蒲占湑, 鹿連明, 黃振東, 胡秀榮, 杜丹超, 陳國慶

(浙江省柑橘研究所，浙江 臺州 318020)

浙江省柑橘膠孢炭疽菌遺傳多樣性的ISSR分析

蒲占湑, 鹿連明, 黃振東, 胡秀榮, 杜丹超, 陳國慶

(浙江省柑橘研究所，浙江 臺州 318020)

為了解柑橘炭疽病菌的種內(nèi)遺傳多樣性，從32條ISSR引物中篩選出多態(tài)性好、條帶清晰的5條引物，對28株炭疽病菌株進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增.結(jié)果顯示：5條引物共擴(kuò)增出43個條帶，多態(tài)性條帶41個，多態(tài)性比例為95.34%，說明柑橘炭疽病菌種內(nèi)遺傳多樣性豐富.利用NTSYS軟件分析并構(gòu)建UPGMA聚類圖，當(dāng)相似系數(shù)為0.73時(shí)，28株菌可以分為5個類群，不同菌株間遺傳變異較大，遺傳變異與地域來源無顯著的相關(guān)性.

膠孢炭疽菌; 遺傳多樣性; 簡單重復(fù)序列區(qū)間

柑橘炭疽病是柑橘生產(chǎn)中普遍發(fā)生的具有潛伏侵染特性的真菌性病害，分布在熱帶、亞熱帶柑橘產(chǎn)區(qū)，如中國、美國、巴西、日本和阿根廷等國.膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)是引起我國柑橘炭疽病的主要病原之一，不僅危害柑橘生長期的葉片、枝梢、果柄和果實(shí)，還可以引起貯運(yùn)期果實(shí)腐爛[1-2].柑橘炭疽病在我國柑橘產(chǎn)區(qū)發(fā)生不同程度的危害，其中，廣東、湖南、重慶、陜南和浙江等地近年來發(fā)病嚴(yán)重，一些地方品種的發(fā)病率達(dá)20%～60%[3-4].

ISSR(inter-simple sequence repeats，簡單重復(fù)序列中間區(qū)域)標(biāo)記技術(shù)是由Zietkiewicz et al[5]根據(jù)SSR(simple sequence repeats,簡單重復(fù)序列)的特點(diǎn)創(chuàng)建的一種新型的微衛(wèi)星類分子標(biāo)記技術(shù)，目前廣泛應(yīng)用于許多病原微生物的遺傳多樣性分析、基因定位、進(jìn)化及分子生態(tài)學(xué)的研究[6-8].國內(nèi)外主要通過肌動蛋白、β-微管蛋白、鈣調(diào)蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、谷氨酸合成酶等基因序列分析技術(shù)進(jìn)行柑橘炭疽病菌的遺傳多樣性分析與菌株鑒定[1,9-10].目前，我國尚未見采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)研究柑橘炭疽病菌遺傳多樣性的報(bào)道.本研究采用該技術(shù)對浙江省不同來源的炭疽病菌株的遺傳多樣性進(jìn)行分析，以期為該病原菌的鑒定和田間防治提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試菌株

選擇浙江省臺州、衢州、麗水、嘉興和韓國濟(jì)州島等柑橘產(chǎn)區(qū)具有柑橘炭疽病癥狀的葉片和果實(shí)進(jìn)行分離，獲得炭疽病菌株28株，經(jīng)形態(tài)學(xué)和特異性引物的分子生物學(xué)方法鑒定為膠孢炭疽菌.具體菌株信息見表1.

表1 供試炭疽病菌株Table 1 Strains of C.gloeosporioides examined

1.2 模板DNA的提取

將膠孢炭疽菌接種在PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)7 d后，用無菌牙簽刮取菌絲體(約200 mg，帶有少量培養(yǎng)基不影響DNA提取)放于高壓滅菌后的研缽中，加入少量PVP(0.1 g組織可加0.02 g PVP)，用液氮研磨成粉末狀.采用改良的CTAB法，提取炭疽菌絲的DNA，提取的DNA經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用紫外分光光度計(jì)檢測其濃度和純度(λ=260 nm)，稀釋至50 ng·μL-1后貯存于-20 ℃冰箱中備用.

1.3 ISSR引物篩選及PCR擴(kuò)增

選擇加拿大不列顛哥倫比亞大學(xué)(University of British Columbia, Biotechnology Lab)已公布的32條ISSR引物(表2)對LC-02和JJ-4菌株進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，最終篩選出穩(wěn)定性好、條帶清晰的ISSR引物，用于28株炭疽病菌的遺傳多樣性分析.

25 μL PCR反應(yīng)體系:模板為20 ng，Mg2+濃度為2.0 mmol·L-1，引物濃度為0.4 μmol·L-1，dNTPs濃度為0.2 mmol·L-1，TaqDNA酶量為1 U，2.5 μL 10×Buffer，其余用去離子水補(bǔ)充.

反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃ 30 s，各引物最適退火溫度下1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min.反應(yīng)結(jié)束后取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,在凝膠成像系統(tǒng)上拍攝保存.

