艾洪蓮，楊曼思，何 雋，海梅榮，郭華春，王文祥,*

(1 中南民族大學 藥學院，武漢 430074；2 云南農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學與生物技術(shù)學院，昆明 650201)

馬鈴薯內(nèi)生真菌的多樣性及抑菌活性研究

艾洪蓮1,2，楊曼思1,2，何 雋1，海梅榮2，郭華春2，王文祥1,2,*

(1 中南民族大學 藥學院，武漢 430074；2 云南農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學與生物技術(shù)學院，昆明 650201)

從采自德宏、大理、臨滄3地健康馬鈴薯植株的根、莖、葉、塊莖中分離、純化內(nèi)生真菌，測定了其抑菌活性，并進行形態(tài)學和18S rDNA序列分析，確定了內(nèi)生真菌種屬. 共分離得到了493株內(nèi)生真菌，其中44株對3種馬鈴薯病害(馬鈴薯枯萎病、馬鈴薯黑痣病和馬鈴薯早疫病)有不同程度的抑制作用. 形態(tài)學特性和分子生物學研究結(jié)果顯示：44株活性內(nèi)生真菌分屬于21個屬，具有豐富的多樣性；其中籃狀菌屬、毛殼菌屬和附球菌屬為馬鈴薯拮抗活性內(nèi)生真菌的優(yōu)勢菌屬.

馬鈴薯；內(nèi)生真菌；生物多樣性；抑菌活性

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)又名洋芋、土豆、薯仔等，是茄科(Solanaceae)茄屬(Solanum)多年生草本塊莖植物，原產(chǎn)于南美洲安第斯山區(qū)，在我國已有數(shù)百年的栽培歷史，是繼水稻、小麥、玉米之后的第四大主糧作物[1]，隨著主糧化戰(zhàn)略的推出，馬鈴薯種植過程中所面臨的制約馬鈴薯產(chǎn)量的病害日益引起人們的重視. 目前馬鈴薯病害的防治主要以化學農(nóng)藥為主，在使用過程中易產(chǎn)生“3R1P”，即殘留、抗性、害蟲再猖獗和環(huán)境污染問題.

近來，微生物農(nóng)藥因其源于自然，無污染、低殘留等優(yōu)點，頗受人們的青睞. 植物內(nèi)生真菌中的拮抗內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生多種多樣具農(nóng)藥生物活性的次生代謝產(chǎn)物，為微生物農(nóng)藥的研究和開發(fā)提供了寶貴的資源庫. 因此對馬鈴薯共生及協(xié)同進化的內(nèi)生拮抗真菌的研究，已經(jīng)成為馬鈴薯病害防治研究的重點方向.

以健康馬鈴薯植株為材料，分離、篩選具有抑菌活性的內(nèi)生真菌，對具有拮抗作用的內(nèi)生真菌進行形態(tài)學和分子生物學鑒定，為開發(fā)無污染、低殘留并且可以使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)種植進入可持續(xù)良性發(fā)展的微生物源農(nóng)藥奠定理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 供試材料

馬鈴薯植株采自于云南省德宏、大理、臨滄三地，新鮮健康，無明顯病蟲害，取材部位為根、莖、葉、塊莖.供試靶標病原菌株：馬鈴薯枯萎病(Fusariumoxysporum)，標記為S01；馬鈴薯黑痣病(Rhizoctoniasolani)，標記為S02；馬鈴薯早疫病(Alternariasolani)，標記為S04. 馬鈴薯病原真菌菌株由河北農(nóng)業(yè)大學提供.

1.2 內(nèi)生真菌的分離、純化

將健康馬鈴薯植株的根、莖、葉、塊莖在自來水下沖洗干凈，擦干，根、莖、塊莖剪成3 cm的小段，葉剪成3 cm×3 cm的小片，按下列程序進行表面滅菌：無菌條件下，75%乙醇漂洗1 min，無菌水沖洗3次；2%次氯酸鈉消毒(消毒時間：根3 min；莖2.5 min；葉2 min)或者0.1%升汞消毒(消毒時間：根40 s；莖30 s；葉20 s)、無菌水漂洗3次；然后放置于無菌濾紙上將水分吸干. 將表面消毒后的根、莖、塊莖剪去兩端切口，剩余段從中間剖開，剪成(0.3～0.5) cm3的小塊，葉剪去四周后將剩余部分剪成0.3 cm×0.3 cm小塊.

