任育軍, 楊樹偉, 吳棟雄, 黃晨星, 管亦榮, 繆 穎

(福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子細(xì)胞和系統(tǒng)生物學(xué)中心，福建 福州 350002)

毛竹葉片衰老特性及衰老相關(guān)基因的篩選和鑒定

任育軍, 楊樹偉, 吳棟雄, 黃晨星, 管亦榮, 繆 穎

(福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子細(xì)胞和系統(tǒng)生物學(xué)中心，福建 福州 350002)

收集野外定植3年的毛竹稈上具有明顯衰老漸進(jìn)特征的葉片簇，測量這些葉片的光合代謝效率(Fv/Fm)及葉綠素含量，建立毛竹不同衰老階段葉片形態(tài)與其光合效率之間的關(guān)系.在此基礎(chǔ)上，通過生物信息學(xué)方法(BLASTn)篩選出113個毛竹基因組中與水稻葉片衰老調(diào)控相關(guān)的同源基因，并檢測這些基因在毛竹葉片發(fā)育和衰老過程中的表達(dá)趨勢，鑒定一些與毛竹葉片衰老相關(guān)的標(biāo)志基因.結(jié)果顯示，毛竹葉片在衰老過程中其葉片的光合效率和葉綠素含量均出現(xiàn)顯著下降；在篩選的113個基因中有86個基因在葉片中表達(dá)，其中32個基因在葉片衰老過程中沒有變化，41個基因隨著葉片衰老出現(xiàn)顯著下調(diào)，13個基因出現(xiàn)明顯上調(diào).這些表達(dá)變化的基因與水稻中鑒定的同源基因在旗葉衰老過程中的表達(dá)模式基本一致，因此這些基因很可能在毛竹葉片衰老過程中也發(fā)揮同樣的功能.

毛竹; 葉片衰老; 葉綠素; 光合作用效率; 衰老相關(guān)基因; 同源分析; 基因表達(dá)

毛竹是禾本目禾本科剛竹屬單軸散生型常綠喬木狀竹類植物,其資源豐富、生長快、成林早、產(chǎn)量高和材質(zhì)優(yōu)，被廣泛應(yīng)用于食品、藥品、建筑材料、制作工藝品以及日常生活用品等，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)和社會效益，是我國最重要的經(jīng)濟(jì)竹類.同時，毛竹也是世界上分布最廣，森林覆蓋率最高的竹種，因其具有強(qiáng)大的地下根系和高大的冠層[1,2]，在調(diào)節(jié)氣候、涵養(yǎng)水源、防風(fēng)固沙和維持生態(tài)平衡等方面都發(fā)揮著重要功能，具有極強(qiáng)的生態(tài)效益[3-6].鑒于以上優(yōu)點(diǎn)，毛竹在世界范圍內(nèi)都受到重視.但因毛竹開花和衰老的特異性，一生只開一次花，開花周期長，花期難以預(yù)測，并且隨著開花和結(jié)實(shí)，毛竹迅速進(jìn)入衰老和死亡.竹林的大面積開花將導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失和生態(tài)環(huán)境破壞，因此開展毛竹開花和花后衰老機(jī)制的研究將為控制毛竹開花時間、延長毛竹營養(yǎng)生長期和培育毛竹抗衰新品種提供依據(jù).

由于受毛竹開花特性及試材獲取等方面的限制，目前關(guān)于毛竹開花及花后衰老生理和分子機(jī)制方面的研究都非常少，嚴(yán)重制約著竹類衰老生物學(xué)的發(fā)展.葉片是植物進(jìn)行光合作用合成各種生長所需有機(jī)化合物的重要場所，也是衰老最敏感的器官之一[7-9]，其衰老機(jī)制在其它器官和組織的衰老調(diào)控中存在一定的共性[10-12].毛竹雖為多年生常綠植物，但其葉片有著明顯的老幼更替過程，葉片的更迭具有典型的衰老漸進(jìn)特征，因此解析毛竹葉片的衰老可能是揭示毛竹花后衰老分子機(jī)制的突破口.目前已經(jīng)有一些生理學(xué)的試驗(yàn)檢測了毛竹葉片衰老過程中的葉重、葉面積及元素內(nèi)吸收率的動態(tài)[13]，同時也監(jiān)測了碳氮元素及灰分含量的變化[14]，發(fā)現(xiàn)隨著毛竹葉的衰老，葉重和葉面積等都會有一定比例的降低，灰分含量有所增加，氮和鉀元素從衰老葉向其它部位轉(zhuǎn)移，鈣在衰老葉中聚集，而碳的含量則保持相對穩(wěn)定[13,14]，但其中涉及的分子機(jī)制尚未提及.本試驗(yàn)利用野外定植生長的毛竹葉作為材料，測量葉片衰老過程中的光合代謝效率和葉綠素含量變化，同時通過生物信息學(xué)方法篩選一些在毛竹葉片中可能存在的衰老相關(guān)基因，檢測這些基因在葉片衰老過程中的表達(dá)趨勢，從而初步鑒定一些與毛竹葉片衰老相關(guān)的調(diào)控基因，為后期進(jìn)行竹類植物開花及花后衰老分子機(jī)制的研究提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

