郭韋韋， 敖啟林，彭曉蓉，董華

（1湖北省公安縣人民醫(yī)院病理科，公安434300；2華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院病理學(xué)研究所，武漢430030）

聯(lián)合檢測SALL4 、OCT3/4、CD117 和glypican-3在惡性生殖細胞腫瘤診斷及分型中的應(yīng)用

郭韋韋1， 敖啟林2*，彭曉蓉1，董華1

（1湖北省公安縣人民醫(yī)院病理科，公安434300；2華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院病理學(xué)研究所，武漢430030）

目的探討聯(lián)合檢測SALL4 、OCT3/4、CD117和glypican-3在惡性生殖細胞腫瘤（malignant germ cell tumors，MGCTs）診斷和分型中的應(yīng)用價值。方法采用免疫組織化學(xué)Envision法檢測117例MGCTs中SALL4 、OCT3/4、CD117和Glypican-3的表達情況，包括25例精原細胞瘤、12例無性細胞瘤、20例生殖細胞瘤、18例胚胎性癌、42例卵黃囊瘤，另選取24例非生殖細胞惡性腫瘤作為對照，包括8例卵巢透明細胞癌，6例卵巢漿液性癌，5例胸腺癌，5例淋巴瘤。結(jié)果SALL4在全部MGCTs中均呈細胞核彌漫強陽性表達；OCT3/4在精原細胞瘤(24/25)、無性細胞瘤(11/12)、生殖細胞瘤(19/20)以及全部胚胎性癌(18/18)中呈細胞核陽性表達，在卵黃囊瘤均陰性；CD117在精原細胞瘤(23/25)、無性細胞瘤(11/12)、生殖細胞瘤（18/20）以及部分卵黃囊瘤（26/42）中呈不同程度的細胞膜陽性表達，僅在少數(shù)（2/18）胚胎性癌呈灶性表達；glypican-3在卵黃囊瘤（37/42）中瘤細胞的細胞質(zhì)表達，另在(3/18)例胚胎性癌、(1/12)例無性細胞瘤呈灶性表達。24例對照中，SALL4 、OCT3/4均為陰性，CD117在1例卵巢漿液性癌和1例胸腺癌中呈灶性表達，glypican-3在1例卵巢透明細胞癌中呈灶性表達，其余腫瘤CD117、glypican-3均陰性。結(jié)論SALL4可作為MGCTs病理診斷的通用免疫標記物，OCT3/4和CD117有助于精原細胞瘤、無性細胞瘤、生殖細胞瘤以及胚胎性癌的診斷和鑒別診斷，glypican-3和CD117陽性有助于卵黃囊瘤的診斷。聯(lián)合檢測這4個抗體在MGCTs的病理診斷和分型中有很高的臨床應(yīng)用價值，可作為一線抗體組合推廣運用。

生殖細胞腫瘤；SALL4；OCT3/4；CD117；Glypican-3；病理診斷；免疫組織化學(xué)

惡性生殖細胞腫瘤（malignant germ cell tumors MGCTs）是一組共同起源于胚胎性腺的原始生殖細胞腫瘤，組織學(xué)類型復(fù)雜多樣。不同組織類型，其生物學(xué)行為、治療方式和預(yù)后有所不同。在臨床外檢工作中，我們較常見的精原細胞瘤（無性細胞瘤、生殖細胞瘤）、胚胎性癌、卵黃囊瘤以及一些非生殖細胞源性腫瘤的鏡下形態(tài)結(jié)構(gòu)常相互交叉或重疊，單純依靠HE染色，診斷難度大。目前，用于MGCTs病理診斷和分型的免疫組化抗體很多，如PLAP、AE1/AE3、EMA、CD30、HCG、AFP等，這些抗體雖多重組合，但特異性和敏感性仍不甚滿意，既增加了患者的經(jīng)濟負擔(dān)，又不利于MGCTs患者的治療與預(yù)后判斷。

