尹 躍, 安 巍, 趙建華, 王亞軍, 何 軍, 戴國禮, 曹有龍

(寧夏農(nóng)林科學(xué)院國家枸杞工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750002)

枸杞種質(zhì)資源遺傳多樣性的iPBS分析

尹 躍, 安 巍, 趙建華, 王亞軍, 何 軍, 戴國禮, 曹有龍

(寧夏農(nóng)林科學(xué)院國家枸杞工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750002)

采用引物結(jié)合位點擴增(iPBS)分子標記技術(shù)對34份枸杞種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析.從83條iPBS引物中篩選出11條引物分別對34份枸杞種質(zhì)基因組DNA進行擴增，共檢測到91條清晰譜帶，其中，多態(tài)性條帶89條，多態(tài)性比率為97.8%，平均多態(tài)信息含量為0.46.采用POPGENE軟件計算34份種質(zhì)的平均有效等位基因數(shù)為1.570，平均Nei′s基因多樣性指數(shù)為0.327，平均Shannon信息指數(shù)為0.489，表明34份種質(zhì)具有豐富的遺傳多樣性.采用NTSYS-pc軟件計算得到34份種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)為0.56～0.93，非加權(quán)組平均法(UPGMA)聚類分析結(jié)果表明，遺傳相似系數(shù)為0.65時，可將34份種質(zhì)分成5大類群，反映出栽培品種與野生種質(zhì)遺傳差異大，親緣關(guān)系較遠.iPBS分子標記可有效用于枸杞種質(zhì)資源遺傳多樣性分析.

枸杞; iPBS分子標記; 遺傳多樣性

枸杞(LyciumbararumL.)為茄科枸杞屬多年生落葉灌木植物，全球約有80種，呈離散性分布，主要分布在南美洲南部、北美洲南部、非洲南部和歐亞大陸[1].我國有枸杞屬的7個種和3個變種，其中，寧夏枸杞主要分布在我國西部，中國枸杞分布在我國東部地區(qū).我國枸杞栽培歷史悠久，種植面積、產(chǎn)量和出口量均位居世界首位[2].通過人工選育及在不同生態(tài)環(huán)境條件下，已形成了豐富的品種、品系及野生種質(zhì)等類型資源[3]，為有效利用這些資源開展枸杞種質(zhì)資源遺傳多樣性研究是枸杞新品種選育的基礎(chǔ).

DNA分子標記技術(shù)是當前植物資源遺傳多樣性評價的強有力工具，尤其是基于PCR基礎(chǔ)的分子標記已廣泛應(yīng)用在植物遺傳多樣性分析[4].近年來，采用RAPD、AFLP、ISSR、SSR和SCoT等標記技術(shù)[5-11]開展枸杞種質(zhì)資源遺傳多樣性評價，為枸杞種質(zhì)資源利用及保存提供技術(shù)支撐.

隨著高通量測序和生物信息學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，基于植物反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子開發(fā)的分子標記比常規(guī)分子標記更具有優(yōu)勢[12]，并已成功應(yīng)用于基因作圖、生物多樣性與系統(tǒng)進化和品種鑒定等研究領(lǐng)域[13].基于PCR基礎(chǔ)的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子分子標記類型有引物結(jié)合位點擴增( inter-primer binding site， iPBS)、SSAP、REMAP和RBIP[14].其中，iPBS是以長末端重復(fù)序列(long terminal repeats, LTRs)類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子保守位點設(shè)計引物進行擴增的一種新型分子標記技術(shù)，針對LTR類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子中2個PBS(引物結(jié)合位點)區(qū)間進行擴增[15].該方法簡單、有效及不用預(yù)先獲知LTR序列.同時，與傳統(tǒng)分子標記技術(shù)(RAPD、ISSR和AFLP)相比，iPBS分子標記的品種鑒別能力更強[16].目前，iPBS分子標記已廣泛應(yīng)用于葡萄、牡丹、海棗、豌豆和楊梅等植物的品種鑒定、遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性分析[17-22]，而對枸杞的相關(guān)研究尚未見報道.