取定植于福建農(nóng)林大學(xué)中華名特優(yōu)植物園內(nèi)3年的毛竹(Phyllostachysheterocyclavar.pubescens)竹竿枝條上著生的葉片，取材時間為2016年10月.挑選具有典型衰老漸進(jìn)特征的葉片簇，用干凈的濕布擦拭去除表面的污垢和灰塵，放置于鋪有潮濕濾紙的保存盒中.收集的材料一部分用于測定葉片光合作用效率的相關(guān)參數(shù)；另一部分用于進(jìn)行衰老基因的表達(dá)鑒定，材料置液氮中速凍后于-80 ℃保存.

1.2 方法

1.2.1 毛竹衰老葉片的形態(tài)觀察 將取下的葉片簇置于EPSON Expression 11000XL掃描儀上進(jìn)行掃描以獲取葉片衰老的形態(tài)特征.

1.2.2 葉綠素?zé)晒鉁y定(Fv/Fm) 用英國Hansatech公司生產(chǎn)的Pocket PEA植物效率分析儀測定毛竹葉片光合系統(tǒng)Ⅱ的最大光合效率(Fv/Fm).對于整片葉的測量，選取離葉尖約0.5 cm的部位進(jìn)行隨機(jī)取點(diǎn)測定，每片葉取3個點(diǎn)，每種衰老狀態(tài)的葉取12片進(jìn)行測定.對于1片葉均分成上、中和下3段分別測定光合效率，取每段靠中間的部位進(jìn)行測定，每個部位取3個點(diǎn)，取12片同一衰老狀態(tài)的葉片進(jìn)行測量.

1.2.3 葉綠素測定 用95%乙醇浸提法測量毛竹葉的葉綠素含量[15].每種衰老狀態(tài)下的葉取12片進(jìn)行測定.對于1片葉子均分為上、中和下3段分別測定葉綠素含量，取12片葉全部均分為上、中和下3段后分別測定，計(jì)算每個部位的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差.

1.2.4 生物信息學(xué)分析 在植物葉片衰老數(shù)據(jù)庫(LSD,http://psd.cbi.pku.edu.cn/)中找到以物種命名的項(xiàng)目(Species Table)，下載所有水稻(Oryzasativa)衰老相關(guān)基因的基因座，同時參考已發(fā)表的水稻和小麥旗葉衰老轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[16-18].利用植物基因組資源數(shù)據(jù)庫(Phytozome,https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#)中收錄的水稻基因組數(shù)據(jù)獲取相關(guān)基因座的序列信息.利用這些序列在毛竹基因組數(shù)據(jù)庫(BambooGDB,http://www.bamboogdb.org/)中進(jìn)行BLASTn分析，尋找毛竹中可能存在的與水稻基因同源的基因.利用水稻eFP瀏覽器(http://bar.utoronto.ca/efprice/cgi-bin/efpWeb.cgi?dataSource=rice_leaf_gradient)對水稻中的相關(guān)基因進(jìn)行葉片表達(dá)模式的分類，以便后期驗(yàn)證毛竹中篩選出的葉片衰老相關(guān)基因.

1.2.5 總RNA的提取和檢測 采用全式金(TransGen)生產(chǎn)的TransZolUp總RNA抽提試劑對1.1中收集的樣品進(jìn)行總RNA提取，電泳檢測完整性，并在NanoDrop2000上測定濃度.

1.2.6 cDNA第一鏈的合成 采用康為生物(CWBIO)生產(chǎn)的HiFiScript快速去基因組cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行總RNA中基因組的消化和反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA.用1 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄.

1.2.7 引物設(shè)計(jì) 采用Beacon DesignerTM(Ver.7)專業(yè)引物設(shè)計(jì)軟件對毛竹基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，退火溫度控制在58～60 ℃，擴(kuò)增產(chǎn)物控制在80～200 bp.將設(shè)計(jì)好的引物在毛竹基因組網(wǎng)站上進(jìn)行BLASTn分析，檢測引物特異性，確認(rèn)無誤后送上海生工生物公司合成(表1).內(nèi)參基因?yàn)門IP41，擴(kuò)增引物參照Fan et al[19]的文章所述.