SALL4是近幾年來研究較熱門的一種鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，對維持胚胎干細胞的多向潛能性和自我更新起著重要作用。多數(shù)學(xué)者報道，SALL4在MGCTs中具有高度敏感性和特異性[1-6]。Glypican-3在卵黃囊瘤中表達較為敏感，相比于AFP，其在診斷上可能更有優(yōu)勢[4,5]。而OCT3/4和CD117作為診斷MGCTs的兩種常見抗體，具有很好的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)。為進一步探討這4個抗體聯(lián)合應(yīng)用在MGCTs診斷與分型中的臨床應(yīng)用價值，本文檢測了睪丸、卵巢以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、縱膈、腹膜后、骶尾部的共 117例 MGCTs中 SALL4 、OCT3/4、CD117和glypican-3的表達情況。

材料與方法

1 材料

收集華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院病理學(xué)研究所2012年至2016年間保存的117例原發(fā)純性MGCTs，其中，經(jīng)典精原細胞瘤25例（患者年齡13-60歲，發(fā)生于睪丸20例，其中3例發(fā)生于隱睪，前縱膈4例，腹膜后1例）；無性細胞瘤12例（患者年齡14-34歲；其中左卵巢6例，右卵巢5例，雙側(cè)卵巢同時發(fā)生1例）；生殖細胞瘤20例（患者年齡8-70歲，位于鞍區(qū)10例，松果體6例，其他部位4例）；胚胎性癌18例（年齡17-42歲，男性；16例發(fā)生在睪丸，2例發(fā)生在前縱膈）；卵黃囊瘤42例（男性17例，年齡1-22歲；女性25例，年齡16-55歲；發(fā)生于睪丸9例，卵巢16例，前縱膈6例，骶尾5例，其他6例）。

另選在組織學(xué)上易與MGCTs混淆的24例非生殖細胞惡性腫瘤作為對照。包括8例卵巢透明細胞癌， 6例卵巢高級別漿液性癌，5例胸腺癌，5例彌漫大B細胞淋巴瘤。

以上全部病例均經(jīng)過2名富有經(jīng)驗的高年資醫(yī)生復(fù)核。

2 方法

全部標本均經(jīng)過10%中性甲醛固定，石蠟包埋，4μm切片，HE染色，光鏡觀察后，選取典型病變，4μm切片，應(yīng)用Envision法進行免疫組織化學(xué)染色，全部免疫組織化學(xué)染色均在半自動Bio Gene染色儀上完成。

3 免疫組織化學(xué)染色

SALL4（克隆號sc-101147；Santa Cruz公司）、OCT3/4、CD117、glypican-3（均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司）。以PBS代替一抗作為陰性對照，并分別設(shè)置陽性對照。切片常規(guī)脫蠟至水后，蒸餾水洗，EDTA（PH=9.0）液中高壓修復(fù)2.5min，PBS水洗；3% H2O2室溫下孵育10min，滴加一抗常溫孵育1h，PBS水洗；滴加生物素化抗兔二抗，常溫孵育30min，PBS水洗；DAB顯色10min，蘇木素復(fù)染3min。結(jié)果判定：以整張切片內(nèi)著色陽性腫瘤細胞占所有腫瘤細胞的比例為主要觀察因素，結(jié)合著色強弱（淡黃色、黃色、棕黃色或棕色）綜合判斷。計數(shù)10個高倍視野（×400倍）分析陽性細胞百分數(shù)，以＜10%為（-），10%～30%為(+)，31%～60%為(++)，＞60% (+++)。結(jié)果判定由2名經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師運用雙盲法進行評估。

4 統(tǒng)計分析

采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，組間陽性率比較采用Fisher確切概率法，以P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 SALL4在各類型腫瘤中的表達

SALL4在各組MGCTs中均呈彌漫性細胞核強陽性表達，相對敏感度均為100% （表1，表3，圖1B，圖2B，圖3B）。SALL4在全部24例對照病例中均為陰性， SALL4在MGCTs中的相對敏感性與對照組相比較，差異顯著（表3）。

