孫錄，胡文忠，劉程惠，李慧，陳妍竹，付喜慶，莫俊輝

(大連民族大學 生命科學學院，遼寧 大連，116600)

透射電鏡技術在果蔬保鮮方面的應用

孫錄，胡文忠*，劉程惠，李慧，陳妍竹，付喜慶，莫俊輝

(大連民族大學 生命科學學院，遼寧 大連，116600)

透射電鏡技術可觀察到小于0.2μm的細胞的超微結構，從而可在分子層面對果蔬樣品進行更深入的研究。該文介紹了透射電鏡技術的工作原理和發(fā)展史，綜合論述了透射電鏡技術在確定果蔬的最佳采摘期、采后貯藏條件以及選擇適宜的保鮮方法等方面的應用現(xiàn)狀，最后對透射電鏡技術在果蔬保鮮及相關研究的應用前景進行了展望，以期透射電鏡技術可以在果蔬保鮮方面能得到更廣泛的應用。

透射電鏡技術；超微結構；果蔬；保鮮

透射式電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)是以波長極短的電子束作為照明源，用電磁透鏡聚焦成像的一種高分辨率、高放大倍率的電子光學儀器[1]，可用來觀察分析樣品的超微結構。透射電鏡技術最早應用于醫(yī)學方面，主要觀察一些病理切片，從而進行病理變化分析[2]。隨著現(xiàn)代科技水平的日新月異，透射電鏡技術也在不斷改進，使得它在物理材料學、植物生物細胞學都有廣泛的應用，例如用透射電鏡觀察新型納米材料的微觀結構[3]和觀察植物的生長發(fā)育機理，遺傳進化等方面。近些年透射電鏡技術也逐漸應用于果蔬貯藏及保鮮方面的研究，主要用來觀察果蔬在采收、貯藏期間超微結構的變化和不同保鮮技術處理對果蔬超微結構的影響，來輔助研究果蔬的最佳采摘期、最佳貯藏條件以及適合的保鮮技術，本文主要針對這幾方面進行了綜合論述。

1 透射電鏡技術原理及發(fā)展史

透射電鏡成像是通過電子槍發(fā)出高速電子束經聚光鏡均勻照射到樣品上，入射電子與樣品會發(fā)生碰撞與非彈性碰撞，形成彈性散射電子、損失電子和吸收電子，之后產生的光波再發(fā)生干涉和衍射作用，使均勻的入射電子束與樣品作用后變得不均勻，再依次經過物鏡、中間鏡和投影鏡放大后在熒光屏上或膠片上呈現(xiàn)出圖像，反映出樣品信息[4]。1932，德國人KNOLL和RUSKA發(fā)明了第一臺透射電子顯微鏡，雖然只能放大12倍，但足以驗證以電子束和電子透鏡組成的光學系統(tǒng)可以像光學顯微鏡一樣將物體放大成像，而如今透射電鏡可放大幾萬至百萬倍，隨著科技的不斷發(fā)展，透射電子顯微鏡分辨率逐漸提高，功能愈加豐富，從20世紀80年代透射電鏡的分辨率已優(yōu)于0.3nm，到目前為止透射電子顯微鏡的分辨率已經達到1.5～2埃[5]。