續(xù)表1

基因名稱正向引物(5'→3')反向引物(5'→3')MbLSAG56CGGCTATTTCCTCTCCAAAGGAGGTAATGGTGGTGTACTGMbLSAG57GCCTAGGAGTTGGAGACATAGTCGTTCTCAAGGAGTTCAGMbLSAG58GTGTCCTCATCTGAGAAACCGTACCATGTGACCAGAATCGMbLSAG59CTACAGCTCTGATGATCGTGCCCAGCATAAGATTCTCCAGMbLSAG60CTCTGTGTGACATTGACTGGGCTGGATCTGTAGTCTGTTGMbLSAG61CACCATCCGTTGTGACTATGTTACTCTTCCACTCCGCTACMbLSAG62CGGAACAGACCTTCATCATGGACTTCTCCACGTTCACAAGMbLSAG63GCGATATTCCACCTACTGTCCTTCCATGAGCTGGTCATAGMbLSAG64CCATACAACAGTGTCCTCTCCGGCAGATGTCATAGATAGCMbLSAG65CCTTGGTTCTCTTCTCCTTGGACAGGACACTGTTGTATGGMbLSAG66CATCTATGACATCTGCCACCGTGAGGATATGACCTGAGACMbLSAG67CGCCTGTCAGTAGATTATGGTCAGAGAATGAGTGGAGAGCMbLSAG68GTAGATTACGGCAGGAAGTCCTGTTATAAGGCTCGACGACMbLSAG69CAAGGTTCTGACCACCTAAGGATCAAAGGGTTGGAAGTCCMbLSAG70GAGTTGTCTCAGATCGTGTCGGCTGTGAAGTTGTCTCTTGMbLSAG71CAAGGAGAATAAGCAGGAGGGAACCAGCCAGATGATGTACMbLSAG72CAAAGGAGAACAAGCAGGAGCGAGAACCAGCCAGATAATGMbLSAG73CAAGTGAAGAGAGGGAAGAGCTGAGGTTGTACCAGAATCCMbLSAG74CCGACTCGTTCATCATCAACGAATGGAGAACCTGTCCTTCMbLSAG75ATGACCTACATCGGCTACTCCATCATCTGTGCGTACAGTCMbLSAG76GGATGACCTACATTGGCTACGGAGATGGAGAAGTGAACCTMbLSAG77GGCACCTAACTTAACTCCAGGCCATCTGTATCCATCACTCMbLSAG78CTCGATAAGAACCTAGCCACGCTCTGCTCAATGAGGTAAGMbLSAG79CACCCTCGATAAGAATCTGGGCTCTGCTCGATGAGATAAGMbLSAG80CCTTAACCATGTGACCTACCCAATGCAGTAAGGAACCTCCMbLSAG81CAAGAAGACTGCCTCTGTACCACTTCTTCCTGACCTCATCMbLSAG82GGCTGAAGAGAAGACTGTTGGCTCTGCTCAATCAGGTAAGMbLSAG83GGTTCGGCCAATCAGATTAGGACTATCCAATGAGAGCCAGMbLSAG84GCTACGCCATCATCATACTGCCATTGTAGGACTTGCTCTCMbLSAG85GCCACTGGTATTCATCTAGGGGTGATACACGTTCCAGTAGMbLSAG86CGGGTACACCATCATCATACCGACGATATAGGAGGTCTTCMbLSAG87CGTACTGCTCAAGCTAAGTCGCATTCCTGAGAAGATCCAGMbLSAG88CGGAGGTATTGTAGAGGTGTCAGCGTTACTCTCAGCATTCMbLSAG89CTGGCTCTCAAATGACACTCGCATCTCATAGAGTCCCTTCMbLSAG90CAATCCTAAGAAGAGCGAGGGCACCTGAGAGTCATTTGAGMbLSAG91CCAGGAAGGCTTATGATGAGCTTGTACGCGAAGAGATGTGMbLSAG92GGAGATTGGTGAGATGGAAGCTCAGGATTGGTGTCAACTGMbLSAG93GAAGTGGAGGATTCAGTTCCCTCACTCTTCTCAGGATTGGMbLSAG94CAAGAAGAGGTTCAGGAAGGCGAGGACGGAGTAGATAAGAMbLSAG95CCTTATCAGGGTGTCAATGGGGGTGATGTTAATGGAGTCCMbLSAG96GAGAGCTGGTTTCAGTATCCGAAGAGTGGTTGGACTAAGGMbLSAG97CTAACGAGGAGGATGAAAGGGGTGGCAGCAGTAGTAATAGMbLSAG98CATGGTGGAGTTACTGAGACGAGAGTGTTGACGAGACATCMbLSAG99CTACTACATCTTCCGCAAGGGGGAGGTTAGAGTGGAAGTAMbLSAG100CTTCAACCTGACCAAGAACGCCAAAGAGCTTGGAGAACTCMbLSAG101TCGACTACCTCTCATACCACGGTTGAAGAGCTTGTGGATGMbLSAG102GCAGAGTCTGGAAGTCAAACCAGTGTCCTCTCCTTCTCTTMbLSAG103CTGAAGAACTGCACAGTCTGCTTACCTATCTGCTGCTCCAMbLSAG104GACACCTATGCTGGAGAGTACCTCGTATCTATGCCCATTGMbLSAG105CCTTGAAGAGAACGGTACTGCGAGTCCAGAGAAGTTGATGMbLSAG106CTCGGTCGAGGTTATTGAAGCAAGGGTCTCCTGATGATACMbLSAG107GAAGGTGGTTGACATCATCGGCTTGACAGTGAGGTTCTTGMbLSAG108CTACAAGGATGGATCTACCGCAACCGAGAGGGAGATATCAMbLSAG109GCAGAGAAGACCAAGACTACGGGTATCGATTCCCATCATGMbLSAG110GTCTACACTGACAACGAAGGGGATATGCTGTCTGGTCTTGMbLSAG111GGAATCTTACCTGGCTGAAGGCTGGCTTTCCTATCTCTACMbLSAG112GTAACAGAGATGATCGTCGGCTGGTCGGTAGTGATGTAAGMbLSAG113GAATACTCGACTCCAGGTTGGATAATGGTAGGCGTTCTCC