2 OCT3/4、CD117和glypican-3在各類型腫瘤中的表達

OCT3/4在多數(shù)精原細胞瘤（18/25，72%）、無性細胞瘤（9/12，75%）、生殖細胞瘤(17/20，85%)以及胚胎性癌（15/18，83.3%）中呈彌漫性細胞核表達（表1），其中在精原細胞瘤、無性細胞瘤、生殖細胞瘤以及胚胎性癌中相對敏感性分別為（24/25，96%）、（11/12，91.7%）、（19/20，95%） 和（18/18，100%），但在全部42例卵黃囊瘤及24例對照病例中均不表達（表1和表2）。OCT3/4在前面四種腫瘤中的相對敏感性與卵黃囊瘤及對照組比較，差異顯著（表3）。

CD117在精原細胞瘤（23/25，92%）、無性細胞瘤(11/12，91.7 %)、生殖細胞瘤（18/20，90%）以及部分卵黃囊瘤（26/42，61.9%）中呈不同程度的細胞膜陽性表達（表1，表3，圖3C）。另在少數(shù)（2/18）胚胎性癌、1例卵巢漿液性癌和1例胸腺癌中呈灶性陽性表達，其余腫瘤均為陰性（表1和表2）。與胚胎性癌及對照組比較，CD117分別在前面四種MGCTs相對敏感性高，表達較好，差異顯著。

Glypican-3陽性表達定位在細胞質(zhì)，在多數(shù)卵黃囊瘤中以彌漫（28/42，66.7%）或中等強度（7/42，16.7%）形式進行表達（表1和圖3D），在卵黃囊瘤相對敏感性為（37/42，88.1%）（表3）。另外，glypican-3在3例胚胎性癌、1例無性細胞瘤以及1例卵巢透明細胞癌中呈灶性表達，其余腫瘤均陰性（表1和表2）。與其他類型MGCTs及對照組比較，Glypican-3在卵黃囊瘤敏感性強，差異顯著。

表1 SALL4、OCT3/4、CD117、Glypican-3在MCCTs中的表達 [n(%)]Tab.1 Expression of SALL4, OCT3/4, CD117 and glypican-3 in different MGCTs [n(%)]

表2 SALL4、OCT3/4、CD117和glypican-3在非生殖細胞腫瘤中的表達 (n)Tab. 2 Expression of SALL4, OCT3/4, CD117 and glypican-3 in malignant nongerm cell tumors (n)

表3 SALL4、OCT3/4、CD117和glypican-3在MCCTs中的相對敏感度 [n(%)]Tab. 3 Positive rate of SALL4, OCT3/4, CD117, and Glypican-3 in different MGCTs [n(%)]

圖 1 SALL4在睪丸精原細胞瘤中的表達。A，HE染色；B，SALL4的免疫組化染色顯示瘤細胞呈彌漫強陽性表達；比例尺，200μmFig. 1 Expression of SALL4 in testicular seminoma. A, HE staining; B, immunohistochemical staining showed positive and diffusive SALL4 in tumor cells; scale bar, 200μm

圖 2 SALL4在胚胎性癌中的表達。A，HE染色；B，SALL4的免疫組織化學(xué)染色顯示瘤細胞呈彌漫強陽性表達；比例尺，200μmFig. 2. Expression of SALL4 in embryonal carcinoma. A, HE staining; B, immunohistochemical staining showed positive and diffusive SALL4 in the tumor cells; scale bar, 200μm

圖3 SALL4、CD117和glypican-3在卵黃囊中的表達。A，HE染色；B，SALL4免疫組織化學(xué)染色；C，CD117免疫組織化學(xué)染色；D，glypican-3免疫組織化學(xué)染色；比例尺，200μmFig. 3 Expression of SALL4, CD117 and glypican-3 in the yolk sac. A, HE staining; B to D, immunohistochemical staining of Sall4 (B), CD117 (C) and glypican-3 (D); scale bar, 200μm

