茍珍瓊，蘭洋，鄭韻，劉衛(wèi)，董全*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 2(重慶工商大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，重慶，400067)

ELISA法快速檢測食品中重金屬含量的研究進展

茍珍瓊1,2，蘭洋1，鄭韻1，劉衛(wèi)1，董全1*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 2(重慶工商大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，重慶，400067)

重金屬超標會對人體健康產(chǎn)生極大危害，世界各國日漸重視食品中重金屬的限量標準，同時對重金屬分析檢測方法的研究也越來越多。傳統(tǒng)的重金屬檢測方法比較成熟，靈敏度高，但操作繁瑣、費用高昂、依賴大型儀器設(shè)備以及需要專業(yè)技術(shù)人員操作等。酶聯(lián)免疫(enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA)法是一種特異性強、靈敏度高的檢測方法，并能用于現(xiàn)場快速檢測，故得以迅速發(fā)展。ELISA法檢測重金屬主要包括四大關(guān)鍵步驟：樣品前處理、人工抗原的合成、特異性抗體的制備、ELISA方法的選擇。該文主要綜述了ELISA法在檢測重金屬方面的最新研究成果，并對該檢測技術(shù)的研究方向進行了展望。

酶聯(lián)免疫；樣品前處理；人工抗原；抗體；間接競爭法

比重大于4.5的金屬被稱為重金屬，如鉻(Cr)、鉛(Pb)、鎘(Cd)、砷(As)、汞(Hg)、銅(Cu)等，它們往往在動物和植物體內(nèi)不斷積聚，再經(jīng)由食物鏈富集，最后進入人體并在人體內(nèi)與蛋白質(zhì)及酶等發(fā)生強烈的相互作用，使它們失去活性，從而危害人體健康[1-2]。我國食品中重金屬超標問題也時有發(fā)生，楊麗萍[3]等發(fā)現(xiàn)，山東省境內(nèi)集市肉兔肌肉組織的鉛含量為0.12 mg/kg，超過我國限量標準(0.1 mg/kg)；高彭[4]等連續(xù)7年對北京市順義區(qū)的豬腎的重金屬鎘殘留進行監(jiān)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬腎中鎘含量明顯高于肝臟。此外，水產(chǎn)品、海產(chǎn)品、水果、蔬菜以及糧食等均存在重金屬超標的現(xiàn)象[5-6]。目前，重金屬檢測已成為食品安全檢測的一項重要內(nèi)容。

傳統(tǒng)的重金屬檢測方法有很多，例如原子吸收分光光度法(AAS)、高效液相色譜法(HPLC)、原子熒光分光光度法(AFS)、電感藕合等離子體法(ICP)等[7-8]。電感藕合等離子體法又分為電感藕合等離子質(zhì)譜法(ICP-MS)和電感藕合等離子原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)。經(jīng)過多年的發(fā)展，傳統(tǒng)的重金屬檢測方法已日趨成熟，例如HPLC靈敏度高、操作簡便、重復(fù)性好且可同時測定多種元素。但該方法檢測費用高，流動相消耗大且多數(shù)有毒，并且可供使用的結(jié)合劑有限，給該方法帶來了很多的局限性。這些傳統(tǒng)的重金屬檢測方法均有各自的優(yōu)點，也存在一些難以解決的問題：如有的方法儀器設(shè)備昂貴、專業(yè)技術(shù)要求高、難以應(yīng)用于現(xiàn)場實時快速檢測等[9-13]。

ELISA(enzyme-linked immune sorbent assay)廣泛用于食品、醫(yī)學(xué)檢測，近年來許多學(xué)者研究用于重金屬的檢測，自從酶聯(lián)免疫法(ELISA)首次被ENGVALL等[14]建立以來，與傳統(tǒng)檢測技術(shù)相比，有操作簡便、特異性強、靈敏度高、適用于現(xiàn)場檢測等優(yōu)點，因而 ELISA法在重金屬的檢測中得以快速發(fā)展。本文綜述了ELISA法在檢測重金屬方面的最新研究成果，主要包含以下4個方面的內(nèi)容：樣品前處理、人工抗原的合成、特異性抗體的制備以及ELISA方法的選擇，并對該檢測技術(shù)的研究方向進行了展望。