消毒有效性評價采取3種方法[2]：1) 在內(nèi)生真菌分離操作的同時將未使用過的培養(yǎng)基平板蓋子打開，暴露在無菌操作工作臺上；2) 取少量的第3次無菌水漂洗液涂布于新的培養(yǎng)基平板上；3) 用組織印跡法，將表面消毒好待處理的完整根、莖枝段和葉片在未使用過的培養(yǎng)基平板上輕輕滾動或緊貼培養(yǎng)基放置5 min后移走. 將上述3種處理的培養(yǎng)皿置于22～25 ℃培養(yǎng)箱中與分離培養(yǎng)基共同培養(yǎng)，三者均未有雜菌生長，表明此分離方法所得到的真菌即為馬鈴薯內(nèi)生真菌而非附生菌.

采用頂端菌絲純化法，每日定期觀察內(nèi)生真菌長出情況，將切口處新長出的菌絲挑取尖端部分轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基上，純化培養(yǎng)至獲得純菌株. 將純化后的純菌株于4 ℃冰箱保存.

1.3 內(nèi)生拮抗真菌的篩選

初篩：采用平板對峙拮抗實驗法. 在9 cm的PDA平板上，分別接種待測內(nèi)生真菌菌株和靶標病原真菌，間距為5 cm，同時設(shè)置只接靶標病原真菌的平板作為對照，置于22～25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，觀察菌株生長情況和菌株間的拮抗現(xiàn)象.

復篩：在PDA培養(yǎng)基上接種已經(jīng)純化好待檢測活性的內(nèi)生真菌，22～25 ℃活化72 h后，挑取內(nèi)生真菌接種至大米固體培養(yǎng)基上(三角瓶中裝入等量的大米和水)，22～25 ℃培養(yǎng)20～30 d，搗碎，加入2倍體積95%的甲醇提取3次，每次浸泡24 h，過濾得到甲醇提取液，合并、減壓濃縮成浸膏，加入等體積的乙酸乙酯和水萃取4～5次，將萃取的乙酸乙酯部分合并濃縮得到各個不同內(nèi)生真菌的浸膏，分裝轉(zhuǎn)移至小瓶標記.

在PDA培養(yǎng)基上活化病原真菌，制成菌懸液，菌體終濃度調(diào)至1×106CFU/mL，取200 μL菌懸液均勻涂布于PDA平板培養(yǎng)基上，用直徑8 mm的打孔器打孔， 取50 μL待測內(nèi)生真菌溶液(以DMSO稀釋內(nèi)生真菌浸膏至5 mg/mL)滴入孔中，同時設(shè)置只加等量的DMSO溶液作為對照. 22～25 ℃培養(yǎng)，在第4 d和第8 d時觀察病原真菌的生長情況，出現(xiàn)抑菌圈后采用十字交叉法測定菌落直徑，記錄抑菌結(jié)果，按照下式計算抑菌圈直徑.

菌落直徑 (cm) =3次直徑平均值-打孔器直徑(0.8 cm)，

抑菌圈直徑=處理菌落直徑-對照菌落直徑.

1.4 內(nèi)生真菌的形態(tài)學、分子生物學鑒定

形態(tài)學鑒定：采用真菌學插片培養(yǎng)法[3]來觀察內(nèi)生真菌的菌絲和孢子形態(tài).采用Ainsworth等[4]分類系統(tǒng)進行初步分類鑒定.

分子生物學鑒定：參照Saghai和Guo等[5-8]方法，提取內(nèi)生真菌DNA. 采用真菌18S通用引物(ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′; ITS4: 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，進行PCR擴增. 18S rDNA序列由上海生工生物工程股份有限公司測定. 登錄NCBI，將測序獲得的18S rDNA ITS序列進行BLAST同源性序列比對分析(http:// blast. ncbi. nlm. nih. gov/).

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯內(nèi)生真菌分離結(jié)果

從德宏、大理、臨滄3地馬鈴薯植株中共分離得到內(nèi)生真菌493株(表1). 德宏馬鈴薯中分離到的內(nèi)生真菌總數(shù)略高于大理、臨滄兩地，分離自德宏、大理、臨滄的內(nèi)生真菌數(shù)各占總數(shù)的38.95%、29.41%和31.64%. 德宏馬鈴薯莖、葉中分離到的內(nèi)生真菌數(shù)量相對于根部多一些，分別占德宏分離總數(shù)的32.81%和31.77%，而從塊莖中分離所得內(nèi)生真菌數(shù)明顯低于其他3個部位分離所得，僅占10.42%. 臨滄馬鈴薯分離情況與德宏馬鈴薯大致相同，而大理馬鈴薯根、莖、葉、塊莖中分離到的內(nèi)生真菌數(shù)量差別不大.