1.2.8 半定量PCR 采用康為生物(CWBIO)生產(chǎn)的2×Es TaqMasterMix系統(tǒng)配制PCR反應(yīng)體系.內(nèi)參基因TIP41作為對照，對1.2.6中合成的不同衰老葉片來源的cDNA進(jìn)行一致化，反應(yīng)體積為20 μL，標(biāo)準(zhǔn)模板量為1 μL.PCR反應(yīng)在Thermo ARKTIK熱循環(huán)儀上進(jìn)行.每種衰老狀態(tài)的葉片或葉片部位進(jìn)行3個生物學(xué)重復(fù)(每個重復(fù)包含4片葉子)和3次技術(shù)重復(fù).反應(yīng)條件為：98 ℃ 30 s，95 ℃ 20 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)數(shù)為25～28個.產(chǎn)物于2.0% TAE瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離，并在上海培清JS-780全自動數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)上進(jìn)行條帶大小檢測和強(qiáng)度分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 毛竹葉片簇葉片逐級衰老過程中的形態(tài)、光合代謝效率和葉綠素含量變化

選用野外定植3年毛竹竿枝條上著生的具有顯著衰老漸進(jìn)特征的葉片簇，對它們進(jìn)行衰老形態(tài)、光合代謝效率(Fv/Fm)和葉綠素含量的分析.如圖1A所示，典型的毛竹竿枝條分支末端一般著生有5～7片葉的葉片簇，葉與葉之間交叉排布，離分支點(diǎn)越近的葉年紀(jì)越大(L1)，越遠(yuǎn)的葉越幼嫩(L7).在老葉和幼葉更替的過程中，老葉逐漸衰老(L1-L4)，呈現(xiàn)出失綠、枯黃和皺縮的表型，最終干枯和脫落；在老葉和幼葉之間是成熟葉(L5-L6)，葉色油綠色深、葉面平展，葉面積也較大；而幼葉(L1) 則顏色較淺，葉片柔軟.葉綠素?zé)晒?Fv/Fm)是指示光合代謝效率的重要指標(biāo)，其數(shù)值的大小與葉片的衰老程度正相關(guān).因植物葉片衰老一般從頂端和邊緣起始[7,11]，因此對整個毛竹葉片簇從老到幼的葉片頂端進(jìn)行葉綠素?zé)晒鉁y定.結(jié)果顯示，幼葉的葉綠素?zé)晒庵底罡?，達(dá)到0.81，成熟葉比幼葉的值略低一點(diǎn)，但隨著葉片進(jìn)入衰老程序，葉綠素?zé)晒庵饾u降低，并且在最老葉中達(dá)到最低(圖1B).這一結(jié)果與葉片衰老的形態(tài)特征相對應(yīng)，表明毛竹葉片的衰老與其光合效率的衰減是一致的.

A.葉片簇葉片的衰老形態(tài)，序數(shù)代表葉片由老到幼的順序；B.葉片簇不同葉片的光合代謝效率(Fv/Fm)；C.葉片簇不同葉片中葉綠素a、b和總?cè)~綠素含量的比較.圖1 毛竹葉片簇葉片逐級衰老形態(tài)及衰老相關(guān)生理特性Fig.1 Morphology and related physiological characteristics of moso bamboo leaves during leaf senescence process

葉綠素含量也是表征葉片衰老程度的指標(biāo)之一[20-22].我們檢測了毛竹葉片生長和不同衰老程度下整片葉中的葉綠素含量.結(jié)果如圖1C所示，在葉片從幼葉(L7)到成熟葉(L6-L5)生長的過程中，不論是葉綠素a(Chl a)、b(Chl)還是總?cè)~綠素(total Chl)，它們的含量均有較明顯的上升，在L5中達(dá)到最高，表明葉片在生長的過程中伴隨著葉綠素的大量積累(合成>降解)；但當(dāng)葉片進(jìn)入衰老階段后(L4-L1)，葉片中的葉綠素含量出現(xiàn)明顯下降(降解>合成)，并隨著葉片衰老程度的加深，葉綠素的含量降至最低.以上結(jié)果表明，毛竹葉片在生長和衰老的不同階段葉綠素含量經(jīng)歷了從升高到降低的變化過程，這與觀察到的毛竹葉色變化特征相一致.