2 透射電鏡在果蔬保鮮中的應用

2.1 透射電鏡在確定果蔬最佳采收期中的應用

果蔬的采收工作十分重要，它不僅是果樹栽培的最后環(huán)節(jié)，同時也是商品化處理的最初環(huán)節(jié)。適宜的采收期不僅使果蔬具有最佳的色、香、味，同時也使它維持較長的貨架期[6]，采收的過早、過晚都會影響果蔬采后的品質，造成貯藏中的生理病害，使貯藏期縮短，影響商品價值[7]。果蔬的成熟過程主要分為初期、中期和后期，通過透射電鏡觀察果蔬不同生長發(fā)育時期的超微結構，可以確定果蔬的成熟度，來輔助探究不同果蔬的最佳采收期。李銀[8]通過透射電鏡觀察蟠桃果實在發(fā)育成熟過程中的不同時期發(fā)現(xiàn)在發(fā)育初期果肉細胞排列整齊，細胞壁厚度均勻一致，結構完整；在蟠桃果實生長發(fā)育后期，果肉細胞明顯增大，并且細胞壁現(xiàn)明-暗-明區(qū)域結構不明顯，中膠層分解，很難觀察到完整的葉綠體和線粒體，說明果實已完全成熟，可以據此來掌握蟠桃最適宜的采收期，增加果蔬的耐貯性。楊國慧[9]使用透射電鏡觀察樹莓不同發(fā)育期果實的超微結構，發(fā)現(xiàn)樹莓果實在發(fā)育后期細胞壁扭曲變形并出現(xiàn)嚴重的質壁分離。表1總結了通過透射電鏡觀察到的市面上常見的5種水果在不同發(fā)育時期的細胞壁超微結構的變化。

表1 5種水果成熟時期細胞壁的超微結構Table 1 The cell wall ultrastructure of five kinds of fruit mature period

由表1可見，5種市售常見水果在不同的發(fā)育期細胞壁有很大的變化，在發(fā)育初期細胞壁細胞排列緊密，而中期時胞間出現(xiàn)空隙，而在后期胞內結構破壞，胞間層消失。可以通過水果在不同時期細胞壁的超微結構變化，確定它們所處的生長發(fā)育期，從而進一步確定水果的最佳采摘期。王志坤等[16]用透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)黃瓜果皮細胞壁的變化也遵從水果發(fā)育時期細胞壁的變化趨勢，都是初期排列緊密，隨后中期結構松散，最后胞壁質壁分離出現(xiàn)解體。目前，透射電鏡技術用來觀察水果的不同生長發(fā)育時期的研究較多，而觀察蔬菜類的有關生長發(fā)育時期的相關研究較少，因此，未來可以用透射電鏡探究蔬菜類生長發(fā)育不同時期的超微結構，以便更好的探究蔬菜的最佳采摘期。

2.2 透射電鏡在確定果蔬最佳貯藏條件的應用

果蔬在采后仍保持鮮活狀態(tài)，會進行休眠、水分蒸發(fā)和呼吸作用等，這些活動與果蔬的貯藏有著密切關系。影響果蔬新陳代謝和貨架期的主要因素為貯藏的溫度、濕度和氣體[17]。由于果蔬呼吸作用旺盛，常溫貯藏，易發(fā)生軟化變質[18]，因此目前常采用低溫貯藏來減緩采后果蔬的生理代謝并抑制微生物的生長，延長果蔬的貯藏期[19]。但是，有些果蔬在較冷的環(huán)境貯藏較長時間后，像桃[20]、茄子[21]、黃瓜[22]等，可能會受到冷害，果實表面會出現(xiàn)燙傷水漬狀斑點，影響果實的色澤，導致口感風味變差，并且容易受到病菌侵染出現(xiàn)腐爛，這些都會影響它們的貨架期[20-23]。KRATCH[24]等的通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，有些冷敏感果蔬受到低溫脅迫時，葉綠體會首先發(fā)生，膨脹變形，嚴重低溫脅迫時，細胞會死亡。曾愛松等[25]用透射電鏡觀察低溫貯藏下的甘藍葉片，發(fā)現(xiàn)在5 ℃低溫貯藏時，甘藍葉片細胞完整，排列有序，葉綠體、線粒體清晰可見，2 ℃低溫貯藏時細胞結構較為完整，葉綠體排列整齊，線粒體部分變形，而在-2 ℃時，細胞結構遭到嚴重破壞，葉綠體不完整，線粒體也多數變形扭曲。由此可見，用透射電鏡觀察果蔬在脅迫冷害后超微結構的變化，能夠確定最低貯藏溫度，預防冷害發(fā)生。陳國剛等[26]通過透射電鏡分析得出，庫爾勒香梨表皮銹斑與氣調貯藏(CA)環(huán)境濕度呈正相關。透射電鏡技術用于果蔬冷害方面的研究比較多，而在氣體和濕度方面的研究相對較少，以后可增加在這兩方面的研究，以確保在貯藏期保持果蔬最好的新鮮度，達到延長果蔬貯藏期的效果。