1 樣品前處理

隨著酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)在重金屬檢測上的快速發(fā)展，ELISA試劑盒的應(yīng)用解決了傳統(tǒng)檢測技術(shù)的一些弊端，現(xiàn)已成為了一種快速、簡便和可靠的檢測手段。ELISA檢測方法只能在液相環(huán)境中進行，即只能檢測離子態(tài)重金屬，而金屬往往以結(jié)合態(tài)存在于樣品中，因此需要通過前處理使樣品中待測的金屬離子釋放到液相檢測環(huán)境中，同時還可除去干擾因子避免對后續(xù)檢測結(jié)果的影響。故建立一套快速、精確、環(huán)保且適用于ELISA法檢測重金屬含量的樣品前處理的方法具有重要的意義。目前適用于ELISA法快速檢測食品中重金屬含量的樣品前處理方法主要有：濕式消化法、微波消解法、浸提法等[15-17]。

1.1 濕式消化法

濕式消化法是通過氧化性強酸如硝酸(HNO3)、高氯酸(HClO4)、硫酸(H2SO4)等，結(jié)合加熱來處理樣品使樣品中的金屬離子釋放出來。此方法對大多數(shù)樣品適用，但存在中間環(huán)節(jié)較多、耗時長的缺陷，樣品消化時會采用大量具有腐蝕性的強酸且有大量有害氣體釋放，對人體有害且污染環(huán)境。江麗芳[18]采用HNO3和HClO4預(yù)處理牛奶樣品，并進一步探究了消化液(HNO3-HClO4)的最優(yōu)處理條件，實驗發(fā)現(xiàn)HNO3-HClO4(體積比5∶1)消化液的空白吸光度相對較低，故HNO3-HClO4最優(yōu)比例是5∶1(體積比)。

1.2 微波消解法

微波消解法是利用微波的激活以及穿透能力，同時采用密封裝置(多是消解罐)，并加入適量的酸，例如HNO3、H2O2等，從而讓金屬離子釋放出來。在本法中酸的選擇是特別重要的，胡進[12]等比較了HNO3、H2SO4、HCl等幾種酸對海帶中金屬離子的消解效果，發(fā)現(xiàn)使用HNO3的消解效果較好，HCl會引入氯離子，H2SO4會引入硫離子，均會與其他離子結(jié)合形成多原子離子從而影響測定，因此最終選用HNO3，并用智能加熱器120 ℃預(yù)消解10 min，再采用四步消解程序進行微波消解海帶樣品。為了防止消解罐壓力超過限制，同時又要確保樣品消解完全，需要在微波消解前進行預(yù)消解，除了前面提到的海帶，由于不同基質(zhì)的樣品需要預(yù)消解，當樣品量較大時，也同樣需要預(yù)消解。倪張林[19]等在對油茶籽油進行微波消解時，由于加入樣品量比較大，故先將樣品在電熱板上180 ℃預(yù)消解約2 h。微波消解法的消解程序根據(jù)食品基質(zhì)的差異和儀器的不同采用不同的壓力、溫度和時間條件，具體方式見表1。

表1 樣品前處理-微波消解法Table1 Sample pretreatment-microwave digestion methods

注：- .該文獻中未報道；消解程序中的時間均指保持時間。

丁仲仲[20]等比較了濕式消解和微波消解2種方法在處理壇紫菜中重金屬的優(yōu)劣，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與濕法消解法相比，微波消解法操作簡便、節(jié)約試劑、消解效果好等優(yōu)點。因此該方法是傳統(tǒng)處理重金屬含量檢測的最常用的前處理方法，但其仍然需要由專業(yè)人員在實驗室條件下進行操作，并且會使用一些腐蝕性強的濃酸(如濃HNO3)。

