維 妙 徐奎棟①

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所 青島 266071; 2. 中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

病毒是海洋環(huán)境中豐度最高的生物組分, 且絕大多數(shù)是以原核生物為宿主的噬菌體以及噬藻體(Danovaroet al, 2008a)。病毒裂解其宿主釋放出的可溶性有機(jī)物(DOM)可供原核生物再次利用, 從而減少了原核生物生產(chǎn)力和生物量向更高營養(yǎng)級的轉(zhuǎn)移。這一由病毒引發(fā)的有機(jī)質(zhì)流的轉(zhuǎn)變被稱為病毒回路(Wilhelmet al, 1999; Danovaroet al, 2008a)。在海洋水體及沉積物中, 由病毒引起的原核生物死亡率通?？蛇_(dá)10%—30%(Danovaroet al, 2008a)。而在深海沉積物中, 高達(dá) 80%—100%的原核生物由病毒裂解致死, 由此釋放的大量可溶性有機(jī)質(zhì)支撐著深海底棲生態(tài)系統(tǒng)中較高的原核生物量和代謝水平(Danovaroet al, 2008a, b)。通過對宿主的感染及裂解,病毒在海洋生物群落構(gòu)成、基因的水平轉(zhuǎn)移、海洋生物多樣性及碳、氮等元素的生物地球化學(xué)循環(huán)等方面起著重要作用(Suttle, 2005; Danovaroet al, 2008a; 張永雨等, 2011)。

對海洋沉積物中的病毒進(jìn)行確切定量是研究其數(shù)量變動和生態(tài)作用的前提。對沉積物病毒的研究早期采用透射電子顯微鏡(TEM)觀察計數(shù), 但因費時、費力且成本較高, 因此除用于形態(tài)觀察外, 在定量研究中現(xiàn)已很少使用。目前, 利用 SYBR Green I (或SYBR Gold)等高亮度熒光染色劑對沉積物病毒染色,以熒光顯微鏡進(jìn)行觀察計數(shù)的方法已成為主流。

目前國際上已有多份針對海洋沉積物病毒熒光染色計數(shù)法的研究, 初步建立了熒光計數(shù)法的流程(Danovaroet al, 2001; Heltonet al, 2006; Dell’Anno,et al, 2009; Danovaroet al, 2010; Suttleet al, 2010)。然而,對于一些處理方法的定量效能并未進(jìn)行驗證, 且不同研究者往往使用不同的處理方法。例如, 已有研究顯示利用醛類固定并在4°C或-20°C條件下儲存的方法易造成病毒數(shù)量的低估, 因而不適于沉積物病毒樣品的保存(Danovaroet al, 2001; Duhamelet al, 2006;Heltonet al, 2006), 并由此建議使用液氮閃凍后置于-80°C 來 保 存 沉 積 物 樣 品(Dell’Annoet al, 2009;Suttleet al, 2010; Danovaroet al, 2010)。但后者的保存效果僅在水體病毒的定量中得到驗證(Brussaard,2004; Wenet al, 2004), 對其在沉積物病毒的保存效果尚待檢驗。又如, 在使用表面活性劑處理的步驟中,Danovaro等(2010)的研究表明, 使用5mmol/L終濃度焦磷酸鈉處理的效果優(yōu)于 10mmol/L終濃度。然而,后續(xù)研究中使用的濃度并未統(tǒng)一, 且這兩種濃度是否為最佳濃度仍有待檢驗。此外, 對于超聲處理樣品時是否應(yīng)進(jìn)行冰浴也存在爭議。Duhamel等(2006)研究發(fā)現(xiàn), 在超聲時添加冰塊會導(dǎo)致獲取的病毒及細(xì)菌豐度下降。而Danovaro等(2010)仍然提出, 在水浴中超聲處理樣品時, 應(yīng)添加冰塊以防止樣品過熱。不一而足, 由于沉積物病毒定量的許多處理方法并未進(jìn)行實驗驗證, 導(dǎo)致不同的研究往往使用不同的處理方法, 而不同的處理往往產(chǎn)生不同的計數(shù)結(jié)果, 從而影響了對海洋沉積物病毒生態(tài)作用的評價。

