張海波 ，張英 *

（1.陜西省種子管理站，西安710018；2.農業(yè)部農作物種子質量監(jiān)督檢驗測試中心(西安)，西安710018）

棉花種子中轉基因成分篩查策略

張海波 1，2，張英 1，2*

（1.陜西省種子管理站，西安710018；2.農業(yè)部農作物種子質量監(jiān)督檢驗測試中心(西安)，西安710018）

2015年中國棉花產量560萬t[1]，約占世界棉花產量的四分之一[2]。棉花棉鈴蟲在中國各棉區(qū)普遍發(fā)生[3]，轉基因抗蟲棉的大規(guī)模應用，有效地降低了棉鈴蟲的危害[4-5]。2015年，中國轉基因抗蟲棉種植面積為370萬hm2[6-7]，國產轉基因抗蟲棉已占到99%的市場份額[8]。

由于轉基因技術的潛在風險，轉基因作物在應用前必須經過安全性評價[6]。棉花是中國目前唯一轉基因商業(yè)化種植的主要農作物，加強對轉基因棉花種子的監(jiān)管，是轉基因棉花種子產業(yè)健康發(fā)展的重要保障[9-10]。棉花種子的轉基因監(jiān)管，包括對非轉基因棉花種子（未標注“轉基因”字樣的棉花種子）的監(jiān)管和對轉基因種子（標注“轉基因”字樣的棉花種子）的監(jiān)管。對非轉基因棉花種子的監(jiān)管主要是防止轉基因種子混入非轉基因種子中非法擴散；對轉基因種子的監(jiān)管主要是測定轉基因種子的特征特性純度。種子檢驗是種子監(jiān)管的技術支撐，以上兩方面的監(jiān)管將產生大量需要檢測的樣品。快速、準確、科學地對大量樣品進行轉基因成分檢測，是當前轉基因成分檢測技術所面臨的一個關鍵問題[11]。聚合酶鏈式反應 （Polymerase chain reaction，PCR）技術以其敏感、快速、簡便等特點，成為最適合轉基因作物及其產品快速檢測的技術[12]。以PCR技術為基礎的篩查法檢測，適合對大量樣品進行轉基因成分檢測。中國棉花種子市場主要是國內抗蟲棉品種，因此，監(jiān)管的重點也是國內批準的轉基因抗蟲棉。本研究根據(jù)中國轉基因抗蟲棉種子市場情況，分析了抗蟲棉常用的插入基因和調控元件，選取合適的基因元件組合，建立轉基因棉花篩查的靶標元件和檢測方法，并對轉基因棉花種子的轉基因特征特性純度檢測進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

非轉基因棉花種子新陸早36號，轉Bt基因棉花種子中植棉2號、中棉所41、中棉所45、中棉所79、魯棉研21號、魯棉研28號、魯棉研29號、魯棉研36號、魯6269、魯7619、K836和瑞棉1號，由陜西省農作物種子檢驗站收集；某轉基因抗蟲棉商品種子，購自雨潤西安農副產品全球采購中心糧油種子銷售區(qū)。

PCR 擴增試劑（Premix ExTaq，R003A）、DNA分子質量標準（Marker DL1000，貨號：3591A）購自寶生物工程（大連）有限公司。擴增引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2 轉基因棉花安全證書批準情況分析

轉基因棉花品種在商業(yè)化應用前必須經過轉基因生物安全性評價[6]，通過安全性評價的授予《農業(yè)轉基因生物安全證書》。根據(jù)農業(yè)部“轉基因權威關注”網站中“審批信息”板塊相關內容[13]，查詢了我國自1996年安全性評價申報以來，至2016年獲批《農業(yè)轉基因生物安全證書》的轉基因棉花品種，對其轉入的外源基因進行了分析歸類和統(tǒng)計分析，以此作為轉基因棉花篩查策略分析的基礎。

1.3 轉基因棉花篩查策略分析

轉基因棉花的篩查是對轉基因棉花中通用元件進行檢測。根據(jù)轉基因棉花的外源插入元件情況，挑選使用頻率最高和覆蓋全部已知轉基因棉花的少數(shù)幾個外源元件作為檢測靶標，如果檢測出其中任何一個元件，表明該樣品中含有轉基因棉花。如果檢測結果都為陰性，則表明樣品中未檢出已知轉基因棉花[14]。根據(jù)轉基因棉花篩查原則和轉基因棉花安全證書批準情況，確定轉基因棉花檢測的篩查策略。

1.4 基因組DNA提取

樣品基因組DNA的提取采用天根生化科技（北京）有限公司生產的新型植物基因組DNA提取試劑盒 （貨號：DP320）。用紫外分光光度計ND2000（賽默飛世爾科技公司，Thermo Fisher Scientific）測定獲得DNA的純度和質量濃度。8 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳和EB染色檢測DNA樣品的完整性。棉花內標準基因SadⅠ擴增[15]測定DNA樣品中是否存在擴增抑制物質。

