(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 檢驗(yàn)科，安徽 蕪湖 241001)

·臨床醫(yī)學(xué)·

細(xì)菌對(duì)電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)乙型肝炎指標(biāo)結(jié)果的影響

李 婕，方 芳，李小寧

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 檢驗(yàn)科，安徽 蕪湖 241001)

目的：探討細(xì)菌對(duì)電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)乙型肝炎指標(biāo)結(jié)果的影響。方法收集我院臨床確診為乙型肝炎患者45例的血液標(biāo)本，按照加入菌種和濃度的不同，分為1個(gè)對(duì)照組和9個(gè)實(shí)驗(yàn)組，通過電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)HBsAg、HBeAg、HBcAb三項(xiàng)指標(biāo)。結(jié)果加入不同濃度梯度、不同菌種的血清標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論細(xì)菌對(duì)電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)乙型肝炎指標(biāo)結(jié)果無(wú)影響，提示電化學(xué)免疫分析法可能不受細(xì)菌因素的干擾。

乙型肝炎；細(xì)菌；電化學(xué)發(fā)光免疫分析

隨著臨床檢驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展，近年來(lái)出現(xiàn)的電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)[1](electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)是繼酶免疫測(cè)定法(enzyme immunoassay,EIA)、放射免疫測(cè)定法(radioimmunoassay，RIA)、熒光免疫測(cè)定法(fluorescence immunoassay,FIA)、時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定法(time-resolved fluorescence immunoassay,TRFIA)之后的新一代標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)，被廣泛運(yùn)用于臨床檢驗(yàn)診斷領(lǐng)域，是目前較先進(jìn)的標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)之一。該方法是將標(biāo)本中待測(cè)抗原、生物素化特異性單克隆抗體和釕復(fù)合物標(biāo)記的特異性抗體形成夾心復(fù)合物，然后結(jié)合到鏈霉親和素包被的微粒上，微粒被吸附到電極上，電極加壓后產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，通過光電倍增原理進(jìn)行測(cè)量[2]。ECLIA法具有反應(yīng)可控、靈敏度高、易于與分離技術(shù)聯(lián)用等特點(diǎn)，且經(jīng)大量臨床試驗(yàn)論證，該方法不受黃疸、溶血、乳糜血和生物素的干擾。但是細(xì)菌是否對(duì)ECLIA法的檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生干擾，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)的研究文獻(xiàn)。在臨床采集血液過程中，不乏有炎癥感染甚至是菌血癥患者，或出現(xiàn)血液樣本接觸到空氣中或定植在人體表面細(xì)菌的情況，因此研究細(xì)菌對(duì)ECLIA法檢測(cè)結(jié)果的影響就顯得尤為重要。本文擬采用ECLIA法分別定量檢測(cè)乙型肝炎大三陽(yáng)患者的HBsAg、HBeAg、HBcAb三項(xiàng)指標(biāo)，分析不同濃度的細(xì)菌和不同細(xì)菌之間的檢測(cè)結(jié)果是否存在差異[3-5]，旨在探討細(xì)菌是否對(duì)ECLIA檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生干擾,為臨床選擇合理的檢驗(yàn)方法提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集弋磯山醫(yī)院2016年10～12月經(jīng)臨床確診為乙型肝炎(HBsAg、HBeAg、HBcAb三項(xiàng)指標(biāo)都為陽(yáng)性)門診或住院患者的血液，離心分離血清，-20 ℃密閉保存[4]。共納入近1個(gè)月內(nèi)無(wú)炎癥、感染、菌血癥病史的成年男性患者23例和女性患者22例。

1.2 儀器與試劑 儀器：電熱恒溫水槽DK-600型(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司)，Roche cobas 8000系列電化學(xué)自動(dòng)分析儀cobas e 602(德國(guó)羅氏)。試劑：乙型肝炎病毒表面抗原、e抗原、核心抗體檢測(cè)試劑盒均來(lái)自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.3 方法 將冷凍標(biāo)本放置37 ℃電熱恒溫水槽中解凍，室溫下每例標(biāo)本均設(shè)立1個(gè)對(duì)照組和9個(gè)實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組加入200 μL血清和200 μL生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組每組加入200 μL血清后，再分別依次加入等量0.5、2.0、3.0麥?zhǔn)蠁挝坏谋砥て咸亚蚓骸⒋竽c埃希菌菌液、鮑曼不動(dòng)桿菌菌液，放入37℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，混勻，然后用電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀進(jìn)行檢測(cè)，標(biāo)本信號(hào)/Cut-off。實(shí)驗(yàn)前校正儀器，機(jī)器運(yùn)行狀態(tài)良好，所有操作均嚴(yán)格按照儀器及試劑盒說明書進(jìn)行，質(zhì)控和樣本準(zhǔn)確性和精密性均符合要求。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度表皮葡萄球菌菌液組與對(duì)照組的檢測(cè)結(jié)果比較 對(duì)3種不同濃度表皮葡萄球菌菌液組的HBsAg、HBeAg、HBcAb三項(xiàng)指標(biāo)和對(duì)照組的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)不同濃度的表皮葡萄球菌菌液組分別與對(duì)照組相比，以及不同濃度菌液組之間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2 同一濃度下不同菌液組與對(duì)照組的檢測(cè)結(jié)果比較 通過對(duì)相同濃度(2.0麥?zhǔn)蠁挝?的表皮葡萄球菌菌液組、大腸埃希菌菌液組、鮑曼不動(dòng)桿菌菌液組和對(duì)照組的HBsAg、HBeAg、HBcAb結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)3種不同菌液組分別與對(duì)照組相比，以及不同菌液組之間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表1 不同濃度表皮葡萄球菌菌液組HBsAg、HBeAg、HBcAb與對(duì)照組比較