表1 馬鈴薯內(nèi)生真菌分離結(jié)果Tab.1 The isolation results of endophytic fungi from Solanum tuberosum L.

2.2 內(nèi)生真菌抑菌活性篩選結(jié)果

通過平板對峙法對馬鈴薯內(nèi)生真菌進行初步篩選，獲得有活性的菌株共44株，占分離菌株總數(shù)的8.92%. 其中德宏20株，大理4株，臨滄20株，對馬鈴薯枯萎病、黑痣病、早疫病均顯示出不同程度的抑菌活性效果.測量生長4 d后和8 d后馬鈴薯內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物對3種病原真菌產(chǎn)生抑菌活性的抑菌圈直徑大小(表2)， 絕大部分內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物均具有抑菌活性，抑菌圈直徑最小為0.13 cm，最大可達4.67 cm. 抑菌圈大小隨著病原真菌生長時間的延長而逐漸減小，有的內(nèi)生真菌4 d的時候還能表現(xiàn)出抑菌活性，待8 d后抑菌活性消失；而有的內(nèi)生真菌則一直表現(xiàn)出很強的抑菌活性，如E19、D22.

從病原真菌角度分析來看：有8株內(nèi)生真菌菌株對馬鈴薯枯萎病有很強的抑菌活性，其中臨滄1株(E19)，德宏2株(D10、D22)對枯萎病的抑制效果尤其明顯；有18株內(nèi)生真菌菌株對馬鈴薯黑痣病有很強的抑菌活性，其中大理2株(L01、L05)，臨滄5株(LC36、E10、E14、E15、E19)，德宏3株(D01、D05、D22)對黑痣病的抑菌效果尤其顯著；有34株內(nèi)生真菌菌株對馬鈴薯早疫病有很強的抑菌活性，其中大理2株(L01、L05)，臨滄9株(LC01、LC13、LC16、LC36、E08、E10、E14、E15、E19)，德宏3株(D01、D02、D22)對早疫病的抑制效果尤甚. 數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，對馬鈴薯枯萎病有特別明顯抑制效果的菌株很少，只有3株，而對馬鈴薯早疫病有非常明顯抑制效果的菌株較多，有14株. 綜合來看，對馬鈴薯枯萎病、黑痣病、早疫病均有明顯抑菌活性的內(nèi)生真菌菌株有12株，占活性菌株總數(shù)的27.27%，它們分別是L05、LC13、LC36、E08、E10、E14、E15、E19、D01、D03、D10、D22，其中大理1株，臨滄7株，德宏4株.

表2 馬鈴薯內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物對病原真菌的抑菌活性數(shù)據(jù)

Tab.2 Antimicrobial activity data of the secondary metabolites from endophytic fungi ofSolanumtuberosumL. to pathogenic fungi

馬鈴薯內(nèi)生真菌菌株抑菌圈直徑/cm馬鈴薯枯萎病馬鈴薯黑痣病馬鈴薯早疫病4d8d4d8d4d8dL011.9204.533.84.173.73L020.9702.0702.11.27L031.730.331.403.271.53L052.170.83.953.273.82.53LC012.40.532.070.64.132.93LC091.871.071.5303.331.6LC132.20.63.331.873.732.2LC162.280.22.3303.532.07LC180.8701.8701.220LC251.0702.602.531.47LC362.371.333.333.23.933.67E021.870.82.1302.930.92E030.602.941.82.131.34E042.470.871.4703.61.47E060.6301.0301.770.93E070.800.9302.471.17E081.731.52.471.852.82E091.401.6702.331.33E102.331.733.53.23.572.93E132.070.33102.810.93E142.30.573.92.673.472.27E151.730.63.62.832.47E16000.601.130E192.162.052.252.152.122D013.1613.42.83.382.7D021.4502.2703.553.27D032.071.132.131.273.271.79D040.870.730.750.63.131.67D051.2502.632.551.751.63D061.0802.9302.051.2D081.10.531.851.751.211.07D091.0701.5302.481.93D102.232.122.531.552.81.5D110.6700.8701.30.47D121.130.470.730.132.770.6D130.4701.541.451.451.2D141.80.61.40.273.330.93D161.20.471.402.471.45D171.0802.730.872.681.77D181.170.40.80.272.870.6D191.3203.811.62.91.47D201.680.131.2702.931.53D224.444.533.734.674.13D231.90.472.3302.930.93