1.3 酸浸提法

酸浸提法通常是采用HCl、HNO3、H2SO4等稀酸直接浸提所需組分，在酸性條件下，使得金屬元素以離子態(tài)析出。程水清[23]等采用稀HCl和國標法(HNO3-HClO4消解)對蔬菜樣品中重金屬進行提取并測定其含量，研究發(fā)現(xiàn)，采用稀HCl消解所得的標準偏差明顯低于國標法(HNO3-HClO4消解)，再加上國標法浸提時間長且易污染，而稀酸浸提法高效、快速且操作簡便，說明稀酸浸提法的效果不僅可以達到要求，而且還優(yōu)于國標法。此外，汪慧[24]等采用3種不同的稀酸(HCl、H2SO4、HNO3)對易受重金屬污染的水產(chǎn)品(近江牡蠣、翡翠貽貝和基圍蝦)浸提，與微波消解樣品前處理的結(jié)果進行比較，發(fā)現(xiàn)稀HNO3的浸提效果比稀HCl和稀H2SO4的好，并進一步采用ELISA法對浸提液中鎘進行檢測，發(fā)現(xiàn)檢測結(jié)果與傳統(tǒng)方法ICP-AES檢測結(jié)果的線性相關(guān)性良好(98%)，表明對于檢測水產(chǎn)品中重金屬殘留時，稀酸浸提法完全可以達到ELISA法檢測重金屬的要求。

近年來，稀酸浸提法因其具有高效準確、操作簡單、費用低廉以及環(huán)境友好等優(yōu)點而在多種食品上均有應(yīng)用[23-25]，但仍有一些重金屬用稀酸浸提的效果差，只能進行初步篩選；隨著研究的不斷深入和技術(shù)的不斷進步，相信稀酸浸提法會逐漸成為ELISA法檢測重金屬樣品前處理的理想技術(shù)。

2 人工抗原的合成

由于重金屬離子自身為小分子物質(zhì)，無免疫原性，不能直接免疫動物產(chǎn)生特異性抗體，再加上金屬離子帶有電荷，會與動物體內(nèi)的生物分子反應(yīng)從而導(dǎo)致動物中毒。重金屬ELISA檢測技術(shù)以重金屬螯合物特異性抗體為基礎(chǔ)，然而特異性抗體的制備關(guān)鍵是要先合成優(yōu)質(zhì)的重金屬人工抗原。重金屬人工抗原的合成主要分為以下兩步：(1)制備重金屬螯合物，多是選擇與目標金屬具有高度親和性的螯合物制備重金屬螯合物；(2)偶聯(lián)載體蛋白，將第一步制備的重金屬螯合物與合適的載體蛋白偶聯(lián)，得到重金屬-螯合物-載體蛋白復(fù)合物即是免疫原。

不同離子的人工抗原所用的螯合劑、載體蛋白以及評定方法大體相似，但合成過程中選擇適宜的載體蛋白是很重要的，不同的載體蛋白將導(dǎo)致ELISA試劑盒不同的靈敏性。黃佳俊[26]等選用異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸(ITCBE)作為螯合物，并采用了2種載體蛋白鑰孔戚血藍素(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)，成功制備Hg2+抗原Hg-ITCBE-KLH、Hg-ITCBE-BSA，發(fā)現(xiàn)Hg-ITCBE-KLH(34.75%)的E-氨基的替換程度比Hg-ITCBE-BSA(40.61%)的低；這是由于KLH分子質(zhì)量較大且結(jié)構(gòu)比BSA復(fù)雜，由于空間阻礙有些E-氨基無法與螯合劑反應(yīng)，導(dǎo)致KLH的E-氨基的替換程度比BSA低，類似的情況也在Pb2+的人工抗原中發(fā)現(xiàn)[27]。同樣的金屬離子(Hg2+)以及載體蛋白BSA，選用不同的金屬螯合物獲得的抗原也不同，邢海波[28]等采用谷胱甘肽(GSH)金屬螯合劑，與BSA進行偶聯(lián)，獲得的抗原Hg-GSH-BSA中E-氨基的替換程度為59.70%，相對于黃佳俊等采用ITCBE制備的Hg-ITCBE-BSA(40.61%)，提高了將近20%。