綜合以上試驗(yàn)，結(jié)果表明毛竹葉片的衰老與其它植物葉片的衰老一樣具有典型的衰老形態(tài)和衰老生理特性，可以用一般的葉片衰老標(biāo)定方法對毛竹葉片的衰老過程進(jìn)行表征.

2.2 衰老毛竹葉片頂端、中部和基部光合代謝效率和葉綠素含量比較

如上所述，植物葉片的衰老一般從葉的頂端起始并逐級向葉的基部延伸[7,11]，在衰老葉片的頂端、中部和基部表現(xiàn)出的衰老表型、光合代謝效率以及葉綠素含量均應(yīng)存在一定的差異[10].因此，除比較了毛竹葉片簇葉片的整體衰老特征外，還比較了單個衰老葉片在頂端、中部和基部的衰老表型.如圖2A所示，衰老葉片的頂端(tip)出現(xiàn)明顯的黃化甚至褐化表型，表明葉片頂端已經(jīng)完全進(jìn)入衰老模式，而在中部(middle)和基部(base)則還保持著與成熟葉片較為接近的葉色.與葉色的表型一致，葉綠素?zé)晒?Fv/Fm)測定的結(jié)果顯示衰老葉片的頂端光合代謝效率很低，而中部和基部則較高，特別是基部，其代謝效率幾乎與成熟葉中的效率相當(dāng)(圖2B)，表明對于整片毛竹葉而言，其衰老從基部到頂端是一個逐漸加劇的過程.同樣，葉綠素含量的測定也顯示在葉片頂端葉綠素a、b和總?cè)~綠素的含量也最低，其次為中部，在基部的葉綠素含量最高，接近衰老早期葉片中的葉綠素含量(圖2C).以上結(jié)果表明，對單個毛竹葉片而言，其衰老特征在葉的頂端、中部和基部也存在明顯的差別，與毛竹葉片簇中葉片順序衰老反映的調(diào)控機(jī)制可能類似.

A.衰老葉片頂端、中部和基部的形態(tài)；B.衰老葉片頂端、中部和基部的光合代謝效率(Fv/Fm)比較；C.衰老葉片頂端、中部和基部的葉綠素a、b和總?cè)~綠素含量比較.圖2 衰老毛竹葉片頂端、中部和基部的形態(tài)和衰老相關(guān)生理參數(shù)比較Fig.2 Comparison of morphology and senescence related physiological parameters in the top, middle and basal parts of senescent moso bamboo leaves

2.3 毛竹葉片衰老相關(guān)基因篩選

鑒于毛竹葉片的衰老表型和衰老生理變化與其它植物特別是單子葉植物葉片的衰老特征極為相似[16,17,20]，那么在毛竹基因組中存在的與其它植物中鑒定的葉片衰老相關(guān)基因的同源基因可能在毛竹葉片的衰老調(diào)控中也發(fā)揮著同樣的功能.因此，根據(jù)前人研究發(fā)現(xiàn)毛竹基因組和單子葉植物特別是水稻基因組之間有著高度的同源性[23]，利用水稻和小麥中鑒定的葉片衰老相關(guān)基因?qū)γ窕蚪M進(jìn)行BLASTn分析，篩選一些毛竹基因組中可能存在的葉片衰老相關(guān)基因(圖3A).對來源于水稻中的112個衰老相關(guān)基因利用水稻eFP瀏覽器進(jìn)行了表達(dá)模式的分類，顯示90%以上的基因在衰老葉片中的表達(dá)分為6種模式，其中3種是在葉片基部(base)表達(dá)最高(type 1-3)，隨著向葉片中部(middle)和頂端(tip)的延伸表達(dá)水平逐漸降低，并在頂部表達(dá)最低或完全不表達(dá)，這3種表達(dá)類型的基因?qū)儆谌~片衰老負(fù)調(diào)控或負(fù)相關(guān)基因(ClassⅠ)，另3種情況則正好相反，是在葉片的頂端(tip)表達(dá)水平最高(type 4-6)，并隨著葉片從中部(middle)向基部(base)方向延伸表達(dá)水平逐漸降低，并在基部表達(dá)水平達(dá)到最低或完全不表達(dá)，這3種表達(dá)類型的基因?qū)儆谌~片衰老正調(diào)控或正相關(guān)基因(ClassⅡ)(圖3B).將通過同源比對(E值≤10-20)篩選出的320個毛竹基因按照水稻中同源基因的表達(dá)模式進(jìn)行分類，其中228個基因?qū)儆贑lassⅠ類型，72個基因?qū)儆贑lassⅡ類型.