本試驗采用iPBS分子標記對34份枸杞種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，在分子水平上確定這些種質(zhì)間的親緣關(guān)系，旨在為枸杞育種中的親本選配和利用提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

34份枸杞種質(zhì)資源分別為來自寧夏、新疆、河北、四川、青海和云南等8個省(自治區(qū))的栽培品種、地方品種及野生種(表1),均保存于國家枸杞工程技術(shù)研究中心枸杞種質(zhì)資源圃(38°38′49″N，106°9′10″E).

表1 34份枸杞種質(zhì)的類型及來源Table 1 Basic information of wolfberry materials used for analysis

2016年4月選取幼嫩的健康葉片置于液氮中帶回實驗室，保存于-80 ℃冰箱中，用于基因組DNA的提取.

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用基因組DNA試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取幼嫩葉片基因組DNA, BioPhotometer plus型核酸蛋白檢測儀(德國艾本德公司)檢測DNA的濃度和純度，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量，并將母液稀釋至50 ng·μL-1用于后續(xù)的PCR擴增試驗.

1.2.2 iPBS-PCR分析 iPBS引物序列來源于文獻[15]，由上海捷瑞生物工程有限公司合成.PCR擴增在PTC-200型PCR儀(美國伯樂生物公司)上進行，擴增體系和程序參考文獻[15]，并略有修改.擴增體系25 μL：12.5 μL 2×Taq Plus Master Mix、1.5 μL模板DNA、1.5 μL 10 μmol·L-1引物，剩余用ddH2O補足至25 μL .擴增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 10 s，50～60 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，32個循環(huán)；72 ℃ 5 min，16 ℃保存.

擴增結(jié)束后，取6 μL擴增產(chǎn)物加1.5 μL DNA上樣緩沖液并離心混勻，經(jīng)1.6%瓊脂糖凝膠電泳檢測(電泳緩沖液為1×TAE)，EB染色后用Alpa Innotech型凝膠成像儀(美國Alpa Innotech公司)獲取，并進行分析.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

根據(jù)對應(yīng)的iPBS擴增條帶的有無記錄條帶，有擴增條帶的記為1，無擴增條帶的記為0，形成(0，1)二元數(shù)據(jù)矩陣.只統(tǒng)計擴增條帶清晰、多態(tài)性高的引物.多態(tài)性比率/%=多態(tài)性條帶數(shù)/總條帶數(shù)×100.由于iPBS標記為顯性標記，多態(tài)信息含量(PIC)按照以下公式計算[23].PICb=1-(p2+q2)，式中，p為iPBS引物第b個帶出現(xiàn)(1)的頻率，q為iPBS引物第b個帶出現(xiàn)(0)的頻率.顯性標記的PIC最大，為0.5，當p=q=0.5.

采用POPGENE軟件計算觀察等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei′s基因多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)[24].采用NTSYS-pc 2.1軟件的SIMQUAL模塊計算遺傳相似系數(shù)，采用SHAN模塊非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means, UPGMA)進行聚類分析[25].

2 結(jié)果與分析

2.1 83條iPBS引物的篩選結(jié)果

表2 遺傳多樣性分析的iPBS引物序列Table 2 Inter-primer biding primer sequences for genetic relationship analysis

表3 11條iPBS引物多態(tài)性擴增結(jié)果Table 3 The polymorphic amplification of 11 iPBS primers

應(yīng)用合成的83條iPBS引物對表型性狀差異較大和親緣關(guān)系較遠的寧杞1號、中國枸杞、寧杞菜1號和云南枸杞等4份種質(zhì)進行iPBS-PCR擴增，篩選出具有多態(tài)性好、擴增條帶清晰的引物11條(表2)，用于34份枸杞種質(zhì)遺傳多樣性分析.

2.2 11條iPBS引物的多態(tài)性

從表3可見，11條iPBS引物在34份枸杞種質(zhì)中共擴增出91個條帶.其中，89條為多態(tài)性條帶；每條引物可擴增出條帶數(shù)4～12個，平均8.27個；每條引物可擴增出多態(tài)性條帶數(shù)3～12個，平均8.09個；每條引物多態(tài)性比率為75%～100%，平均97.8%；多態(tài)信息含量為0.38～0.50，平均0.46.引物2217和2218對34份種質(zhì)擴增的瓊脂糖凝膠電泳圖譜分別見圖1和2.

