張敏+尹會(huì)方+屠晶

摘要：胞內(nèi)勞森氏菌是豬增生性腸炎的病原，試驗(yàn)設(shè)計(jì)4條引物，采用半巢式PCR從目的DNA中擴(kuò)增出1 317 bp的胞內(nèi)勞森氏菌lscN基因，并進(jìn)行序列分析。結(jié)果表明，lscN與GenBank中PHE/MN1-00、N343同源性為99%，是勞森氏菌三型分泌系統(tǒng)組件的編碼基因。

關(guān)鍵詞：胞內(nèi)勞森氏菌；三型分泌系統(tǒng)；PCR

中圖分類號(hào)：Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-273X（2017）12-0010-02

豬增生性腸炎（Porcine proliferative enteropathy，PPE）是由勞森氏菌（Lawsonia intracellularis，Li）感染引起的豬接觸性腸道傳染病[1]。該病主要發(fā)生在6～20周齡斷奶豬，育成豬也可感染，引起頑固性腹瀉，嚴(yán)重降低飼料轉(zhuǎn)化率，導(dǎo)致養(yǎng)豬業(yè)受到經(jīng)濟(jì)損失[2]。三型分泌系統(tǒng)（Type Three Secretion System，TTSS）是一種跨細(xì)菌內(nèi)外膜、細(xì)胞外空間和宿主細(xì)胞膜的蛋白運(yùn)輸裝置，在革蘭氏陰性菌中廣泛存在，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)存在TTSS的致病菌包括大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、耶爾森氏菌等[3]。英國學(xué)者David G.E. Smith 在2009年運(yùn)用染色體步移技術(shù)在Li分離株中鑒定到編碼TTSS的基因區(qū)域，其中l(wèi)scN是為效應(yīng)蛋白跨膜提供能量的ATP酶[4]，因此，本試驗(yàn)對(duì)lscN進(jìn)行克隆及序列分析，為后續(xù)LscN蛋白的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 PCR LA Mix、PCR Taq Mix、2 000 bp Marker、T4 DNA ligase、pMD18-T simple載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、GoldenView、瓊脂糖購自寶生物工程（大連）有限公司；Tris、EDTA-Na2、NaCl、LB培養(yǎng)基由龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系提供。

1.1.2 引物 從GenBank中下載lscN（LI_RS02940）的序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物由上海華津生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增 采用巢式PCR擴(kuò)增目的片段。第一重PCR反應(yīng)體系為：2×PCR LA Mix 12.5 μL，引物1、2各1 μL （10 pmol/L），模板DNA 1 μL，加滅菌超純水至25 μL；PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性40 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。第二重PCR反應(yīng)體系為：2×PCR LA Mix 12.5 μL，引物3、4各1 μL （10 pmol/L），第一重PCR產(chǎn)物1 μL（100倍稀釋），加滅菌超純水至25 μL；PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性40 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照。取第二重PCR產(chǎn)物5 μL加入上樣緩沖液后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)束后，用凝膠成像儀觀察并記錄結(jié)果。

1.2.2 PCR產(chǎn)物回收 將余下的20 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下將目的條帶從瓊脂糖凝膠中切下，放入干凈的離心管中稱重。向膠塊中加入3倍體積Buffer G，50 ℃水浴10 min，其間溫和地上下顛倒數(shù)次。然后加入1倍體積異丙醇，上下顛倒混勻。向已裝入收集管中的吸附柱中加入200 μL Buffer S，12 000 r/min離心2 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。將前面得到的溶液加入到吸附柱中，室溫放置2 min，12 000 r/min離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。吸附柱中加入500 μL Buffer G，12 000 r/min離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。向吸附柱中加入650 μL Buffer W，12 000 r/min離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中，空離2 min。將吸附柱放入1.5 mL離心管中，在吸附膜中央加入10 μL Buffer B，室溫靜置1～2 min，12 000 r/min離心1 min，回收得到目的片段。

1.2.3 PCR產(chǎn)物克隆T載體 取回收目的片段7 μL，pMD18-T載體0.5 μL，T4 DNA ligase 1.5 μL，T4 DNA ligase buffer 1 μL，4 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物5 μL，DH5α 50 μL加入1.5 mL離心管，冰浴30 min，然后42 ℃水浴90 s，接著再冰浴2 min，加入1 mL SOC，搖床振蕩培養(yǎng)45 min，吸取200 μL培養(yǎng)液涂布100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，然后挑菌，PCR鑒定。