表2 篩選所用的32條ISSR引物Table 2 Primers of ISSR molecular markers

1.4 電泳譜帶的記錄及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

對電泳條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì),在同一位置有清晰條帶的記為1,沒有條帶的記為0,統(tǒng)計(jì)為(0,1)-矩陣.利用NTSYS_pc(Rohlf 2000)數(shù)據(jù)處理軟件測定遺傳相似性系數(shù),并構(gòu)建UPGMA聚類樹狀圖，分析遺傳多樣性與菌株地理來源的相關(guān)性.

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選及ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測

在32條ISSR引物中，篩選出5條穩(wěn)定性好、條帶清晰的引物(表3).應(yīng)用這5條ISSR引物對28株炭疽病菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可獲得清晰的條帶(圖1A、B)，共擴(kuò)增出43個條帶，大小為250～2 000 bp.其中，多態(tài)性條帶41個，多態(tài)性比例平均為95.34%(表3)，說明浙江省柑橘炭疽病菌具有豐富的遺傳多樣性.

表3 5條引物對膠孢炭疽菌的ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果Table 3 ISSR-PCR amplification of C.gloeosporioides with 5 primers

2.2 基于ISSR-PCR反應(yīng)的柑橘炭疽病菌的遺傳多樣性分析

應(yīng)用NTSYS (Rohlf 2000)數(shù)據(jù)處理軟件對ISSR-PCR反應(yīng)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并構(gòu)建UPGMA聚類樹狀圖(圖2).在相似系數(shù)為0.73時(shí)，28株炭疽病菌可以分為5個群.類群Ⅰ由3個菌株組成，分別分離自韓國的2個菌株和衢州的1個菌株，占供試菌株總數(shù)的10.71%；類群Ⅱ包括衢州和臨海的9個菌株，占32.14%；類群Ⅲ包括仙居、黃巖、椒江、衢州、麗水的13個菌株，占46.43%；類群Ⅳ僅為1個菌株；類群Ⅴ包括2個嘉興的菌株.進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，不同來源的菌株在聚類圖中既有交叉也有聚類，說明柑橘炭疽病菌基于ISSR的多態(tài)性與菌株的地理來源沒有顯著的相關(guān)性.

M.DNA Marker DL2000；1～28.菌株編號(見表1).圖1 引物866(A)和851(B)對28株炭疽病菌的ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 ISSR-PCR amplification of 28 isolates of C.gloeosporioides with primer 866 (A) and primer 851 (B)

圖2 28株柑橘炭疽病菌基于ISSR的UPGMA聚類分析結(jié)果Fig.2 UPGMA cluster analysis of 28 C.gloeosporioides isolates based on ISSR data

3 討論

本研究采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析了28株浙江省柑橘炭疽病菌的遺傳多樣性，結(jié)果表明，浙江省柑橘炭疽病菌種內(nèi)具有豐富的遺傳多樣性，不同地理來源的菌株可分為5個類群，不同菌株間變異和分化程度較大，且與地理來源無顯著的相關(guān)性.這可能是由于柑橘炭疽病具有潛伏侵染的特性，且健康的柑橘組織普遍帶菌，可通過苗木、果實(shí)和接穗進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播.本試驗(yàn)結(jié)果與陳國慶[11]和徐紅梅等[12]的研究結(jié)果相似.

地理來源、寄主種類等的差異是導(dǎo)致病原菌遺傳多樣性分化的重要因素.本研究結(jié)果顯示，不同寄主種類與病原菌內(nèi)在遺傳多樣性沒有明顯的相關(guān)性.然而，由于本試驗(yàn)的寄主種類較少，且大多數(shù)來自浙江省，寄主種植的自然環(huán)境和氣候條件差異較小，研究結(jié)果可能不夠全面.因此，有關(guān)寄主種類與病菌遺傳多樣性的相關(guān)性還需進(jìn)一步研究.

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GeneticdiversityofColletotrichumgloeosporioidesfromZhejiangbyISSRmolecularmarkers

PU Zhanxu, LU Lianming, HUANG Zhendong, HU Xiurong, DU Danchao, CHEN Guoqing

(Citrus Research Institute of Zhejiang Province, Taizhou, Zhejiang 318020, China)

In order to understand the genetic diversity ofColletotrichumgloeosporioides, the primary pathogen for citrus anthracnose in tropical and subtropical China, 5 inter-simple sequence repeat (ISSR) primers, which were clearly amplified and highly polymorphic, were screened from 32 primers. Then the 5 primers were used to study the genetic diversity of 28 isolates. The result showed that 43 loci were amplified, which generated 41 polymorphic loci. The percentage of polymorphic loci was 95.34%, indicating an abundant genetic diversity. Referring to UPGMA dendrogram built by NTSYS software, 28 isolates were clustered into 5 clusters when the genetic similar coefficient was 0.73, indicating that the genetic differentiation of isolates was great, and it was not significantly correlated with geographical origin.

Colletotrichumgloeosporioides; genetic diversity; inter-simple sequence repeat

2017-03-08

2017-04-24

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)柑橘產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS);浙江省臺州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(14ny11).

蒲占湑(1982-)，男，助理研究員，碩士.研究方向：植物保護(hù).Email：puzhanxu@139.com.通訊作者黃振東(1969-)，男，副研究員.研究方向：植物保護(hù).Email：hyhzd121505@126.com.

S436.66

A

1671-5470(2017)06-0607-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.06.002

(責(zé)任編輯:楊郁霞)