目前常見雙功能螯合劑有GSH、乙二胺四乙酸(EDTA)、ITCBE、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)等，常見的載體蛋白有KLH、BSA、卵清蛋白(OVA)，常見的評定方法有二喹啉甲酸(BCA)法、SDS-PAGE電泳、三硝基苯磺酸法(TNBS)、考馬斯亮藍(Bradford)法石墨爐原子吸收光譜法(GFAAS)、紫外光譜掃描(UV)等方法，較多地評價指標是通過偶聯(lián)率(比)以及氨基的替換程度(見表2)。

表2 人工抗原的合成方法Table 2 Synthesis of artificial antigen

注：偶聯(lián)程度中%代表氨基的替換率，比例代表蛋白與免疫原中金屬的偶聯(lián)比。

3 特異性抗體的制備

ELISA法的檢測效果依賴于高效價和高特異性的抗體，抗體的制備又分為單克隆抗體和多克隆抗體的制備。REARDAN等[32]早在1985年首次采用金屬-螯合劑抗原制備出了單克隆抗體，為重金屬的檢測提供了一種重金屬免疫學(xué)檢測的新思路。易翠平[33]等以免疫抗原Cd-IEDTA-BSA注射小鼠，制備了Cd2+的單克隆抗體，效價達1∶51 200，親和常數(shù)4.55×108mol/L，特異性實驗表明特異性良好。方淑兵[34]等通過免疫新西蘭大白兔獲得Hg2+特異性抗體，除了與銅、鎳的交叉反應(yīng)率分別為13.5%、10.8%，并無與其他金屬離子有明顯的交叉反應(yīng)，證明抗體具有不錯的特異性。張鵬[35]通過小鼠腹腔注射，成功制備出親和常數(shù)均在108mol/L以上的鉛單克隆抗體，其血清效價均達1∶16 000。翟一凡[36]等采用合成的完全抗原(Pb-DTPA-OVA)免疫小鼠，制備出鉛的多克隆抗體，效價高達1∶400 000，大幅度提高了抗體的效價；特異性實驗表明，除了與Fe3+的交叉反應(yīng)率為5%以外，與其他重金屬離子的交叉反應(yīng)均低于1%。

4 ELISA法檢測重金屬常用方法

4.1 間接競爭法

間接競爭法的原理是待檢測樣品中的競爭物和重金屬完全抗原共同競爭結(jié)合單克隆抗體相同表位，通過酶標二抗孵育，底物顯色后可通過標準曲線得到待檢測樣品中的重金屬離子的濃度。該方法是最早使用的免疫學(xué)檢測方法，該方法比較成熟和完善，也是目前應(yīng)用最多的方法。隨著研究的深入，ELISA 法檢測重金屬樣品靈敏度已經(jīng)完全可以達到傳統(tǒng)的技術(shù)的水平，郭常偉[37]等制備重金屬銅離子單克隆抗體，并建立間接競爭ELISA 檢測方法，ELISA檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)單抗對Hg2+、Zn2+和Co2+的交叉反應(yīng)率分別為1.46、8.75、17.5%，并無與其他金屬離子有明顯的交叉反應(yīng)，IC50值為12.5 ng/mL，最低檢測限為2.0 ng/mL。并與ICP-AES 檢測結(jié)果進行比較，競爭ELISA法與ICP-AES法的總符合率超過94%，表明該法與ICP-AES法的檢測結(jié)果一致性較好。

