樊偉偉，陳 潔，黃 純，黃惠華

（1.三亞航空旅游職業(yè)學(xué)院，海南三亞 572000；2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510000）

海南苦丁茶提取液抗氧化作用的研究

樊偉偉1，陳 潔2，黃 純2，*黃惠華2

（1.三亞航空旅游職業(yè)學(xué)院，海南三亞 572000；2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510000）

采用DPPH自由基清除能力法（DPPH），羥自由基清除法（HRSA）和金屬離子螯合能力法（MCC）3種方法，對海南新老苦丁茶提取液的抗氧化作用進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，海南苦丁茶提取液具有明顯的抗氧化作用，其對DPPH自由基、羥自由基（HRSA）的清除能力和對金屬離子螯合能力（MCC）隨濃度的增加而增大，且新茶的抗氧化能力要強(qiáng)于老茶。

海南苦丁茶；提取液；抗氧化作用

苦丁茶俗稱茶丁、富丁茶、皋盧茶，主要來源于冬青科冬青屬大葉冬青植物[1-2]。根據(jù)文獻(xiàn)及研究報(bào)道，苦丁茶具有抗氧化、抑菌、降壓降脂、調(diào)節(jié)血糖、清熱解毒、抑制腫瘤、延緩衰老等多種功效[3-6]，是我國一種傳統(tǒng)的純天然保健飲料。海南是苦丁茶的重要產(chǎn)地，經(jīng)過多年的培育，苦丁茶日前已成為海南一道亮麗的特產(chǎn)名片。海南苦丁茶資源雖然已經(jīng)引起了人們的重視，但對苦丁茶保健功能的研究卻很少，缺乏科學(xué)的數(shù)據(jù)支撐。因此，試驗(yàn)采用DPPH自由基清除能力法（DPPH）、羥自由基清除法（HRSA） 和金屬離子螯合能力法（MCC） 3種方法，對海南新老苦丁茶提取液的抗氧化作用進(jìn)行了研究，以便為其深度開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

苦丁茶：2種海南大葉冬青苦丁茶，分為新茶和老茶，產(chǎn)自海南省五指山市。

1.2 主要試劑與儀器

無水乙醇、VC，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；1,1-二苯基-2-三硝基（DPPH），日本TCI公司提供；氯化亞鐵、七水合硫酸亞鐵，廣州化學(xué)試劑廠提供；菲啰嗪，廣州菲博生物科技公司提供；水楊酸，天津市大茂化學(xué)試劑廠提供；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na），南京化學(xué)試劑公司提供。

HH-4型恒溫水浴鍋，上海新諾儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；XW-80A型旋渦混合器，寧波新芝生物科技有限公司產(chǎn)品；UV-1800型紫外/可見分光光度計(jì)，日本島津公司產(chǎn)品；THZ-C型臺式恒溫振蕩器，常州市中貝儀器有限公司產(chǎn)品；ME104E型電子分析天平，梅特勒拖利多國際貿(mào)易有限公司產(chǎn)品。

2 試驗(yàn)方法

2.1 茶粉提取液的制備

分別稱取粉碎后的新老海南苦丁茶茶粉各3.00 g，加入30 mL蒸餾水，于80℃條件下浸提20 min，重復(fù)3次，提取液用100目紗布過濾，然后用蒸餾水定容至100 mL備用。

2.2 DPPH自由基清除能力法（DPPH）[7]

取0.1 mmol/L的DPPH溶液3 mL，分別加入1mL稀釋至不同濃度的茶提取液，旋渦混勻，于常溫避光處靜置30 min，以無水乙醇調(diào)零，于517 nm波長處測定吸光度（Asample）。另外，對照組用無水乙醇充當(dāng)樣品溶液，于517 nm處測定吸光度（Acontro）l；陽性對照使用抗氧化作用明顯的VC溶液。DPPH自由基清除率的計(jì)算公式如公式（1）所示：

2.3 羥自由基清除法（HRSA）[8]

取9 mmol/LFeSO4溶液1.5 mL，9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1.5 mL和苦丁茶茶粉浸提稀釋液1.5 mL，旋渦混勻后，加入8.8 mmol/L H2O2溶液1.5 mL啟動(dòng)反應(yīng)。混勻后，在37℃條件下水浴60 min，以蒸餾水代替水楊酸-乙醇溶液為樣品調(diào)零，于510 nm波長處測定吸光度（A）x，用蒸餾水做空白對照組，在510 nm波長處測定吸光度（A）0。羥基自由基清除率計(jì)算公式如公式（2）所示：

2.4 金屬離子螯合能力法（MCC）[9]