說明：L代表大理，LC和E代表臨滄，D代表德宏；抑菌圈直徑單位cm

2.3 內(nèi)生真菌形態(tài)學、分子生物學鑒定結(jié)果

馬鈴薯中所含內(nèi)生真菌的形態(tài)豐富多樣，有絮狀、氈狀、絨毛狀、顆粒狀；菌絲生長的密集程度也各不相同，有的稀疏，有的致密；菌落的形狀有圓弧形、花環(huán)狀、齒輪狀、鋸齒狀，也有的呈不規(guī)則狀；菌落的顏色有白色、淡黃色、磚紅色等；有的菌體產(chǎn)色素，有褐色、橘色、棕色等.

將馬鈴薯內(nèi)生真菌的ITS序列在核酸序列數(shù)據(jù)庫中進行BLAST檢索，結(jié)果表明，各內(nèi)生真菌ITS序列與目標序列相似度很高，均達到99%或100%(表3).

表3 馬鈴薯內(nèi)生真菌分子鑒定結(jié)果

Tab.3The molecular identification results of endophytic fungi inSolanumtuberosumL.

編號名稱覆蓋度最大相似度/%Genebank登錄號L01Talaromycespurpureogenus10099JX965230.1L02Chaetomiumglobosum100100KU720060.1L03Aspergilluscarneus100100KX437770.1L05Albifimbriaviridis100100KU845899.1LC01Clonostachysrossmaniae10099AF358227.1LC09Aspergillusterreus100100KT778597.1LC13Alternariabrassicae100100KU743903.1LC16Schizophyllumcommune100100KU253774.1LC18Phomaomnivirens100100FJ427042.1LC25Alternariatenuissima100100LC134322.1LC36Trichotheciumcrotocinigenum100100JQ606830.1E02Phomasp.10099KT355015.1E03Boeremiaexigua100100KU512286.1E04Boeremiaexigua100100KT193802.1E06Didymellabellidis10099KR818908.1E07Paracamarosporiumhawaiiense9999HM751092.1E08Bipolarissorokiniana10099KJ909776.1E09Boeremiaexigua100100KT193802.1E10Xylariacurta10099KJ883611.1E13Coniochaetasp.100100KU702304.1E14Fusariumtricinctum100100KX394541.1E15Fusariumtricinctum100100KU350702.1E16Beauveriabassiana100100KU214583.1E19Bipolariseleusines9899KY909768.1D01Alternarialongipes100100KX499521.1D02Fusariumproliferatum100100KU847857.1D03Epicoccumnigrum100100JX844158.1D04Epicoccumnigrum100100KT291417.1D05Talaromycespinophilus100100KT206233.1D06Epicoccumnigrum100100KU935700.1D08Epicoccumsp.100100KT369837.1D09Epicoccumnigrum100100KT291417.1D10Talaromycestrachyspermus10099KP055603.1D11Epicoccumnigrum100100KT291417.1D12Cladosporiumcladosporioides100100KX664414.1D13Chaetomiumglobosum100100KU720060.1D14Clonostachysrosea100100KT387608.1D16Epicoccumnigrum100100JX844158.1D17Chaetomiumfimeti100100KU935655.1D18Eutypellasp.10099AB693818.1D19Talaromycespinophilus100100KM458832.1D20Ampelomyceshumuli100100KU204751.1D22Chaetomiumpseudoglobosum100100KT214573.1D23Chaetomiumafropilosum100100KT214574.1

由表3可見，這44株內(nèi)生真菌分屬于21個屬，分別是籃狀菌屬(Talaromyces)、毛殼菌屬(Chaetomium)、曲霉屬(Aspergillus)、Albifimbria、螺旋聚孢霉屬(Clonostachys)、鏈格孢屬(Alternaria)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、莖點霉屬(Phoma)、單端孢屬(Trichothecium)、Boeremia、殼二孢屬(Didymella)、Paracamarosporium、離蠕孢屬(Bipolaris)、炭角菌屬(Xylaria)、Coniochaeta、鐮孢菌屬(Fusarium)、白僵菌屬(Beauveria)、附球菌屬(Epicoccum)、枝孢屬(Cladosporium)、彎孢聚殼屬(Eutypella)、白粉寄生孢(Ampelomyces)；有40株內(nèi)生真菌鑒定到種，其余4株僅鑒定到屬. 其中，籃狀菌屬(Talaromyces)、毛殼菌屬(Chaetomium)和附球菌屬(Epicoccum)為馬鈴薯具拮抗活性內(nèi)生真菌中的優(yōu)勢菌屬.