討 論

SALL4是近幾年來新發(fā)現(xiàn)的原癌基因，定位于人類染色體 20q13.13-13.2，是人類婆羅雙樹樣基因SALL家族成員之一。多數(shù)學(xué)者報道了SALL4在生殖細胞腫瘤中具有高度敏感性和特異性。曹登峰等[1-3]分別檢測了來自睪丸、卵巢以及性腺外的原發(fā)和轉(zhuǎn)移性的生殖細胞腫瘤中的SALL4表達情況，報道顯示SALL4在精原細胞瘤、無性細胞瘤、卵黃囊瘤及胚胎性癌中均呈彌漫強陽性表達（約90%的腫瘤細胞著色），陽性率均為100%，而在對照的非生殖源性腫瘤中只有極少數(shù)樣本檢測到SALL4呈灶性弱陽性表達。該實驗室前期關(guān)于SALL4在生殖細胞腫瘤中的研究中[6]，也報道了SALL4在來自性腺和性腺外的不同類型生殖細胞腫瘤中均具有較好的表達。在非生殖細胞腫瘤中，SALL4也可在小部分分化差的癌（卵巢漿液性癌、胃腸腺癌、子宮內(nèi)膜樣癌等），以及呈胚胎樣分化的腫瘤（Wilms瘤、惡性橫紋肌樣瘤）中出現(xiàn)表達[7,8]。文中結(jié)果顯示SALL4在所檢測的來自睪丸、卵巢以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、縱膈、腹膜后及骶尾部的全部生殖細胞腫瘤均呈彌漫陽性表達，敏感性為100%，進一步驗證了前面觀點的準確性。而在所選的組織學(xué)上易與MGCTs混淆的非生殖細胞腫瘤對照組均為陰性，分析可能與選擇樣本數(shù)小及腫瘤類型有關(guān)?？傊琒ALL4在診斷MGCTs上是一個非常好用的通用免疫標記物。

OCT3/4和CD117已被證實在生殖細胞腫瘤的診斷和分型中有較高臨床應(yīng)用價值。OCT3/4在精原細胞瘤、無性細胞瘤、生殖細胞瘤以及胚胎性癌中敏感性高，在卵黃囊瘤中幾乎不表達，而CD117在前面三種腫瘤中表達較好，在胚胎性癌中表達差[9]。本文結(jié)果顯示OCT3/4在前述四類腫瘤中多數(shù)腫瘤中呈彌漫性表達，在全部卵黃囊瘤均不表達，而CD117在前面三種MGCTs中表達較好，在胚胎性癌中表達不理想，再次證實了前面觀點。結(jié)果還顯示CD117在部分卵黃囊瘤樣本中表達較好。提示在診斷MGCTs時，如遇到卵黃囊瘤的其他免疫標記物陰性，CD117陽性，不能完全排除卵黃囊瘤成分存在的可能性，需結(jié)合形態(tài)學(xué)綜合判定，因為卵黃囊瘤常和其他生殖腫瘤伴發(fā)，以免漏診。

OCT3/4作為干細胞標記物，與部分體細胞惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[10]。但Looijenga等利用組織芯片技術(shù)檢測了100余種腫瘤類型3600個標本中 OCT4表達情況， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在非生殖細胞腫瘤中 OCT4幾乎不表達[11]。文中結(jié)果顯示，OCT3/4在24例非生殖細胞腫瘤均呈陰性，提示OCT3/4在MGCTs與非生殖源性腫瘤鑒別上可能發(fā)揮作用，需要更深入研究和大樣本的支持。CD117除標記胃腸間質(zhì)瘤外，在其他如卵巢漿液性癌、胸腺癌等很多腫瘤中都可表達。文中結(jié)果顯示了CD117在一例漿液性癌和一例胸腺癌中呈局灶表達，提示CD117在生殖細胞腫瘤診斷與鑒別診斷上，常需和其他抗體聯(lián)合運用。