我國對水體病毒的定量研究自21世紀(jì)開始起步,目前已對中國陸架海域(張喆等, 2008, 2017; 李洪波等, 2010; 盧龍飛等, 2013; 馬玉等, 2016)、長江口(劉晶晶等, 2011)、港灣(趙苑等, 2010; 王海麗等, 2011)、海水養(yǎng)殖區(qū)(孫輝等, 2014)及淡水湖泊濕地(孫小磊等,2009)等生境中病毒數(shù)量的時空變化及生態(tài)特性有所報道。對水體病毒定量計數(shù)的方法也有多份研究(李娟, 2005; 潘洛安等, 2006; 白曉歌等, 2008; 李洪波等, 2010; 李勝男等, 2015), 技術(shù)流程日趨成熟。相較于此, 目前國內(nèi)僅李清等(2016)對大連灣及大窯灣沉積物病毒豐度的季節(jié)變化及水平分布進(jìn)行了研究,缺乏關(guān)于沉積物病毒定量計數(shù)方法的報道。我國現(xiàn)行的《海洋調(diào)查規(guī)范 第6部分: 海洋生物調(diào)查》(國家海洋局, 2007)國家標(biāo)準(zhǔn)中涉及了浮游生物以及大型和小型底棲生物等的技術(shù)規(guī)范。新近頒布實施的《海洋微型底棲生物調(diào)查規(guī)范》(HY/T 140–2011)規(guī)定了底棲細(xì)菌、微藻和原生動物的定量方法, 但仍缺沉積物病毒定量研究的技術(shù)規(guī)范(中國科學(xué)院海洋研究所,2011)。

本研究根據(jù)現(xiàn)行沉積物病毒熒光計數(shù)的基本流程(Danovaroet al, 2001, 2010), 利用沙質(zhì)、泥沙質(zhì)及泥質(zhì)沉積物樣品, 對海洋沉積物病毒熒光計數(shù)法進(jìn)行了實驗驗證和條件優(yōu)化。對沉積物樣品的兩種保存方法及效能進(jìn)行了評估, 提出了焦磷酸鈉處理的最優(yōu)終濃度, 并將冰浴與常溫超聲處理效果進(jìn)行了對比分析。同時, 還檢驗了離心對病毒定量造成的低估,測算了其在不同類型沉積物中的提取率, 提出了離心和稀釋兩種方法的適用條件。由于病毒的定量研究與原核生物豐度密不可分, 且原核生物也采用熒光計數(shù)法定量, 因此文中同時檢驗了上述條件對原核生物定量的影響, 從側(cè)面佐證采用的實驗條件對病毒定量的影響。據(jù)此, 本研究提出了改進(jìn)的沉積物病毒熒光計數(shù)法的操作流程, 以期為行之有據(jù)、高效可靠的海洋沉積物病毒的定量分析提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 沉積物樣品采集與保存

為探索病毒熒光計數(shù)法的普適性, 本研究選取了沙質(zhì)、泥沙質(zhì)及泥質(zhì)三種不同類型的沉積物。沙質(zhì)沉積物(中值粒徑約 200μm)采自青島灣低潮帶, 泥沙質(zhì)沉積物(中值粒徑約 145μm)采自青島灣中潮帶, 兩采樣點間相距約 80m。泥質(zhì)沉積物(中值粒徑約4.8—5.5μm)采自西太平洋雅浦海溝附近的深海平原(水深 4042m)。泥質(zhì)沉積物因無法立即處理分析, 僅對其冷凍保存后進(jìn)行了提取率的探究實驗。

青島灣潮間帶樣品: 用滅菌后的采樣勺刮取表層0—1cm沉積物約50mL, 充分混勻后采集分樣, 每個分樣含沉積物0.5mL, 置于10mL的無菌離心管中,加入4.2mL無菌海水配置的2%福爾馬林固定液后充分混勻。部分分樣于采集后2h內(nèi)進(jìn)行提取條件及定量效能實驗, 以SYBR Green I染色、制片后(Danovaroet al, 2001)用熒光顯微鏡觀察計數(shù), 換算為VLP/g沉積物干重(virus-like particles)。用于保存方式和保存時間影響實驗的分樣按下述相應(yīng)方法進(jìn)行保存及處理。