分組HBsAg/(ng/mL)HBeAg/(PEIU/mL)HBcAb/(PEIU/mL)對(duì)照組6108．45±3624．75423．82±624．960．037±0．1780．5麥?zhǔn)蠁挝粷舛冉M6155．61±3599．46405．39±581．490．036±0．1702．0麥?zhǔn)蠁挝粷舛冉M6053．60±3594．94414．57±592．840．034±0．1563．0麥?zhǔn)蠁挝粷舛冉M6100．01±3561．35424．21±598．400．034±0．165F0．0060．0100．003P0．9990．9991．000

表2 2.0麥?zhǔn)蠁挝坏牟煌航M檢測(cè)HBsAg、HBeAg、HBcAb與對(duì)照組的比較

分組HBsAg/(ng/mL)HBeAg(/PEIU/mL)HBcAb/(PEIU/mL)對(duì)照組6108．45±3624．75423．82±624．960．037±0．178表皮葡萄球菌菌液組6053．60±3594．94414．57±592．840．034±0．155大腸埃希菌菌液組6142．03±3566．32407．32±593．470．035±0．170鮑曼不動(dòng)桿菌菌液組5897．31±3587．59411．50±593．860．036±0．176F0．0400．0050．003P0．9890．9991．000

3 討論

ECLIA發(fā)展于1996年，它在發(fā)光反應(yīng)中加入了電化學(xué)反應(yīng)，是繼放射免疫、酶免疫、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定之后的新一代標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)，是電化學(xué)和免疫測(cè)定相結(jié)合的產(chǎn)物,也是現(xiàn)階段醫(yī)療界公認(rèn)的較先進(jìn)的臨床免疫檢測(cè)技術(shù)之一。目前應(yīng)用范圍延伸至DNA單分子檢測(cè)、藥物分析、免疫分析、生物活性物質(zhì)分析及活體分析等領(lǐng)域。電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀臨床應(yīng)用于甲狀腺激素檢測(cè)，貧血病因的判斷(鐵蛋白測(cè)定)，腫瘤標(biāo)志物以及性激素檢測(cè)，輸血前常規(guī)檢測(cè)和TORCH實(shí)驗(yàn)。

ECLIA基本原理為電化學(xué)發(fā)光過程中產(chǎn)生的光信號(hào)強(qiáng)度與二價(jià)的三氯聯(lián)吡啶釕[Rubpy 3]2+的濃度呈線性關(guān)系。將二價(jià)的[Rubpy 3]2+與免疫反應(yīng)體系中的一種物質(zhì)結(jié)合，經(jīng)免疫反應(yīng)、分離后，檢測(cè)免疫反應(yīng)體系中剩余二價(jià)的三氯聯(lián)吡啶釕[Rubpy 3]2+經(jīng)上述過程后的激發(fā)光，即可得知待檢物的濃度。ECLIA法檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)，線性范圍寬；而傳統(tǒng)的酶免疫測(cè)定法(ELA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法為既往臨床常用檢查乙肝病毒血清標(biāo)志物的方法，易受溶血、黃疸、乳糜血、類風(fēng)濕因子、高濃度非特異性免疫球蛋白、藥物、血液抗凝劑及細(xì)菌等多種因素的影響，導(dǎo)致ELISA法檢測(cè)結(jié)果判斷錯(cuò)誤[6-8]。紀(jì)曉花[9]認(rèn)為標(biāo)本被細(xì)菌污染后，菌體中可能含有內(nèi)源性過氧化物酶，因此，被污染的標(biāo)本同溶血標(biāo)本一樣，亦可產(chǎn)生非特異性顯色而干擾測(cè)定結(jié)果。如大腸埃希菌的β-半乳糖苷酶本身會(huì)對(duì)用相應(yīng)酶作標(biāo)記的測(cè)定方法產(chǎn)生非特異性干擾。其次譚立明[10]認(rèn)為乳糜血會(huì)使吸光度A值增高出現(xiàn)假陽(yáng)性，而細(xì)菌細(xì)胞膜含有脂質(zhì)成分，裂解入血造成檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性。化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定(CLEIA)因?yàn)樾枰捎么呋l(fā)光反應(yīng)的酶標(biāo)記抗原或抗體，如辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(ALP)，所以細(xì)菌也會(huì)對(duì)此檢測(cè)方法產(chǎn)生一定的干擾[11]。放射免疫分析技術(shù)(RIA)反應(yīng)時(shí)間較慢，敏感度較低，放射性廢物的儲(chǔ)存和銷毀，均會(huì)對(duì)環(huán)境造成一定放射性污染；時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定方法(TRFIA)易受環(huán)境、試劑和容器中的鑭系元素離子的污染，致使檢測(cè)的本底增高。