Glypican-3，即膜性硫酸乙酰肝素糖蛋白，也是新近發(fā)現(xiàn)的一種癌胚抗原。Glypican-3在妊娠期主要由胎肝合成，在出生后的正常組織中幾乎無表達。研究表明glypican-3聯(lián)合其他肝癌標記物如HepPar1、AFP等在肝細胞癌的診斷、預(yù)后監(jiān)測中發(fā)揮重要作用。特別是glypican-3在低分化肝細胞癌中表達更敏感[12]。同時，陸續(xù)有學(xué)者報道了glypican-3在卵黃囊瘤中表達情況。曹登峰等[1,2]檢測29例睪丸卵黃囊腫瘤樣本中均出現(xiàn)glypican-3染色，但有45%的樣本出現(xiàn)＜30%腫瘤細胞數(shù)的局灶染色，而在26例卵巢卵黃囊腫瘤中，glypican-3的表達率為69%。張春芳等[4]檢測14例睪丸卵黃囊瘤中的glypican-3，敏感性高達92.9%，大部分病例呈現(xiàn)彌漫強陽性。Trinh等[5]報道31例卵巢卵黃囊瘤中g(shù)lypican-3表達陽性率為79.3%。我們的結(jié)果與張春芳、Trinh等報道的結(jié)果更為接近： glypican-3在卵黃囊瘤中敏感性達88.1%，在多數(shù)樣本中呈現(xiàn)彌漫強陽性表達。AFP在卵黃囊瘤中常呈局灶或片狀著色[1,2]。因此，我們認為，相比AFP，glypican-3在卵黃囊瘤的診斷上更有優(yōu)勢，是又一個敏感性和相對特異性均較好的標記物。

綜上所述，在診斷和鑒別診斷MGCTs中，聯(lián)合檢測文中四個指標時，當(dāng)SALL4陽性時，考慮生殖細胞源性腫瘤可能；OCT3/4和CD117陽性支持精原細胞瘤或（無性細胞瘤或生殖細胞瘤）診斷，OCT3/4陰性、CD117陽性和glypican-3陽性支持卵黃囊瘤診斷。此外，生殖細胞腫瘤常以兩種或多種成分的混合性形式發(fā)生。含多種惡性成分的混合性生殖細胞腫瘤預(yù)后可能相對更差[13]。如遇文中所選四個抗體均陽性，要考慮到混合性生殖細胞腫瘤的可能性。鑒于抗體的敏感性和特異性，在MGCTs外檢中，需多種抗體聯(lián)合運用確保病理結(jié)果準確性，以便臨床采取規(guī)范化治療。聯(lián)合檢測SALL4、OCT3/4、CD117和glypican-3在MGCTs的診斷和分型中有很好臨床應(yīng)用價值，值得作為一線的抗體套餐推廣應(yīng)用于臨床外檢工作中。

[1] Cao D, Guo S, Allan RW, et al. SALL4 is a novel sensitive and specific marker of ovarian primitive germ cell tumors and is particularly useful indistinguish in gyolk sac tumor from clear cell carcinoma. Am J Surg Pathol, 2009, 33(6):894-904.

[2] Cao D, Li J, Guo CC, et al. SALL4 is a novel diagnostic marker for testicular germ cell tumors . Am J Surg Pathol,2009, 33(7): 1065-1077.

[3] Cao D, Humphrey PA, Allan RW, et al. SALL4 is a novel sensitive and specific marker for metastatic germ cell tumors, with particular utility in detection of metastatic gyolk sac tumors. Cancer, 2009, 115(12): 2640-2651.

[4] 張春芳，齊冬雪，楊聰穎，等. SALL4、D2-40和Glypican-3在睪丸生殖細胞腫瘤診斷中的應(yīng)用. 臨床與實驗病理學(xué)雜志，2015，31（8）：850-854.

[5] Trinh DT, Shibata K, Hirosawa T, et al. Diagnostic utility of CD117, CD133, SALL4, OCT4, TCL1 and glypican-3 in malignant germ cell tumors of the ovary. J Obstet Gynaecol Res, 2012, 38(5): 841-848.

[6] 孟麗，楊子萱，朱朋成，等. SALL4在生殖細胞腫瘤中的表達及其臨床應(yīng)用價值. 華中科技大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2014，43（2）：152-157.

[7] Miettinen M, Wang Z, Mc Cue PA, et al. SALL4 expression in germ cell and non-germ cell tumors a systematic immuno-histochemical study of 3215 cases. Am J Surg Pathol, 2014,38(3): 410-420.

[8] 孟麗，楊子萱，朱朋成，等. SALL4在腎母細胞瘤中的表達意義及其應(yīng)用. 中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)，2014，23（2）：185-159.