1.2.4 基因測序與序列分析 將陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，送上海華津生物科技有限公司測序。對(duì)測序獲得的序列進(jìn)行同源性比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段擴(kuò)增結(jié)果

采用巢式PCR擴(kuò)增目的片段。第一重PCR擴(kuò)增得到1 517 bp產(chǎn)物，第二重PCR擴(kuò)增得到1 317 bp產(chǎn)物（圖1），結(jié)果與預(yù)期相符。

2.2 目的片段克隆T載體結(jié)果

目的片段連接T載體后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)過夜，細(xì)菌生長情況見圖2。

挑取8個(gè)單菌落轉(zhuǎn)接100 μg/mL氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基，PCR鑒定結(jié)果見圖3。1～3、5～8號(hào)菌均為陽性克隆。

2.3 目的片段測序結(jié)果與序列分析

采用NCBI網(wǎng)站中的BLAST工具，將lscN與GenBank中的序列進(jìn)行比較，結(jié)果lscN與GenBank中PHE/MN1-00、N343同源性為99%（圖4）。endprint

3 小結(jié)與討論

增生性腸炎以回腸炎和結(jié)腸隱窩未成熟細(xì)胞腺瘤樣增生為特征，引起飼料轉(zhuǎn)化率低下，豬只生長遲緩，很大程度上影響生豬產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。勞森氏菌是增生性腸炎的致病菌，該菌專性細(xì)胞內(nèi)生長，微需氧，生長要求苛刻。因此，許多分子生物學(xué)技術(shù)難于應(yīng)用其上，相關(guān)研究十分有限，目前研究主要集中于運(yùn)用各種測序技術(shù)尋找在勞森氏菌致病性中發(fā)揮作用的基因或蛋白。英國學(xué)者David G.E. Smith 在2009年運(yùn)用染色體步移技術(shù)在其分離株LR189/5/83中鑒定到編碼三型分泌系統(tǒng)的基因區(qū)域，發(fā)現(xiàn)與耶爾森氏菌yscN、yscO、yscQ高度同源的基因lscN、lscO、lscQ，然而卻未見后續(xù)報(bào)道。

TTSS與許多革蘭氏陰性菌毒力因子分泌有關(guān)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)存在TTSS的革蘭氏陰性菌包括大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、耶爾森氏菌等。大腸桿菌通過TTSS改變宿主離子通道，傳遞效應(yīng)蛋白Tir、EspF、Map、EspG1、EspG2到宿主細(xì)胞中發(fā)揮毒力作用；沙門氏菌和志賀氏菌通過TTSS入侵宿主，影響宿主膜泡運(yùn)輸[5]。耶爾森氏菌YscN蛋白為ATPase，在識(shí)別底物和啟動(dòng)酶反應(yīng)中起作用，為伴侶蛋白綁定效應(yīng)蛋白提供能量[6]。YscO在大腸桿菌上的同源物EscO有穩(wěn)定EscN結(jié)構(gòu)，刺激ATPase活化的作用[7]，YscO并不發(fā)揮這樣的作用，而是識(shí)別與其綁定配體的保守基團(tuán)[8]。YscQ是TTSS注射小體內(nèi)環(huán)組件，由yscQ翻譯的兩個(gè)蛋白組成，可容納YscN。因此推測Li的LscN、LscO、LscQ有相似作用，故本試驗(yàn)對(duì)lscN克隆測序，為后續(xù)蛋白的研究奠定基礎(chǔ)。

目前，歐美報(bào)道的豬勞森氏菌分離株有PHE/MN1-00（美國）、NWumn05（美國）、VPB4（美國）、GB106（美國）、DBumn06（美國）、D15540（丹麥）、PHE-BR（巴西）、963/3（英國）、916/91（英國）、LR189/5/83（英國）等。GenBank中報(bào)道全基因組序列的僅有PHE/MN1-00和N343兩株。采用NCBI網(wǎng)站中的BLAST工具，將擴(kuò)增到的lscN與GenBank中的序列進(jìn)行比較，結(jié)果lscN與GenBank中PHE/MN1-00、N343同源性為99%，說明該基因保守性較高。

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