深海沉積物樣品: 沉積物樣品使用箱式采泥器采集, 從未受擾動的沉積物表層 0—4cm 采集分樣,每個分樣含沉積物0.5mL, 置于滅菌后的5mL凍存管中, 加入4.2mL無菌的海水配置的2%福爾馬林固定液充分混勻, 于液氮中速凍后置于-80°C冰箱保存。

1.2 沉積物保存方式和保存時間對計數(shù)的影響

對制片后置于-20°C冰箱保存(簡稱制片保存)和經(jīng)液氮速凍后于-80°C冰箱保存(簡稱冷凍保存)樣品的兩種保存方法進(jìn)行了定量效能評估。從新鮮的沙質(zhì)和泥沙質(zhì)沉積物中各取 3個分樣, 于 2h內(nèi)進(jìn)行分樣的染色制片和鏡檢計數(shù)。計數(shù)后置于-20°C冰箱保存,并在保存30天及90天后再次進(jìn)行計數(shù)。

冷凍保存的樣品分別于保存7天、30天及60天后, 各取 3個分樣進(jìn)行處理?，F(xiàn)有研究多在 37°C水浴中融化冷凍樣品(Wenet al, 2004; Suttleet al, 2010),也有將樣品于 35°C 融化(Brussaard, 2004)或室溫(25°C)融化(Patelet al, 2007)的報道。經(jīng)檢驗, 采用上述方式融化樣品的定量結(jié)果均無差異。

1.3 焦磷酸鈉濃度對計數(shù)的影響

采集新鮮的沙質(zhì)和泥沙質(zhì)沉積物各分為5組, 每組3個重復(fù)。在其他實驗條件一致的情況下, 分別使用0.5、2、3、5和7mmol/L終濃度的焦磷酸鈉溶液對每組樣品進(jìn)行孵育。封片后于當(dāng)天鏡檢計數(shù), 計數(shù)結(jié)果使用SPSS16.0的Kruskal-Wallis H檢驗進(jìn)行組間差異性分析。

1.4 冰浴和常溫超聲對計數(shù)的影響

采集新鮮的沙質(zhì)沉積物分成兩組, 每組3個重復(fù),一組在超聲處理時在水浴中添加冰塊, 另一組不添加,其他條件保持一致。封片后于當(dāng)天鏡檢計數(shù), 對比分析冰浴和常溫條件下超聲處理沉積物的定量效能。

1.5 離心與稀釋的定量效能

在確定最優(yōu)的焦磷酸鈉濃度(3mmol/L)和(常溫)超聲處理條件后, 對離心和稀釋兩種方法的定量效能進(jìn)行了對比。沙質(zhì)和泥沙質(zhì)沉積物經(jīng)焦磷酸鈉孵育和超聲處理后充分混勻, 取懸液稀釋(稀釋倍率依病毒的豐度定)后染色制片。剩余部分經(jīng) 800g×1min離心處理后, 取上清液過膜制片, 封片后于-20°C 冰箱保存并在一周內(nèi)計數(shù)。

對于病毒豐度較低、沉積物顆粒較細(xì)密且腐殖質(zhì)較多的沉積物, 必須進(jìn)行離心處理時, 需測定提取率以彌補(bǔ)離心造成的豐度損失。從新鮮的沙質(zhì)、泥沙質(zhì)沉積物以及冷凍保存的泥質(zhì)沉積物中各取 3個分樣,經(jīng)焦磷酸鈉和超聲處理并離心后, 取上清液染色制片。之后, 小心移除剩余上清液, 用 4.5mL無菌蒸餾水清洗余下的沉積物, 充分混勻后再次離心, 取上清液染色制片。依此重復(fù)清洗 4次后, 每個分樣得到 5張封片, 計數(shù)全部封片后所得結(jié)果之和記為此分樣中病毒顆粒的總豐度, 并分別計算每張封片所得結(jié)果占總豐度的百分比, 以確定適宜的清洗次數(shù)。之后, 從新鮮及冷凍保存的沙質(zhì)、泥沙質(zhì)沉積物以及冷凍保存的泥質(zhì)沉積物中各取 5個分樣測算提取率, 以第一次提取與數(shù)次清洗后所得豐度之和作為總豐度, 提取率以第一次提取所得豐度除以總豐度獲得。結(jié)果使用SPSS16.0的Kruskal-Wallis H進(jìn)行組間差異性分析, 并使用Mann-Whitney U檢驗對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩對比分析。