2.3 iPBS的遺傳多樣性

采用POPGENE軟件計算，34份枸杞種質(zhì)的平均觀察等位基因數(shù)為1.989，平均有效等位基因數(shù)為1.570，平均Nei′s基因多樣性指數(shù)為0.327，平均Shannon信息指數(shù)為0.489.各位點遺傳多樣性程度也存在較大差別，有效等位基因最大值為1.998，最小值為1.000；Nei′s基因多樣性指數(shù)最大值為0.499，最小值為0.029；Shannon信息指數(shù)最大值為0.689，最小值為0.077.表明34份種質(zhì)間存在豐富的遺傳多樣性.

2.4 iPBS的聚類分析

采用NTSYS-pc 2.1軟件計算34份枸杞種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)，采用UPGMA構(gòu)建聚類樹.從圖3可見：34份種質(zhì)基因型的遺傳相似系數(shù)為0.56～0.93；當遺傳相似系數(shù)為0.65時可將34份種質(zhì)劃分為5大類群.

第Ⅰ大類群包括寧杞1號、小麻葉、大麻葉和寧杞3號等24份種質(zhì)，其中，寧杞1號、小麻葉和大麻葉等17份種質(zhì)為栽培品種，均為寧夏枸杞屬，親緣關(guān)系較近，這與系圃來源相關(guān).而寧夏黃果、YN-01、中國枸杞、CJ-01、HG-05、W-11-15、W-12-27和HGB等8份種質(zhì)為野生資源，與栽培品種聚類在一起，說明它們與栽培品種間的基因交流比較頻繁.

M：DL2000 DNA Marker；1～34為種質(zhì)編號(與表1的編號對應(yīng)).圖1 引物2217的PCR擴增結(jié)果Fig.1 Electropherogram of PCR amplified 2217 iPBS primer

M：DL2000 DNA Marker ；1～34為種質(zhì)編號(與表1的編號對應(yīng)).圖2 引物2218的PCR擴增結(jié)果Fig.2 Electropherogram of PCR amplified 2218 iPBS primer

第Ⅱ大類群包括天精3號、云南枸杞、SC-01、北方枸杞、HG-02、蔓生枸杞和HB-09等7份種質(zhì)，這7份種質(zhì)均為野生資源，均表現(xiàn)出枝條匍匐性強、葉片大、葉色深綠色等形態(tài)特征.

第Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ大類群僅有1份種質(zhì)，分別為HG-01、HG-03和AN-01，這3份種質(zhì)也均為引進的野生資源，與其他種質(zhì)的葉片、果實等表型性狀差異較大.

3 討論

iPBS是一類基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基礎(chǔ)的新型分子標記技術(shù)，其實驗操作過程簡單，擴增結(jié)果重復(fù)性好，且多態(tài)性高.本試驗從83條iPBS引物中篩選出11條擴增條帶清晰、多態(tài)性高的iPBS引物，對34份枸杞種質(zhì)進行擴增，共檢測到91個條帶，其中，89個為多態(tài)性條帶，平均多態(tài)性比率為97.8%，均高于ISSR標記(7個ISSR引物對115個樣品擴增，多態(tài)性比率為78.1%)[7]和SRAP標記(12對SRAP引物對30份種質(zhì)擴增，多態(tài)性比率為84.61%)[26].本試驗結(jié)果進一步說明，iPBS標記是一種基于PCR基礎(chǔ)上的簡單高效、擴增多態(tài)性較高的分子標記.盡管采用1個iPBS標記不能將34份枸杞種質(zhì)區(qū)分開來，這可能與供試種質(zhì)系譜來源有關(guān).本試驗所選用的品種都是通過群體選優(yōu)，如寧杞1號和寧杞2號均為從大麻葉群體中選育出的優(yōu)良品種；而采用多對引物組合可將所有材料區(qū)分開，如引物2217、2218、2245和2252.因此，iPBS標記可以有效地揭示枸杞種質(zhì)資源的遺傳多樣性.