2.3 透射電鏡在確定果蔬適宜化學保鮮劑

化學保鮮是利用化學藥劑涂抹或噴灑在果蔬表面，或置于果蔬貯藏間[27]，而達到對果蔬的保鮮效果，因其投資少、節(jié)能和簡便等而被廣泛應用于采后果蔬的保鮮[28]，透射電鏡常用來輔助研究保鮮劑的保鮮效果和殺菌機制。MENG[29]等用外源水楊酸甲酯(MeSA)處理貯藏期的桃果實，發(fā)現(xiàn)MeSA可能是通過調控細胞壁的降解和細胞壁中的鈣含量來提高果實對低溫的抗性。ALANDES[30]CaCl2作為保鮮劑處理鮮切的梨，并用透射電鏡觀察處理前與處理后的梨的超微結構的變化，發(fā)現(xiàn)鮮切梨在存儲3周后，用透射電鏡觀察其果實結構，未經處理的梨組織細胞出現(xiàn)明顯質壁分離的現(xiàn)象，而經過CaCl2處理的梨的質膜還在細胞壁附近，通過運用透射電鏡技術的觀察更進一步驗證了CaCl2對鮮切梨有一定的保鮮作用。朱璇等[31]用水楊酸(SA)處理在冷藏條件下的杏果實，在0 ℃貯藏28 d后，用透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)SA處理的杏果實細胞排列整齊，細胞壁厚度均勻，而未處理的杏果實的細胞間隙較大，細胞壁嚴重變形，而透射電鏡觀察的超微結構可說明細胞壁和類細胞器的破壞是果實發(fā)生冷害的微觀表現(xiàn)，也可進一步說明SA能維持細胞壁、葉綠體等細胞器的完整性，從而達到對果蔬的保鮮作用。通過透射電鏡觀察，果蔬在保鮮劑處理前后的超微結構發(fā)現(xiàn)，經保鮮劑處理的果蔬的細胞內含物與細胞壁更加完整，這些都進一步闡明了保鮮劑的保鮮效果。

2.4 透射電鏡在果蔬的其他保鮮方法中的應用

生物防治(biological control)是利用微生物之間的拮抗作用，用對寄主不造成傷害的但同時對病原菌致病力有明顯抑制作用的微生物來防治寄主病害的一種新興有效方法，已達到延長采后水果貯藏期的效果[32]。拓寧[33]等曾用立枯絲核菌侵染馬鈴薯莖基部細胞，用透射電鏡觀察其侵染前與侵染后的超微結構，發(fā)現(xiàn)在菌絲侵染前，細胞結構清晰可見，細胞壁完整，但菌絲侵染后，馬鈴薯基部細胞發(fā)生了明顯變化，細胞壁形態(tài)發(fā)生了改變，可見其菌絲是通過先破壞植物組織細胞壁的結構，然后導致其馬鈴薯染病。所以可以通過觀察其侵染后的馬鈴薯組織細胞來探索其染病的機理，從而根本上進行防治。