1.5 定性PCR

篩查元件的定性PCR引物采用國家標準中的引物，包括農業(yè)部1485號公告-11-2010《轉基因植物及其產品成分檢測抗蟲轉Bt基因棉花定性 PCR方法》[16]、農業(yè)部 1782號公告 -3-2012《調控元件CaMV 35S啟動子、FMV 35S啟動子、NOS啟動子、NOS終止子和CaMV 35S終止子定性PCR方法》中CaMV 35S啟動子和NOS終止子擴增引物[17]，具體引物的序列和擴增產物大小如表1所示。

定性PCR擴增條件及擴增程序依據(jù)相應標準[15-17]執(zhí)行。定性PCR擴增使用MyCycler PCR儀（美國伯樂（Bio-red）)進行擴增，PCR 產物用 20 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳和EB染色。

表1 檢測中所用的引物擴增片段長度及引用標準

1.6 轉基因棉花篩查檢測方法特異性分析

為了驗證選擇的Bt基因、CaMV 35S啟動子和NOS終止子篩選引物是否適合對棉花中的轉基因成分進行篩查，利用表1中的引物對12個轉基因棉花種子進行了試驗驗證，分別是中植棉2號、中棉所41、中棉所45、中棉所79、魯棉研21號、魯棉研28號、魯棉研29號、魯棉研36號、魯6269、魯7619、K836和瑞棉1號。以新陸早36號作為非轉基因棉花對照。

1.7 轉基因棉花篩查檢測方法靈敏度分析

用不同質量比例的轉基因棉花中棉所41種子粉末和非轉基因棉花新陸早36號種子粉末混合，提取基因組DNA，對Bt基因、CaMV 35S啟動子和NOS終止子的篩查方法進行靈敏度測試。種子粉末混合比例分別是：中棉所41（轉基因成分含量1 000 g·kg－1）、10.0 g 的中棉所 41 和 90.0 g 的新陸早 36 號混合 （轉基因成分含量 100 g·kg－1）、1.0 g的中棉所41和99.0 g的新陸早36號混合（轉基因成分含量 10 g·kg－1）、0.50 g 的中棉所 41 和 99.50 g的新陸早36號混合（轉基因成分含量5 g·kg－1）、0.10 g的中棉所41和99.90 g的新陸早36號混合（轉基因成分含量 1 g·kg－1）、0.10 g 的中棉所 41 和999.90 g的新陸早36號混合 （轉基因成分含量0.1 g·kg－1）、新陸早 36 號（轉基因成分含量 0 g·kg－1）。

1.8 轉基因抗蟲棉特征特性純度檢測分析

轉基因抗蟲棉特征特性純度的測定采用Bt基因檢測方法。對市場上購買的某轉基因抗蟲棉商品種子，隨機抽取125粒種子，以每粒為1個樣品進行核酸提取和Bt基因的檢測，以測定該轉基因抗蟲棉商品種子的抗蟲特征特性純度。

2 結果與分析

2.1 商業(yè)化轉基因棉花外源插入元件分析

根據(jù)農業(yè)部“轉基因權威關注”網站中“審批信息”內容[13]，我國1996年至2016年批準棉花《農業(yè)轉基因生物安全證書》共計2 514份。棉花的《農業(yè)轉基因生物安全證書》有效期為5年，截至2017年10月仍有效的安全證書有863份，全部為抗蟲轉基因棉花。其中，轉cry1Ab/cry1Ac棉花766份，占863份的88.8%；轉cry1Ac棉花71份，占 8.2%；轉cry1Ab/cry1Ac+CpTI棉花 26份，占 3.0%（圖1）。

圖1 2012－2016年轉基因抗蟲棉獲得生產應用的安全證書

從圖1可看出，2011年到2016年批準的棉花農業(yè)轉基因生物生產應用安全證書分別為40份、129份、236份、142份、165份和191份。批準的所有轉基因棉花都是抗蟲棉，并且都有cry1Ab/cry1Ac融合基因或者cry1Ac抗蟲基因中的1個。

2.2 轉基因抗蟲棉篩查策略分析

根據(jù)商業(yè)化轉基因棉花外源插入元件分析結果，我國批準的轉基因棉花都是轉基因抗蟲棉，含有cry1Ab/cry1Ac融合基因或cry1Ac抗蟲基因中之一，因此對轉基因棉花的篩查檢測，首先是針對cry1Ab/cry1Ac融合基因或cry1Ac基因或cry1Ab基因的檢測。農業(yè)部1485號公告-11-2010標準中的Bt基因檢測方法，是根據(jù)cry1Ab/cry1Ac融合基因或cry1Ac基因或cry1Ab基因序列設計的特異性方法[16]，可檢出cry1Ab/cry1Ac融合基因或cry1Ac基因或cry1Ab基因序列。

完整的Bt基因表達盒才能實現(xiàn)Bt基因的表達和抗蟲特性的發(fā)揮，即需要啟動子和終止子的協(xié)同作用。國產抗蟲棉主要采用CaMV 35S啟動子和NOS終止子實現(xiàn)對Bt基因的調控[18-19]，本研究選用農業(yè)部1782號公告-3-2012中的CaMV 35S啟動子和NOS終止子檢測方法[17]，對轉基因抗蟲棉的調控元件進行篩查檢測。