A.利用水稻葉片衰老基因數(shù)據(jù)同源比對篩選毛竹基因組中可能存在的葉片衰老相關(guān)基因?qū)嶒?yàn)流程；B.衰老相關(guān)基因在水稻葉片中的表達(dá)模式、分類和數(shù)量.圖3 同源比對分析篩選毛竹基因組中與葉片衰老相關(guān)的基因Fig.3 Blastn analysis to screen candidate leaf senescence-associated genes in moso bamboo genome

2.4 篩選的毛竹葉片衰老相關(guān)基因在毛竹葉片簇不同衰老程度葉片中的表達(dá)

為了對篩選到的基因進(jìn)行鑒定，利用半定量PCR對這些基因在毛竹衰老葉片簇不同衰老程度葉片中的表達(dá)進(jìn)行分析.選取針對水稻75個衰老基因的113個毛竹同源基因進(jìn)行分析，這些基因覆蓋了圖3B中的所有表達(dá)類型.對這些基因利用毛竹葉片簇混合葉片總RNA反轉(zhuǎn)的cDNA作為模板首先檢測它們在葉中是否表達(dá)以及擴(kuò)增特異性.結(jié)果表明，在抽提的混合葉總RNA質(zhì)量可靠的前提下(圖4A)，PCR的結(jié)果顯示有86個基因在葉中表達(dá)并具有擴(kuò)增特異性(圖4B).因此在這些基因中進(jìn)一步鑒定與毛竹葉片衰老相關(guān)的基因.

A.毛竹葉總RNA電泳圖；B.候選基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖.數(shù)字1～113代表基因的編號，如1代表MbLSAG 1；C1和C2：對照基因TIP41；M：DL5000.圖4 毛竹葉片衰老相關(guān)候選基因半定量PCR引物驗(yàn)證Fig.4 Expression and primer amplification specificity verification of screened moso bamboo leaf senescence-associated genes in a mixed leaf cluster

分別提取衰老葉片簇第2(L2)、4(L4)和6(L6)片葉片的總RNA，以內(nèi)參基因TIP41作為對照，比較這86個基因在3種衰老狀態(tài)葉片中的表達(dá)水平.結(jié)果如圖5所示，這些基因在3種衰老程度葉片中均有表達(dá)，它們的表達(dá)模式主要集中在與水稻衰老葉片表達(dá)模式中類似的第3和第4種類型(圖3B)，并未出現(xiàn)第1和第6種的極端類型，也有少量類似第2種類型(如MbLSAG67和MbLSAG100).將這些基因的表達(dá)變化進(jìn)行葉片衰老關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)有39個基因在成熟葉中的表達(dá)水平明顯高于衰老葉，并且隨著葉片衰老的進(jìn)程呈下調(diào)趨勢(ClassⅠ)(圖5A)；同時，有13個基因在成熟葉中的表達(dá)水平明顯低于衰老葉，并且隨著葉片衰老的進(jìn)程呈上調(diào)趨勢(ClassⅡ)(圖5B)；除此之外，剩余的34個基因在3種衰老程度葉片中沒有顯著的表達(dá)差異(圖5C).以上結(jié)果表明，在毛竹葉片簇葉片衰老過程中至少有52個篩選的葉片衰老相關(guān)基因發(fā)生了顯著的表達(dá)變化，這些基因很可能在毛竹葉片衰老過程中發(fā)揮作用.

A.葉片基部中表達(dá)高于頂部的基因；B.葉片基部中表達(dá)低于頂部的基因；C.葉片基部和頂部中表達(dá)無差異的基因.圖5 葉片衰老相關(guān)候選基因在毛竹葉片簇不同衰老程度葉片中的表達(dá)水平比較Fig.5 Comparison of the expression level of candidate leaf senescence-associated genes in leaves with different senescence degrees in a moso bamboo leaf cluster

2.5 篩選的衰老相關(guān)基因在毛竹衰老葉片基部、中部和頂端的表達(dá)