正因上述傳統(tǒng)的檢測(cè)方法或多或少都存在各自的缺點(diǎn)，因此尋求新的質(zhì)量可信、安全可靠的檢測(cè)方法就顯得尤為重要。由于ECLIA設(shè)計(jì)的是生物素包被，已經(jīng)證實(shí)具有容易測(cè)定和控制、結(jié)合穩(wěn)定、不影響標(biāo)記物的理化性質(zhì)、試劑靈敏度高、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。檢測(cè)儀器說明書上明確指出ECLIA不受標(biāo)本溶血、膽紅素(一定濃度范圍內(nèi))、乳糜血、抗凝劑因素影響，但是并沒有指出會(huì)不會(huì)受到菌血癥的影響。本實(shí)驗(yàn)初步探究此因素對(duì)電化學(xué)發(fā)光方法檢測(cè)肝炎指標(biāo)結(jié)果的影響，選擇表皮葡萄球菌是因?yàn)樵摷?xì)菌定植于皮膚表面，在采血過程中會(huì)污染標(biāo)本，大腸埃希菌會(huì)產(chǎn)生內(nèi)源性過氧化物酶，鮑曼不動(dòng)桿菌則是在醫(yī)院感染患者，尤其重癥ICU患者感染中最常見，所以這三種細(xì)菌的選擇均有代表性意義。本文研究結(jié)果也顯示不同濃度的不同細(xì)菌對(duì)電化學(xué)發(fā)光方法檢測(cè)乙型肝炎患者的HBsAg、HBeAg、HBcAb指標(biāo)結(jié)果都沒有影響，從而為推斷電化學(xué)自動(dòng)免疫分析方法檢測(cè)血清中乙型肝炎病毒是不受細(xì)菌干擾的結(jié)論提供理論依據(jù)。然而，細(xì)菌是否對(duì)電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢則其他項(xiàng)目如激素、甲狀腺功能，HIV相應(yīng)指標(biāo)產(chǎn)生影響，有待于下一步試驗(yàn)的繼續(xù)探索。

總之，檢驗(yàn)醫(yī)師在選擇檢驗(yàn)方法時(shí)，不僅要考慮檢驗(yàn)成本和生物安全，還要評(píng)估分析所有干擾因素，從而保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，確保檢測(cè)結(jié)果的真實(shí)可靠，從而為臨床的準(zhǔn)確診斷、病情分析、療效判斷及預(yù)后評(píng)估等方面提供科學(xué)依據(jù)。

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EffectofbacteriaontheresultsofelectrochemiluminescenceimmunoassayindetermininghepatitisBvirusserummarkers

LIJie,FANGFang,LIXiaoning

Department of Clinical Laboratory,The First Affiliated Hospital of Wannan Medical College，Wuhu 241001, China

Objective：To observe the interference of bacteria with the results of electrochemiluminescence immunoassay in determining the serum markers of hepatitis B virus.Methods:Serum samples were collected in 45 patients confirmed as hepatitis B. Then the samples were divided into one control group and 9 experimental groups by applying diverse concentration of different bacterium. Electrochemiluminescence immunoassay was performed to detect HBsAg, HBeAg and HbcAb.Results:The serum markers were not significantly varied between the control group and experimental group after using diverse concentration and species of bacterium (P>0.05).Conclusion:The findings indicate that bacteria will produce no interference with the results of electrochemiluminescence immunoassay in determining the serum markers of hepatitis B virus.

hepatitis B;bacterium;electrochemiluminescence immunoassay

1002-0217(2017)06-0567-03

2017-05-02

李 婕(1992-)，女，2016級(jí)碩士研究生，(電話)18355350249，(電子信箱)1982684407@qq.com；

李小寧，男，主任技師，副教授，碩士生導(dǎo)師，(電子信箱)lixiaoning19702006@126.com，通信作者。

R 512.62;R 392.11

A

10.3969/j.issn.1002-0217.2017.06.017