2.3 轉基因抗蟲棉篩查檢測方法特異性

PCR檢測結果如圖2所示，在Bt基因 （圖2A）、CaMV 35S 啟動子（圖2B）和 NOS 終止子（圖2C）方法的檢測結果中，所有的轉基因抗蟲棉都可檢出，非轉基因棉花為未檢出。這些結果與預期相符，說明本研究中選用的Bt基因、CaMV 35S啟動子和NOS終止子的篩查檢測方法，能夠有效地對轉基因抗蟲棉進行篩查檢測。

圖2 對棉花基因組DNA中Bt基因、CaMV 35S啟動子和NOS終止子的PCR檢測

2.4 轉基因抗蟲棉篩查檢測方法靈敏度

PCR檢測結果如圖3所示，在Bt基因 （圖3A）、CaMV 35S 啟動子（圖3B）和 NOS 終止子（圖3C）方法的檢測結果中，轉基因成分含量1 g·kg－1的混合樣品可以檢測到，轉基因成分含量0.1 g·kg－1的混合樣品未擴增出條帶，說明本研究選用的引物序列的靈敏度可達到1 g·kg－1。

圖3 對棉花基因組DNA中Bt基因、CaMV 35S啟動子和NOS終止子的PCR檢測靈敏度

2.5 轉基因抗蟲棉特征特性純度檢測

根據(jù)孫國清等[20]的研究，轉基因抗蟲棉品種抗性純度會影響產量。轉基因抗蟲棉品種抗性純度至少要達到97%，才可以保證產量不至于損失太大[20]。國家標準強制性要求棉花大田用種的純度不能低于95%。綜合考慮，轉基因抗蟲棉品種抗性純度至少要達到97%，才能保證棉花種植農田不受損失。

對市場上購買的某轉基因抗蟲棉種子的125個單粒PCR檢測結果顯示，有122個呈陽性，有3個單粒（序號分別是41、67和120）為陰性（圖4），計算出轉基因抗蟲棉種子的純度為97.6%。說明該抗蟲棉種子的抗蟲抗性純度符合要求，能夠在大田中有效防止棉鈴蟲的侵害。

圖4 采用Bt基因法檢測轉基因抗蟲棉特征特性純度結果

3 討論與結論

本研究通過對轉基因棉花農業(yè)轉基因生物安全證書批準數(shù)據(jù)進行分析，統(tǒng)計了商業(yè)化轉基因棉花外源插入元件的情況，提出了轉基因抗蟲棉篩查策略和檢測方法，使用Bt基因、CaMV 35S啟動子和NOS終止子檢測方法對12個常見轉基因棉花品種進行篩查檢測的試驗驗證。試驗結果證明，該檢測方法對商業(yè)化應用的轉基因棉花品種可進行特異性的快速篩查檢測，檢測靈敏度可達到1 g·kg－1，這與吳明生等[21]、Wu 等[22]報道的檢測靈敏度相近，為棉花中轉基因成分的快速準確檢測提供了技術依據(jù)。

Bt基因篩查方法可對棉花的轉基因特征特性純度進行快速分析。該方法具有以下優(yōu)勢：相對于常規(guī)的種子純度檢測方法，節(jié)約了時間成本；可實現(xiàn)種植前種子純度檢測和控制，最大限度減少純度不合格種子對大田生產的負面影響。

該技術應用于轉基因抗蟲棉的監(jiān)管，對于防止轉基因抗蟲棉的非法擴散和保障棉田的安全生產具有重要意義。

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Screening Strategy for Detection of Genetically Modified Organism in Cotton Seed

Zhang Haibo1,2,Zhang Ying1,2*

在棉花種子的監(jiān)管中，大量的樣品需要進行轉基因成分檢測，建立快速、準確、低成本的轉基因成分篩查方法十分必要。通過分析我國棉花種子市場和轉基因棉花安全生產證書發(fā)放情況，建立了棉花種子中轉基因成分快速篩查策略，并對市場上銷售的棉花品種種子轉基因特征特性純度進行了檢測。結果表明，聯(lián)合使用CaMV 35S啟動子、NOS終止子和Bt基因等3個元件的檢測，可完成對棉花種子中轉基因成分的快速篩查，檢測靈敏度為1 g·kg－1；單用Bt基因可對抗蟲棉種子的轉基因特征特性純度進行快速檢測。本研究建立的篩查方法，可對棉花種子中轉基因成分進行快速、高靈敏度的篩查。

轉基因棉花；轉基因檢測；篩查策略；抗性純度；Bt基因

S562.03

A

1000-632X(2017)12-0011-05

10.11963/1000-632X.zhbzy.20171124

2017-10-11 *通信作者：zhying6@gmail.com

國家重點研發(fā)計劃——“七大農作物育種”專項（2017YFD0102006）