圖3 基于11個iPBS引物的34份枸杞種質(zhì)UPGMA聚類圖Fig.3 UPGMA dendrogram of 34 materials based on 11 iPBS primers

iPBS聚類分析表明：遺傳相似系數(shù)為0.65時，可將34份枸杞種質(zhì)分為5大類群.第Ⅰ大類群主要為栽培品種，包括寧夏黃果、中國枸杞、W-11-15、W-12-27、HGB、CJ-01、YN-01和HG-05等8份野生種質(zhì)，這8份種質(zhì)與栽培品種的親緣關(guān)系較近，這些種質(zhì)的表型性狀、生長習性和結(jié)果習性相似.YN-01是從云南引進的野生種質(zhì)，寧杞菜1號是野生枸杞與寧夏枸杞雜交選育的新品種[27]，均表現(xiàn)為葉片肥大、枝條生長力強等特點.HGB、寧夏黃果、W-11-15和W-12-27的果色均為黃色，果形近圓形.CJ-01、HG-05和中國枸杞的果形為圓形，結(jié)果習性相似[3].聚類分析結(jié)果一方面反映出栽培品種與野生種質(zhì)的遺傳差異較大，親緣關(guān)系較遠，栽培品種間的遺傳差異較小，親緣關(guān)系較近；另一方面說明栽培品種與部分野生種質(zhì)可能存在基因交流現(xiàn)象，這與SSR標記的聚類結(jié)果[28]相一致.同時，枸杞屬于常異花授粉植物，基因型高度雜合，主要采用單株選優(yōu)、無性擴繁(嫩枝和硬質(zhì)扦插)方式繁育，經(jīng)過長期積累使得栽培品種的遺傳背景復(fù)雜，遺傳基礎(chǔ)比較狹窄.因此，建議在今后的新種質(zhì)創(chuàng)制中應(yīng)加大雜交選育力度，豐富枸杞種質(zhì)的基因型，保護我國枸杞種質(zhì)資源的遺傳多樣性.

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GeneticdiversityanalysisofwolfberrygermplasmusingiPBSmakers

YIN Yue, AN Wei, ZHAO Jianhua, WANG Yajun, HE Jun, DAI Guoli, CAO Youlong

(Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences, National Wolfberry Engineering Research Center, Yinchuan, Ningxia 750002, China)

The genetic diversity among 34 wolfberry germplasm resources were analyzed using an inter-primer binding site (iPBS) molecular marker. Eleven primers were screened from 83 iPBS primers to amplify the genomic DNA of the tested materials. A total of 91 scorable bands were detected, of which 89 bands were polymorphic (97.8%). The average value of polymorphic information content was 0.46. By POPGENE software, average value of effective number of alleles, Nei′s gene diversity and Shannon′s information index was 1.570, 0.327 and 0.489, respectively, indicating that a high level of genetic diversity among 34 wolfberry germplasm. The similarity coefficient among 34 germplasm ranged from 0.56 to 0.93 by NTSYS-pc software. Based on unweighted pair group method with arithmetic means(UPGMA) cluster analysis, 34 tested germplasm could be divided into 5 groups when genetic similarity was 0.65. In conclusion, the genetic relationship of cultivars tested were not close to wild germplasm resources. The iPBS molecular markers can be effectively used for genetic diversity analysis of wolfberry germplasm resources and provide theoretical and technical support for scientific management and utilization of wolfberry germplasm resources.

wolfberry; iPBS molecular markers; genetic diversity

2017-05-02

2017-06-11

國家林木種質(zhì)資源平臺建設(shè)項目(2005DKA21003)；寧夏農(nóng)業(yè)特色優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)新品種選育專項(2013NYYZ0101).

尹躍(1985-)，男，研究實習員，碩士.研究方向：枸杞分子標記輔助育種.Email:yueyin0112@aliyun.com.通訊作者曹有龍(1963-)，男，研究員，碩士生導(dǎo)師.研究方向：枸杞生物技術(shù)、育種.Email:youlongchk@163.com.

S567.1+9

A

1671-5470(2017)06-0612-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.06.003

(責任編輯:施曉棠)