封雍婕 鄭鑫 楊福民 杜麗琨 邱雪琳 秦玥 夏烈文

摘 要：利用預(yù)先堆肥的方式富集耐受雙甘膦微生物，進而篩選出能降解雙甘膦的細菌并研究其降解效果，為處理含雙甘膦廢棄物提供依據(jù)。結(jié)果表明，篩選得到的微生物具有降解雙甘膦能力，降解產(chǎn)物主要為無機磷酸鹽。

關(guān)鍵詞：雙甘膦； 降膦菌；磷酸鹽

1引言：

雙甘膦是廣泛使用的草甘膦除草劑IDA法生產(chǎn)過程中的中間體。雙甘膦生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的含雙甘膦廢棄物是草甘膦行業(yè)環(huán)保問題的重要關(guān)注內(nèi)容，目前主要采用物化方法進行處理。物化方法往往工藝條件苛刻、成要高昂、容易產(chǎn)生二次污染。微生物方法是廢水處理的常用手段，具有條件溫和、成要低廉的優(yōu)勢。研究微生物降解雙甘膦性能，對探索生化法處理雙甘膦廢水可能性具有重要意義。

2實驗部分：

2.1材料

雙甘膦（含量≥98%）取自草甘膦企業(yè)生產(chǎn)車間，菌種來源為城市下水道泥與景觀闊葉林落葉、果皮、雙甘膦混合物長期培養(yǎng)所得土樣。

培養(yǎng)基的配制。

基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基：稱取2.00g （NH4）2SO4、0.20g MgSO4·7H2O、0.60g NaH2PO4·2H2O、0.65g K2HPO4·3H2O、0.64g CaCl2、3.00g雙甘膦加水攪拌溶解，調(diào)節(jié)pH 7。121℃滅菌20分鐘后備用。得到含磷源基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基，同樣方法，但以NaCl和KCl代替NaH2PO4·2H2O和g K2HPO4·3H2O，得到不含磷源基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基。

平板固體培養(yǎng)基：

基礎(chǔ)鹽平板固體培養(yǎng)基：按含磷基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基比例加入無機鹽和水，溶解扣按2%wt加入瓊脂粉，加熱攪拌使其溶解，定容至1000mL。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：稱取3g牛肉膏、10g蛋白胨、15gNaCl、20g瓊脂粉加水攪拌溶解，調(diào)節(jié)pH 7，定容至1000mL。

培養(yǎng)基在高壓蒸汽滅菌鍋中121℃滅菌20分鐘，冷卻至50℃左右，無菌條件下倒入培養(yǎng)皿中，完全凝固并冷卻后分別得到基礎(chǔ)鹽平板固體培養(yǎng)基和牛肉蛋白胨平板固體培養(yǎng)基。

2.2實驗方法

微生物的采集、富集培養(yǎng)與馴化。

稱取10g土樣，加50mL水攪拌均勻，放置幾小時后取上清液用無菌水稀釋后作為原始菌種。用移液槍移取稀釋度10-1～10-5的菌液0.2mL至基礎(chǔ)鹽平板固體培養(yǎng)基上并涂布均勻，倒置，35℃恒溫培養(yǎng)72h。

無菌條件下，用接種環(huán)從上述平板培養(yǎng)基中挑取一個單菌落利用平板劃線法接種于同種基礎(chǔ)鹽平板固體培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)對菌落進行一次純化。反復(fù)純化兩次，得到一株生長形態(tài)均勻的菌株R，并用基礎(chǔ)鹽平板固體培養(yǎng)基斜面劃線保存?zhèn)溆?。挑取單個菌落并用平板劃線法接種于牛肉膏蛋白胨平板固體培養(yǎng)基中進行擴增。

降解菌對雙甘膦的降解性能測定。

3結(jié)果與討論

3.1雙甘膦降解菌的生長狀況

土樣中部分微生物具有雙甘膦耐受性。微生物篩選過程中在平板固體培養(yǎng)基上的生長狀況如圖1所示。菌株為灰白色、菌落較小、干燥、呈扁平狀、邊緣不整齊圓形等。篩選過程中發(fā)現(xiàn)，稀釋梯度為10-3的原始菌種在基礎(chǔ)鹽平板固體培養(yǎng)基中長出的微生物適合微生物篩選。

3.2 培養(yǎng)液中雙甘膦的變化

篩選得到的菌種在含3g/L雙甘膦的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中對雙甘膦的降解情況如圖2所示。在最初三天內(nèi)雙甘膦降解很快，三天過后雙甘膦降解率緩慢增加。這是因為培養(yǎng)前3d該菌種R生長情況達到對數(shù)生長期，在該段時間內(nèi)菌種R對碳源需求較大，使雙甘膦的降解效率達到了近30%。隨著時間的延長，菌株R處于穩(wěn)定期并逐漸衰亡，故第3～9d降解率增長較慢。培養(yǎng)九天后液體培養(yǎng)基變得渾濁，雙甘膦不再降解，微生物基本死亡。

通過對含無機磷源和不含無機磷源的培養(yǎng)液的測定，發(fā)現(xiàn)該菌株對含有無機磷源的培養(yǎng)液中雙甘膦的降解效果更好，但二者的降解效果相差不大，即該菌種R生長過程中對無機磷源的需求不高，但少量的無機磷源有助于菌種在培養(yǎng)最初階段的生長。

3.3培養(yǎng)液中總磷變化

篩選得到的雙甘膦降解菌在3g/L的無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，總磷的變化見表1。在雙甘膦降解菌培養(yǎng)過程中，總磷濃度先減小，然后增加，但變化幅度不大。

3.4培養(yǎng)液中無機磷的變化

3g/L的雙甘膦培養(yǎng)基中無機磷的變化見表2。含磷源培養(yǎng)液中無機磷含量隨降膦菌培養(yǎng)時間增加而增加，不含磷源的培養(yǎng)液中無機磷含量在前6d檢測不出，在第9d時檢測出有無機磷。兩種培養(yǎng)液中雙甘膦降解菌均能將雙甘膦降解為無機磷，但含磷源培養(yǎng)液中雙甘膦轉(zhuǎn)化為無機磷的量更大，說明培養(yǎng)初期降解菌所需要的磷營養(yǎng)由培養(yǎng)液中磷酸鹽提供更有利于雙甘膦降解菌生長，不含磷源的培養(yǎng)液中雙甘膦降解菌在最初6天中生長緩慢，檢測不出降解產(chǎn)物無機磷。

4結(jié)論

采用雙甘膦為唯一磷源的平板固體培養(yǎng)基篩選方法，分離、純化得到的具有雙甘膦降解性能的菌株R。菌株在雙甘膦為唯一碳源和唯一磷源/唯一磷源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中均能對雙甘膦進行降解，并部分轉(zhuǎn)化為無機磷。但是在實驗培養(yǎng)期內(nèi)，雙甘膦降解率較低，且大部分雙甘膦未被降解或者沒有完全直接降解成無機磷而是被轉(zhuǎn)化成其他形態(tài)的有機磷。

參考文獻：

[1] 周海云，劉樹洋，徐寧，姜偉立，公彥猛，黃瑞琦. 雙甘膦廢水的濕式氧化處理。農(nóng)藥.2017， 17，56（1）： 23-27

[2]金瀟，顏冬云，秦文秀。有機磷農(nóng)藥的微生物降解技術(shù).湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（09）： 93-97

[3] 全鑫， 周春雨， 范婕妤， 等. 草甘膦高效降解菌的篩選鑒定及降解特性研究[J]. 四川大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2010， 47（4）： 921-925.