3 討論

采自德宏、大理、臨滄3地的健康馬鈴薯植株不同部位分離得到493株內(nèi)生真菌. 從分離部位來看，德宏和臨滄兩地馬鈴薯莖、葉中分離到的內(nèi)生真菌數(shù)量明顯多于根和塊莖，這與藥用植物車前、側(cè)柏等的研究結(jié)果一致[9，10]. 而大理產(chǎn)馬鈴薯根、莖、葉、塊莖中分離的內(nèi)生真菌數(shù)量差別不大，其原因初步估計與3地氣候特點密切相關(guān). 大理屬于低緯高原季風氣候，而臨滄和德宏均屬于熱帶季風氣候. 熱帶作為物種最為豐富、結(jié)構(gòu)最為復雜的陸地生態(tài)系統(tǒng)，其植物內(nèi)生真菌物種數(shù)量和多樣性亦非常豐富. 結(jié)果表明，分離自大理的內(nèi)生真菌主要分布在4個屬(Talaromyces、Chaetomium、Aspergillus、Albifimbria)；分離自德宏的活性內(nèi)生真菌主要分布在9個屬(Talaromyces、Chaetomium、Clonostachys、Alternaria、Fusarium、Epicoccum、Cladosporium、Eutypella、Ampelomyces)，分離自臨滄的活性內(nèi)生真菌主要分布在14個屬(Aspergillus、Clonostachys、Alternaria、Schizophyllum、Phoma、Trichothecium、Boeremia、Didymella、Paracamarosporium、Bipolaris、Xylaria、Coniochaeta、Fusarium、Beauveria)從分離的內(nèi)生真菌類群多樣性來看，臨滄最多，德宏次之，大理最少. 44株對馬鈴薯枯萎病、馬鈴薯黑痣病和馬鈴薯早疫病有不同程度抑制作用的內(nèi)生真菌中，來自德宏的20株，臨滄的20株，大理的4株，結(jié)合形態(tài)學、分子生物學鑒定結(jié)果，離蠕孢屬(Bipolaris)和Chaetomium的內(nèi)生真菌抑菌活性較好，離蠕孢屬和鐮孢菌屬內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物值得進一步深入研究，為開發(fā)無污染、低殘留并且可以使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)種植進入可持續(xù)良性發(fā)展的微生物源農(nóng)藥奠定了基礎(chǔ).

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DiversityandAntibacterialActivityofEndophyticFungiIsolatedfromSolanumtuberosumL.

AiHonglian1,2,YangMansi1,2,HeJuan1,HaiMeirong2,GuoHuachun2,WangWenxiang1,2

(1 College of Pharmacy, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China;2 College of Agronomy and Biotechnology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201,China)

A series of endophytic fungi were isolated and purified from the rhizomes, stems leaves and tubers of healthySolanumtuberosumL. growing in Dehong, Dali and Lincang Yunnan Province, and the antibacterial activity of these strains was identified. The species were determined based on the fungi′s morphology and 18S rDNA analysis. In the total of 493 isolated endophytic fungi strains, 44 strains have different inhibitory effects on three kinds of diseases (Fusariumoxysporum,RhizoctoniasolaniandAlternariasolani) ofSolanumtuberosumL. The results of morphological classification and molecular biological research showed that those 44 strains belong to 21 genera, in whichTalaromyces,ChaetomiumandEpicoccumwere the predominant fungi. The above results revealed the high diversity and antibacterial of endophytic fungi derived fromSolanumtuberosumL..

endophytic fungi；SolanumtuberosumL.；bio-diversity；bacteriostatic activity

2017-07-26 *

王文祥，研究方向：天然藥物化學，E-mail：903544288@qq.com

艾洪蓮(1981-)，女，講師，博士，研究方向：民族藥用植物學，E-mail：2015050@mail.scuec.edu.cn

國家自然科學基金資助項目(31560010); 中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金資助項目(CZW17094,CSP17067, CZY16010,CSP17061)

O692.3；Q946.88

A

1672-4321(2017)04-0051-05