[9] 滕梁紅，盧德宏，徐慶中，等. OCT4、CD117、CD30在生殖細胞腫瘤中的表達及鑒別診斷意義. 中華病理學(xué)雜志，2005，34（11）：711-715.

[10] 陳燕坪，朱偉峰，陳麗芳，等. 睪丸彌漫性大B細胞淋巴瘤中OCT4蛋白的表達及其臨床病理特征. 中華病理學(xué)雜志，2017，46（6）：383-387.

[11] Looijenga LH, S toop H, de Leeuw HP, et al. POU5F1(OCT3 /4) identifies cells with pluripotent potential in human germ cell tumors. Cancer Res, 2003, 63(9): 2244- 2250.

[12] 李桂梅，侯寧，楊志慧，等. Glypican-3、HepPar1和CD34在肝細胞癌中的表達及臨床意義. 診斷病理學(xué)雜志，2015，22（2）：95-98.

[13] 王卡娜，劉輝，侯敏敏，等. 42例卵巢惡性生殖細胞腫瘤臨床特征及預(yù)后分析. 實用婦產(chǎn)科雜志，2015，31（01）：40-44.

Combined utilization of SALL4, OCT3/4, CD117 and glypican-3 immunostaining in the diagnosis and classification of malignant germ cell tumors

Guo Weiwei1, Ao Qilin2*, Peng Xiaorong1, Dong Hua1
（1 Department of Pathology, Gongan County People’s Hospital of Hubei province, Hubei Gongan, 434300; 2Institute of Pathology,Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, 430030 China）

ObjectiveTo investigate the value of combined detection of SALL4, OCT3/4, CD117, and Glypican-3 in the diagnosis and classification of malignant germ cell tumors (MGCT).MethodsThe expressions of SALL4, OCT3/4, CD117, and Glypican-3 proteins were detected by EnVision immunohistochemical method in 117 cases of MGCT，including 25 cases of seminomas，12 cases of dysgerminomas, 20 cases of germinomas, 18 cases of embryonal carcinomas (EC), and 42 cases of yolk sac tumors (YST). Twenty four cases of malignant non-germ cell tumors were selected as a control group，including 8 ovarian clear cell carcinomas (CCC), 6 ovarian serous carcinomas (SC) , 5 thymic carcinomas, and 5 lymphomas.ResultsSALL4 showed strong and diffusive expression in nucleus of all MGCTs cases. OCT3/4 nucleus staining was positive in seminomas (24/25), dysgerminomas(11/12), germinomas (19/20) and all EC (18/18), but negative in all 42 YSTs. The membranous expressions of CD117 in seminomas(23/25), dysgerminomas (11/12), germinomas (18/20) and YST (26/42) were positive but variable, while the staining was more focal in 2 of 18 EC. Glypican-3 staining in the cytoplasm was seen in 37 YSTs, 3 ECs, and 1 dysgerminoma with a focal pattern in the last two tumor types . In contrast, SALL4 and OCT3/4 were all negative in 24 control cases. All tumors were negative for CD117 and Glypican-3 staining except 1 SC and 1 thymic carcinoma were CD117 positive and 1 CCC was Glypican-3 positive with all threeshowing a focal staining.ConclusionSALL4 can be used as a universal immunological marker for pathological diagnosis of MGCTs clinically. OCT3/4 and CD117 show added value in the diagnosis and differential diagnosis of seminoma, dysgerminoma, germinoma and embryonal carcinoma. Positive Glypican-3 and CD117 staining can be an indicator for the diagnosis of yolk sac tumors. The combination of SALL4, OCT3/4, CD117, and Glypican-3 immunostaining has a high clinical value for pathological diagnosis and classification of MGCTs, therefore corresponding antibodies can be used for first-line detection.

Germ cell tumor; SALL4; OCT3/4; CD117; glypican-3; pathological diagnosis; immunohistochemistry

R730.43

A

10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2017. 06. 009

2017-07-20

2017-11-28

郭韋韋，女（1985年），漢族，主治醫(yī)師

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：aoqilin@263.net