檢測成骨相關(guān)因子RUNX2、OSX、COLⅠ、OCN基因的表達，結(jié)果顯示GST能使RUNX2、OSX、COLⅠ、OCN基因的表達顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見圖2。

2.3 GST促進Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)基因的表達

圖1 小鼠前成骨細胞MC3T3-E1的培養(yǎng)、ALP染色及鈣鹽沉積檢測

圖2 GST作用于MC3T3-E1對成骨相關(guān)基因的影響

圖3 GST作用于MC3T3-E1對WNT/β-catenin信號通路相關(guān)基因的影響

Wnt/β-catenin信號通路是成骨細胞最關(guān)鍵的信號通路之一，β-catenin、LRP5、GSK-3β 基因是Wnt/β-catenin信號通路中的相關(guān)基因。在GST干預(yù) MC3T3-E1細胞7 d、14 d、21 d后用Realtime PCR檢測Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)基因（β-catenin、LRP5、GSK-3β）mRNA 表達，結(jié)果顯示 GST 能顯著提高 β-catenin、LRP5、GSK-3β基因的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見圖3。

2.4 GST 能激活 MC3T3-E1

細胞的Wnt/β-catenin信號通路 qPCR結(jié)果顯示GST能促進MC3T3-E1的Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)基因 β-catenin、LRP5、GSK-3β 的表達，且呈時間依賴性，對照組在不同時間培養(yǎng)階段則無明顯差異。因此，選取對照組細胞培養(yǎng)21 d，用GST 干預(yù) MC3T3-E1 細胞 7 d、14 d、21 d，βcatenin蛋白的表達在 7 d、14 d、21 d后明顯高于對照組，且呈現(xiàn)連續(xù)上升的趨勢。結(jié)果見圖4。

圖4 GST干預(yù) MC3T3-E1細胞7 d、14 d和21 d后β-catenin蛋白的表達改變

3 討論

谷胱甘肽是人體重要的抗氧化因子，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成，含有巰基（-SH），廣泛分布于機體各器官內(nèi)，對于維持細胞生物功能有重要作用［4］。還原型谷胱甘肽（GST）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）構(gòu)成人體最重要的抗氧化系統(tǒng)，GST作用于活性氧等氧化物質(zhì)進而變成GSSG，減輕活性氧對細胞的毒害作用，GSSG經(jīng)過還原作用又變成GST，如此周而復(fù)始，維持著細胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)。由此我們探究外源性補充GST而不加入活性氧的刺激對小鼠遺傳背景的MC3T3-E1成骨細胞株是否依然有促進作用。

MC3T3-E1細胞系來源于小鼠顱蓋骨細胞，是經(jīng)典細胞模型，廣泛用于成骨過程的體外實驗研究。成骨細胞在骨形成過程中發(fā)揮著重要的作用，是成骨的主要細胞，負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的生成、分泌以及礦化。RUNX2是RUNT相關(guān)基因家族成員之一，在成骨細胞分化、軟骨細胞成熟及骨基質(zhì)蛋白的產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用，對預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松意義重大［5］。OSX是在骨組織的發(fā)育中表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，是在RUNX2因子后又一被發(fā)現(xiàn)的成骨細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它調(diào)控著許多重要的成骨基因［9］。COLⅠ基因是成骨分化的早期標(biāo)志物，OCN基因是成骨晚期標(biāo)志物，對成骨細胞的成熟有重要調(diào)節(jié)作用。因此我們主要檢測RUNX2、OSX、COLⅠ、OCN 這 4個主要的成骨標(biāo)志物基因的表達情況。在GST干預(yù)MC3T3-E1細胞 7 d、14 d 和 21 d 后，RUNX2、OSX、COLⅠ、OCN 4個基因在各個時間點都有不同程度的提高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明 GST有明顯促進MC3T3-E1向成骨細胞分化的作用。

近年來在骨代謝方面，以研究經(jīng)典 Wnt/βcatenin信號通路對成骨細胞的影響為熱點，經(jīng)典Wnt信號對于成骨分化及骨生成有非常重要的作用。目前研究表明，調(diào)節(jié)任何一個經(jīng)典Wnt/βcatenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的因子都能影響成骨細胞的分化增殖［10］。因此，本實驗我們檢測Wnt/βcatenin信號通路相關(guān)基因β-catenin、LRP5、GSK-3β mRNA表達。β-catenin是Wnt信號通路最關(guān)鍵的因子，我們也檢測β-catenin蛋白的表達作為驗證。本研究從Wnt信號通路中經(jīng)典通路Wnt/β-catenin的角度探討其可能的作用機制，探討GST對MC3T3-E1細胞的作用機制。在GST干預(yù)7 d、14 d 和 21 d 后，Wnt/β-catenin 信號通路相關(guān)基因 β-catenin、LRP5、GSK-3β mRNA 的表達明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。GST 不僅影響成骨相關(guān)基因的表達，同時也促進Wnt/β-catenin信號通路中關(guān)鍵蛋白β-catenin的表達，結(jié)果表明Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能參與GST對MC3T3-E1細胞向成骨細胞方向分化的調(diào)控。

本研究以成骨細胞體外培養(yǎng)為模型，在未加活性氧處理情況下探討單純GST對成骨誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)的MC3T3-E1細胞是否有促進成骨作用，探究在未加活性氧處理的MC3T3-E1細胞中，GST能否激活Wnt/β-catenin通路。觀察GST對成骨細胞的影響，有助于我們進一步擴大抗氧化物對骨形成以及相關(guān)生物學(xué)作用機制的了解，為進一步深入研究骨生理過程中的抗氧化物調(diào)節(jié)分子轉(zhuǎn)導(dǎo)機制奠定堅實基礎(chǔ)，同時也可為其在骨折以及骨代謝疾病中的臨床應(yīng)用提供新的思路和實驗依據(jù)。