單片毛竹衰老葉片不同部位的光合代謝效率及葉綠素含量的數(shù)據(jù)顯示其與毛竹葉片簇中不同葉齡葉片的衰老變化趨勢類似(圖1和圖2)，表明即使是單片毛竹葉片，其不同部位也可能在分子水平上存在衰老調(diào)控的差異.因此，在衰老葉片的基部、中部和頂端區(qū)域分別檢測以上86個基因的表達(dá)情況，從而鑒定在葉片不同部位中有表達(dá)差異的基因.結(jié)果如圖6所示，以內(nèi)參基因TIP41作為對照，所有86個基因在衰老葉片的所有部位中都表達(dá)，而且表達(dá)模式與水稻葉片中衰老相關(guān)基因表達(dá)模式的第3和第4種類型相似，沒有看到其它表達(dá)類型的存在，表明這些基因在毛竹衰老葉片不同部位中的表達(dá)具有連續(xù)性. 同樣，將這些基因的表達(dá)水平與對應(yīng)葉片部位所處的衰老程度進(jìn)行關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)有41個基因在葉片基部(base)的表達(dá)明顯高于葉片頂端(tip)，并且隨著葉片從基部向頂端的延伸呈下調(diào)趨勢(ClassⅠ)(圖6A)；與此相反，有13個基因在葉片基部的表達(dá)水平明顯低于葉片頂端，而且隨著葉片從基部向頂端延伸呈上調(diào)趨勢(ClassⅡ)(圖6B)；除此之外，剩余的32個基因在衰老葉片基部、中部和頂端中沒有顯著的表達(dá)差異(圖6C).有趣的是，在毛竹葉片簇不同衰老葉齡葉片中鑒定的所有有表達(dá)差異的衰老相關(guān)基因也在衰老葉片的不同部位中存在差異表達(dá)，表明不論是毛竹葉片簇的不同衰老葉片還是單獨(dú)衰老葉片的不同部位，這些與葉片衰老相關(guān)的基因可能都發(fā)揮著同樣的功能，它們在毛竹葉片的衰老調(diào)控中發(fā)揮著重要作用.另外，從結(jié)果可以看出，單片衰老葉片中鑒定的衰老相關(guān)基因數(shù)量要比葉片簇整體衰老葉片中鑒定的數(shù)量多(圖5和圖6)，表明隨著對毛竹葉片衰老程度的進(jìn)一步細(xì)分(如像水稻中將葉片從基部到頂部細(xì)分成11個區(qū)域)，應(yīng)該可以鑒定出更多與毛竹葉片衰老相關(guān)的基因.

圖6 葉片衰老相關(guān)候選基因在衰老葉片不同部位中的表達(dá)水平比較Fig.6 Comparison of the expression level of candidate leaf senescence-associated genes in the top, middle and basal parts of senescent moso bamboo leaves

3 討論

衰老是植物感應(yīng)生長和發(fā)育的需要以及響應(yīng)外界環(huán)境的變化實(shí)現(xiàn)自保和快速繁衍后代的生存機(jī)制，可以是某個組織或器官的衰老也可以是整個個體功能喪失從而走向死亡的過程[7,11,24].葉片作為植物進(jìn)行光合作用從而提供生長所需物質(zhì)和能量的重要場所，是植物衰老最敏感的器官之一.葉片衰老是一種程序性細(xì)胞死亡的過程，但與其它程序性細(xì)胞死亡不同，葉片衰老會導(dǎo)致整個葉片的死亡.對一年生植物而言，葉片衰老代表了植株整體的衰老狀態(tài)，而對多年生植物而言，葉片衰老代表著對季節(jié)更替和對極端環(huán)境的響應(yīng)[7,11].葉片衰老的速度比較慢，主要作用是動員衰老葉片中的碳、氮和礦質(zhì)營養(yǎng)等轉(zhuǎn)移到其它器官如新生組織、塊莖和種子中重新分配[25-27].除受內(nèi)部遺傳因素影響外，葉片衰老還受到多種環(huán)境因子的誘導(dǎo)[11].目前已經(jīng)分離出多種調(diào)控植物衰老的基因，如SAG12、SPA15、Osl2、See1、WRKY53和LSC7等[24].植物體內(nèi)的激素如細(xì)胞分裂素、生長素和赤霉素等具有延緩葉片衰老的作用，而茉莉酸、水楊酸、乙烯和脫落酸等則能促進(jìn)葉片的衰老.另外，環(huán)境因子如黑暗、干旱、高溫、高鹽以及病原體侵襲等也會加速葉片衰老的進(jìn)程[11].因此，解析葉片衰老的機(jī)制不僅對調(diào)控葉片衰老進(jìn)程和延長功能葉的持綠期具有重要指導(dǎo)意義，也是從局部到整體了解植物在整個生命周期中感受內(nèi)部遺傳調(diào)控和響應(yīng)外部環(huán)境變化協(xié)同作用最終決定自身發(fā)育命運(yùn)的基礎(chǔ).