4.2 直接競爭法

直接競爭法的原理與間接競爭法類似，該方法相對于間接競爭法來說，其無需加二抗，一方面降低了實驗成本、簡化了操作步驟；另一方面其檢測靈敏度高、特異性強。但該法較間接競爭法起步相對較晚，應(yīng)用沒有間接競爭法普遍。LIU[38]等采用直接競爭ELISA法檢測農(nóng)產(chǎn)品中Cd2+，IC50值為2.30 μg/L，檢測限為0.2 μg/L，并表現(xiàn)出高特異性，并且結(jié)果與GFAAS法的檢測結(jié)果的符合率高達99%，加之其簡便性和經(jīng)濟性，完全適用于農(nóng)產(chǎn)品中重金屬的檢測。LIU[39]等采用的直接競爭法檢測引用水和人體血清中的Cu2+，檢出限可以達到0.032 μg/mL，靈敏度IC50值為0.89 μg/mL，檢測范圍為0.25～8.13 μg/mL，與其他金屬的交叉反應(yīng)率均小于1%(除Hg2+7.19%外)，證明其專一性好，且與AAS法的檢測結(jié)果的符合率高達94%。

傳統(tǒng)重金屬檢測方法比較成熟，靈敏度高，但需要專業(yè)技術(shù)人員以及儀器設(shè)備較大、較笨重且成本高[40]，隨著研究的深入，ELISA法檢測重金屬樣品也日臻成熟，靈敏度多已達到ng至pg級水平，加之ELISA法檢測重金屬的方便性，該方法在很多方面已得到了廣泛應(yīng)用，常見的重金屬ELISA法檢測對比(見表3)。

表3 常見重金屬含量的ELISA法檢測Table 3 ELISA methods for detection of heavy metals

注：“-”表示該文獻中未報道。

5 結(jié)論與展望

ELISA法檢測重金屬存在檢測過程操作簡便、特異性強、靈敏度高且適用于現(xiàn)場檢測等優(yōu)點，是一種具有特異性強和靈敏度高的檢測方法。隨著研究的深入，ELISA 法檢測重金屬樣品已被廣泛應(yīng)用，但ELISA法在檢測重金屬含量時也存在一些不足，以后的研究可以考慮從以下幾方面深入：(1)進一步研究稀酸浸提法，保持其方便環(huán)保的同時，提高其對重金屬離子的浸提效果，開發(fā)出一套適用于ELISA法檢測重金屬樣品前處理的方法；(2)優(yōu)化人工抗原的合成方法。目前，重金屬人工抗原的合成時間比較長，步驟也較復(fù)雜；(3)針對不同金屬離子載體蛋白選擇作進一步研究。由于載體蛋白的結(jié)構(gòu)存在差異，因此選擇不同的載體蛋白將導(dǎo)致ELISA試劑盒不同的靈敏性；(4)進一步提高特異性抗體的專一性。雖然特異性抗體與絕大多數(shù)金屬離子的交叉反應(yīng)率低，但往往會與某一種甚至某幾種金屬離子存在較大的交叉反應(yīng)。

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ProgressinrapiddeterminationofheavymetalsinfoodsbyELISA

GOU Zhen-qiong1,2,LAN Yang1,ZHENG Yun1,LIU Wei1,DONG Quan1*

1 (College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China)2 (College of Environment and Resources,Chongqing Technology and Business University,Chongqing 400067,China)

Excessive heavy metals are harm to human health,many countries have set up standards of heavy metals in food,and more and more studies are carried out on analysis and detection of heavy metals.The traditional detection methods are more mature with high sensitivity.But the operations usually are tedious and high cost,they need large-scale equipment and skilled professionals.ELISA method has developed rapidly due to its excellent specificity and sensitivity,and can be used for rapid detection on site.ELISA detection of heavy metals includes four key steps:sample pretreatment,synthesis of artificial antigen,preparation of specific antibody,and the appropriate ELISA method selection.The recent progress of ELISA detection of heavy metals is briefly reviewed.Future development trends and prospects are discussed to provide a relevant reference for detecting of heavy metals in food.

enzyme-linked immune sorbent assay; sample pretreatment; artificial antigen; antibody; indirect competitive

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014120

碩士研究生(董全教授為通訊作者，E-mail：dongquan@swu.edu.cn)。

重慶市“121”科技支撐示范工程(cstc2012jcfc-jfzh0033)

2017-02-22，改回日期：2017-06-02