物理保鮮技術因其無污染，不破壞食品營養(yǎng)結構的優(yōu)點，已被廣泛應用于果蔬貯藏與保鮮，常見的應用于果蔬保鮮的物理技術有微波、輻射和超高壓等[34]。段學武等[35]用透射電鏡觀察經高氧處理貯藏4 d后的荔枝果實，通過觀察果皮的超微結構發(fā)現(xiàn)細胞內含物清晰可見，線粒體、葉綠體和液泡等結構完整。對比未經處理果實的超微結構發(fā)現(xiàn)沒有完整的細胞器存在，并且出現(xiàn)了質壁分離的現(xiàn)象。GMEZ[36]實驗研究得出，經過透射電鏡的觀察，經過一段時間的貯藏，用脈沖光(PL)處理過的鮮切蘋果，其細胞壁的電子密度明顯高于未經PL處理過的鮮切蘋果。文穎強等[37]用透射電鏡觀察經熱處理后的梨棗果肉的超微結構發(fā)現(xiàn)，與對照相比較發(fā)現(xiàn)，熱處理減緩了梨棗果肉薄壁細胞和細胞器的降解，維持了梨棗細胞的的正常代謝活動，從而延長了其貨架期。透射電鏡可觀察在一定物理處理下對一些果蔬的超微結構的影響，輔助說明物理處理對果蔬的保鮮作用。

3 前景展望

用透射電鏡技術可有助于確定果蔬的最佳采摘期和適宜的貯藏環(huán)境和保鮮技術，減少果蔬在貯藏、運輸和銷售環(huán)節(jié)中出現(xiàn)從根本上抑制果蔬在采收、貯藏過程和保鮮方面中出現(xiàn)的腐敗變質現(xiàn)象，從而到達延長果蔬的貨架期的目的。透射電鏡對植物組織進行觀察時，由于切片的制作存在一定的偶然性，所以要大批量重復操作，以確保制作的超薄切片的有效性。并且，在使用透射電鏡觀察樣品之前，研究者應該熟悉掌握所觀察樣品組織細胞的信息，在未來，隨著制片技術經驗的不斷豐富，透射電鏡技術的日益發(fā)展，會更有效地觀察到待測樣品的超微結構，提供更多有用的信息。透射電鏡技術在植物科學研究方面都可以提供一定的理論依據，可以通過觀察植物樣品的超微結構來探究其成熟度，也可以觀察植物衰老機理，從而采用一定的保鮮劑從根本上延緩果蔬衰老。通過透射電鏡技術觀察植物組織的超微結構所提供的信息，可以培育出更新的品種，具有更好的耐性。在果蔬保鮮方面，也可以充分利用透射電鏡技術，觀察果蔬組織的超微結構，在亞細胞水平觀察細胞壁、細胞膜和各種細胞器的形態(tài)結構，可結合免疫標記、酶細胞化學定位、能譜化學定位、能譜分析可進行細胞組成特定物質，如蛋白質、酶等分布的研究物質半定量分析[32]。

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Transmissionelectronmicroscopy(TEM)technologyintheapplicationforfruitsandvegetables

SUN Lu,HU Wen-zhong*,LIU Cheng-hui，LI Hui，CHNE Yan-zhu， FU Xi-qing，MO Jun-hui

(College of Life Science,Dalian Minzu University,Dalian 116600,China)

Transmission electron microscopy (TEM) can observe ultrastructure of less than 0.2μm cell,consequently this technology can conduct the more in-depth research of the fruit and vegetables amples at the molecular level.The paper introduces the working principle and the history of transmission electron microscopy (TEM) technology,and also comprehensively discusses the experimental conditions the best harvest of fruit,the postharvest storage condition and appropriate preservation methods determined by TEM technology.The application prospect of TEM technology used in fresh-keeping and related research is also discussed.TEM technology will get more extensive application in fruits and vegetables preservation.

TEM technology； ultrastructure； fruit and vegetable； fresh-keeping

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.011539

碩士研究生(胡文忠教授為通訊作者，E-mail：hwz@dlnu.edu.cn)。

“十三五”國家重點研發(fā)計劃項目(2016YFD0400903)；國家自然科學基金項目(31471923)；中央高校自主科研基金青年項目(DC201502020402)

2016-03-29，改回日期：2017-09-13