毛竹開花引起的植株迅速衰老和死亡是世界性難題.因毛竹生命周期長、開花時間不可預(yù)期以及材料獲取困難等因素限制，目前只有零星的報(bào)道其葉片衰老過程中碳氮元素和灰分含量的變化分析[13-14]，對毛竹花后衰老分子機(jī)制的解析一直未取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展.本研究根據(jù)前人工作的基礎(chǔ)和自身長期的觀察，發(fā)現(xiàn)毛竹花后衰老植株整體死亡的過程和一年生植物如水稻等花后衰老和死亡的過程非常類似[16-17].盡管毛竹有漫長的營養(yǎng)生長期，但其植株花后衰老最先展現(xiàn)的特征就是葉片由綠變黃然后全部枯萎和脫落，因此提出從毛竹葉片的衰老機(jī)制入手尋找一些花后植株整體衰老分子調(diào)控的線索.本研究比較了野外定植毛竹葉片簇中的不同衰老程度葉片以及單片衰老葉基部、中部和頂端不同區(qū)域的衰老形態(tài)和生理特性變化，發(fā)現(xiàn)不論在哪種情況，毛竹葉片均展現(xiàn)出典型的衰老漸進(jìn)特性，在年輕葉和成熟葉中具有較高的光合代謝效率和葉綠素含量，而在衰老葉中這些指標(biāo)均出現(xiàn)顯著的下降(圖1和圖2)，表明毛竹葉片的衰老過程存在精細(xì)的分子調(diào)控機(jī)制.有趣的是，毛竹葉片衰老的形態(tài)和生理特征和單子葉植物水稻和小麥等旗葉的衰老特征相似[16-17]，而且毛竹基因組和水稻基因組在進(jìn)化上存在高度的保守性[23]，表明水稻和小麥旗葉中鑒定的衰老相關(guān)基因以及衰老調(diào)控機(jī)制很可能也適用于毛竹葉片的衰老研究.通過轉(zhuǎn)錄組分析，前人發(fā)現(xiàn)水稻和小麥旗葉衰老過程中存在大量功能相同基因的表達(dá)變化，這其中的很多基因已經(jīng)在其它植物中被證明與衰老直接相關(guān)，而且這些基因主要涉及大分子的降解和營養(yǎng)元素的轉(zhuǎn)移，特別是碳氮元素和氨基酸的代謝等[16-17].本課題利用水稻中獲得的衰老基因數(shù)據(jù)作為前體，通過同源比對在毛竹基因組中篩選到大量與水稻衰老基因同源的基因，并利用半定量PCR在野外定植毛竹的兩套葉片衰老系統(tǒng)中對這些可能的衰老基因進(jìn)行表達(dá)鑒定(圖5和圖6)，篩選出54個表達(dá)有顯著變化的基因，其中41個為衰老負(fù)相關(guān)基因，13個為衰老正相關(guān)基因，并且這些基因在衰老葉片中的表達(dá)趨勢與它們在水稻中同源基因的表達(dá)趨勢基本一致(圖3，從Class的角度)，這也進(jìn)一步說明這些有表達(dá)差異的基因在毛竹和水稻中的功能可能具有保守性，后期可以借助水稻系統(tǒng)對這些毛竹中的衰老相關(guān)基因進(jìn)行進(jìn)一步的功能分析.

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Leafsenescencecharacteristicsandthescreenandidentificationofleafsenescenceassociatedgenesinmosobamboo

REN Yujun, YANG Shuwei, WU Dongxiong, HUANG Chenxing, GUAN Yirong, MIAO Ying

(Center for Molecular Cell and Systems Biology, College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

Clusters of moso bamboo (Phyllostachysheterocyclavar.pubescens) leaves that showed obvious progressive senescence characteristics in bamboo culms and have been planted in field for 3 years were collected. Photochemical efficiency of photosystem Ⅱ (Fv/Fm) and chlorophyll contents were measured in these leaves so as to establish a relationship between leaf senescence degree and photosynthesis efficiency. Meanwhile, by using bioinformatics analysis (BLASTn), 113 genes in bamboo genome which showed homology to the leaf senescence-associated genes of rice (Oryzasativa) were obtained, and their expression trend in leaves during development and senescence process were detected, which aimed to discover some leaf senescence associated marker genes. The results showed that photochemical efficiency of photosystem Ⅱ and the contents of chlorophyll in bamboo leaves decreased significantly during senescence. And in the detection of gene expression, 86 out of the 113 genes were expressed in bamboo leaves. Among them, expression levels of 32 genes remained the same, but expression levels of 41 genes significantly decreased during leaf senescence process, while those of 13 genes increased. The expression pattern of those differentially expressed genes in moso bamboo are very similar to their homologous genes in rice plant during flag leaf senescence process, indicating that these genes may play the same regulatory function in both rice and bamboo which are associated with leaf senescence.

moso bamboo; leaf senescence; chlorophyll; photosynthesis efficiency; senescence-associated genes; homology analysis; gene expression

2017-07-28

2017-09-21

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃課題(2015BAD04B01-2).

任育軍(1980-),男,博士,助理研究員.研究方向:植物發(fā)育生物學(xué).Email：ryj@fafu.edu.cn.通訊作者繆穎(1965-),女,教授,博士生導(dǎo)師.研究方向:植物分子細(xì)胞生物學(xué).Email：ymiao@fafu.edu.cn.

S718

A

1671-5470(2017)06-0630-11

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.06.006

(責(zé)任編輯:吳顯達(dá))