取1 mL苦丁茶茶粉浸提稀釋液，依次加入蒸餾水2.7 mL和2.0 mmol/L的FeCl2溶液100 μL，混合均勻，加入5.0 mmol/L的菲啰嗪溶液200 μL，靜置10 min，以等量蒸餾水代替FeCl2溶液和菲啰嗪溶液作為空白調(diào)零，于562 nm波長處測定吸光度（A）?？瞻讓φ战M以等量蒸餾水代替苦丁茶浸提液，測定吸光度（A）0。以EDTA鈉鹽作為陽性對照，金屬離子螯合能力計(jì)算公式如公式（3）所示：

2.5 半數(shù)清除率（IC5）0的計(jì)算

以樣品濃度和相應(yīng)的自由基清除率作圖并進(jìn)行線性擬合，得到線性回歸方程，根據(jù)方程計(jì)算清除50%自由基時(shí)所需樣品質(zhì)量濃度（μgDM/mL或mgDM/mL），即 IC50值[10]。

3 結(jié)果與分析

3.1 新老海南苦丁茶提取液DPPH自由基清除能力比較分析

DPPH自由基清除法的原理是基于電子轉(zhuǎn)移，DPPH的醇溶液呈紫色，當(dāng)有抗氧化物質(zhì)存在時(shí)，DPPH溶液與抗氧化物質(zhì)反應(yīng)，使得DPPH溶液顏色變淺，可用分光光度計(jì)進(jìn)行測定分析。

新老海南苦丁茶提取液DPPH自由基清除的IC50值見表1，新老海南苦丁茶對DPPH自由基的清除能力與質(zhì)量濃度的關(guān)系見圖1。

表1 新老海南苦丁茶提取液DPPH自由基清除的IC50值

圖1 新老海南苦丁茶對DPPH自由基的清除能力與質(zhì)量濃度的關(guān)系

由表1和圖1可知，在0.2～0.7 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，海南苦丁茶提取液質(zhì)量濃度與其對DPPH自由基的清除作用存在線性關(guān)系，新茶和老茶對DPPH自由基的清除能力有所不同，新茶提取液對DPPH自由基的清除能力要強(qiáng)于老茶，但均低于VC清除DPPH自由基的能力。

海南苦丁茶的新茶及老茶的水提取液均對DPPH自由基有一定的清除能力，在0.2～0.7 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，海南苦丁茶對于DPPH自由基的清除能力與質(zhì)量濃度有一定成正比的線性關(guān)系，其中新茶的提取液對于DPPH自由基的清除能力要強(qiáng)于老茶，但均低于VC清除DPPH自由基的能力。

3.2 新老海南苦丁茶提取液對羥自由基清除能力比較分析

羥自由基清除法的原理是基于活性氧的清除能力。水楊酸能捕獲羥自由基產(chǎn)生一種有色物質(zhì)，這種物質(zhì)能在510 nm紫外光下出現(xiàn)吸收峰，抗氧化劑會與羥自由基競爭結(jié)合，從而降低有色物質(zhì)的生成，吸光度也會因此有所降低。

新老海南苦丁茶提取液羥基自由基清除的IC50值見表2，新老海南苦丁茶提取液羥基自由基除能力與質(zhì)量濃度的關(guān)系見圖2。

IC50值越小，說明茶提取液對羥基自由基的清除能力越高。

由表2和圖2可知，海南苦丁茶的新茶和老茶均對羥自由基有一定清除能力，且新茶的清除能力要高于老茶。此外，與甘露醇（1.8 mg/mL）和苯甲酸（0.5 mg/mL）這2種公認(rèn)的羥自由基清除劑相比[11]，新茶和老茶的清除效果與苯甲酸相當(dāng)且顯著高于甘露醇。

3.3 新老海南苦丁茶提取液對金屬離子螯合能力的比較分析

MCC法的原理是通過測定植物對鐵離子的螯合能力間接反映物質(zhì)抗氧化能力[12]；螯合能力越強(qiáng)，說明物質(zhì)的抗氧化能力越強(qiáng)。

新老海南苦丁茶提取液金屬離子螯合率的IC50值見表3，新老海南苦丁茶對金屬離子螯合率與質(zhì)量濃度的關(guān)系見圖3。

表2 新老海南苦丁茶提取液羥基自由基清除的IC50值

圖2 新老海南苦丁茶提取液羥基自由基除能力與質(zhì)量濃度的關(guān)系

表3 新老海南苦丁茶提取液金屬離子螯合率的IC50值

圖3 新老海南苦丁茶對金屬離子螯合率與質(zhì)量濃度的關(guān)系

由表3和圖3可知，海南苦丁茶提取液對Fe2+的螯合能力與其質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)存在線性相關(guān)性，且同質(zhì)量濃度下，新茶對Fe2+的螯合能力略強(qiáng)于老茶，不過它們均遠(yuǎn)弱于公認(rèn)的金屬離子螯合劑EDTA-2Na。此外，MCC法中海南苦丁茶提取液的用量遠(yuǎn)高于DPPH法和HRSA法，表明金屬離子螯合并非茶提取液抗氧化的主要途徑。

4 結(jié)語

試驗(yàn)表明，海南苦丁茶具有較強(qiáng)的抗氧化能力，且新茶的抗氧化能力普遍強(qiáng)于老茶。新茶的DPPH自由基清除能力比VC稍弱。此外，苦丁茶羥自由基清除效果與甘露醇和苯甲酸這2種公認(rèn)的羥自由基清除劑相比，明顯高于甘露醇，與苯甲酸相當(dāng)。

目前，苦丁茶的研究還多集中在營養(yǎng)成分的測定上，對于其保健功能及保健機(jī)理的研究有待于進(jìn)一步挖掘，同時(shí)對于海南苦丁茶的各種功能性成分的提取，苦丁茶保健產(chǎn)品的研制方面也可以多做探索。

[1]徐小靜，郭志永，劉越.苦丁茶植物資源及分子鑒定研究進(jìn)展 [J].中央民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，21（3）：22-28.

[2]易帆，彭勇，劉利嘉，等.大葉苦丁茶的研究進(jìn)展 [J].中國現(xiàn)代中藥，2013，15（8）：710-717.

[3]易帆，彭勇，劉利嘉，等.小葉苦丁茶的研究進(jìn)展 [J].中國現(xiàn)代中藥，2013，15（10）：906-912.

[4]李遠(yuǎn)志，李鴻武，陳汝筑，等.苦丁茶的保健作用與開發(fā) [J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，17（1）：108-111.

[5]Li Li，Xu Li，Ma Gui，et al.The large-leaved kudingcha（Ilex latifolia thunb and Ilex kudingcha C.J.Tseng）：a traditional Chinese tea with plentiful secondary metabolites and potential biological activities[J].Journal of Natural Medicines，2013，67 （3）：425.

[6]Jia-Le Song，Yu Qian，Gui-Jie Li，et al.Anti-inflammatory effects of kudingcha methanol extract（Ilex kudingcha C.J.Tseng）in dextran sulfate sodium-induced ulcerative colitis[J].Published Online on：Wednesday，2013 （8）：1 256-1 262.

[7]Chen J.J.，Zhang T.，Jiang B.，et al.Characterization and antioxidant activity of Ginkgo biloba exocarp polysaccharides[J].Carbohydrate Polymers，2012 （1）：40-45.

[8]陳留勇，孟憲軍，賈薇，等.黃桃水溶性多糖的抗腫瘤作用及清除自由基、提高免疫活性研究 [J].食品科學(xué)，2004，25 （2）：167-170.

[9]Wang X.S.，Tang C.H.，Chen L.，et al.Characterization and antioxidant properties of hemp protein hydrolysates obtained with NeutraseR[J].Food Technology and Biotechnology，2009，47 （4）：428-434.

[10]劉淑敏.不同茶葉浸提液及茶多酚的生物活性和機(jī)理研究 [D].廣州：華南理工大學(xué)，2016.

[11]秦德安，蘇丹，王曉玲.橙皮苷對羥自由基的清除作用 [J].中國藥學(xué)雜志，1996，31（7）：12-14.

[12]Gül In L.Antioxidant activity of caffeic acid （3,4-dihydroxycinnamic acid） [J].Toxicology，2006 （2/3）：213-220.◇

Studyon Antioxidant Activities ofWater Extract fromHainan I.Latifolia

FAN Weiwei1，CHEN Jie2，HUANG Cun2，*HUANG Huihua2
（1.Sanya Aviation and Tourism College，Sanya，Hainan 572000，China；2.School of Food Science and Engineering，South China University of Technology，Guangzhou，Guangdong 510000，China）

The antioxidant activities of Hainan I.latifolia extract were determined by DPPH radical scavenging assay （DPPH），hydroxyl radical scavenging assay（HRSA） and metal ion chelating ability assay（MCC） .The results showed that Hainan I.latifolia extract has obvious antioxidant activities.The antioxidant activity increased with the increase of the concentration of the extract.The antioxidant ability of new leaves was generally higher than the old leaves.

Hainan I.latifolia；extract；antioxidant activities

R284

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.12.034

1671-9646（2017） 12b-0026-03

2017-10-10

海南省三亞市院地科技合作項(xiàng)目“海南苦丁茶資源保健功能及活性成分的研究”（2014YD53）。

樊偉偉（1982— ），女，碩士，講師，研究方向?yàn)槭称芳庸づc分離技術(shù)。

*通訊作者：黃惠華（1959— ），男，博士，教授，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏、食品科學(xué)與工程、天然活性產(chǎn)物的分離、食品生物技術(shù)。