2 結(jié)果

2.1 沉積物保存方式和保存時間對計數(shù)的影響

制片保存的計數(shù)結(jié)果顯示, 沙質(zhì)沉積物病毒封片在保存 30天后計數(shù)所得豐度為制片后當(dāng)天計數(shù)結(jié)果的81.6%, 保存90天后為122.4% (圖1a)。泥沙質(zhì)沉積物病毒封片在保存 30天后計數(shù)所得豐度為制片當(dāng)天計數(shù)結(jié)果的64.3%, 保存90天后為95.4% (圖1b)。

冷凍保存的計數(shù)結(jié)果顯示, 沙質(zhì)沉積物在保存 7天后病毒豐度為新鮮樣品豐度的 28.6%, 保存 30天后僅為 5.6%(圖 1a)。泥沙質(zhì)沉積物存 7天后病毒豐度為新鮮樣品豐度的93.9%, 保存30天為72.7%, 保存 60天后為40.0% (圖1b)。

圖1 沉積物冷凍保存和染色制片保存對沙質(zhì)(a)和泥沙質(zhì)(b)沉積物中病毒和原核生物計數(shù)的影響Fig.1 Effects of cryopreservation (-80°C) and prompt dye staining preservation (-20°C) on enumeration of viruses and prokaryotes in sandy (a) and muddy-sand (b) sediments

對保存后原核生物的計數(shù)結(jié)果顯示, 沙質(zhì)沉積物制片保存30天和90天后計數(shù)所得豐度均為制片當(dāng)天計數(shù)結(jié)果的 104.4%, 泥沙質(zhì)沉積物分別為 104.4%和 114.9% (圖 1a)。冷凍保存結(jié)果顯示, 沙質(zhì)沉積物中原核生物在保存 7天和 30天后, 豐度分別為新鮮樣品豐度的62.9%和20.3%。泥沙質(zhì)沉積物中原核生物在保存7天、30天和60天后, 豐度分別為新鮮樣品豐度的83.4%、71.2%及46.9%。

2.2 焦磷酸鈉濃度對計數(shù)的影響

使用終濃度為 3mmol/L的焦磷酸鈉孵育時, 沙質(zhì)和泥沙質(zhì)沉積物均計數(shù)到病毒豐度的最大值(圖2)。統(tǒng)計學(xué)分析顯示, 不同濃度焦磷酸鈉對泥沙質(zhì)沉積物病毒的定量效果有統(tǒng)計學(xué)差異(X2=13.5,P＜0.05),而對沙質(zhì)沉積物病毒的定量效果無統(tǒng)計學(xué)差異。

對原核生物的定量顯示了同樣的結(jié)果。使用3mmol/L焦磷酸鈉孵育定量效果最佳(圖 2), 不同濃度焦磷酸鈉對對泥沙質(zhì)沉積物原核生物的定量效果有統(tǒng)計學(xué)差異(X2=11.26,P＜0.05), 對沙質(zhì)沉積物原核生物的定量效果無統(tǒng)計學(xué)差異。

圖2 焦磷酸鈉終濃度對沙質(zhì)(a)、泥沙質(zhì)(b)中沉積物病毒和原核生物計數(shù)的影響Fig.2 Effect of final concentrations of tetrasodium pyrophosphate on enumeration of viruses and prokaryotes from sandy (a) and muddy-sand (b) sediments

2.3 冰浴和常溫超聲對計數(shù)的影響

對沙質(zhì)沉積物進(jìn)行冰浴及常溫條件下超聲處理的實驗結(jié)果顯示, 冰浴超聲得到的病毒豐度為常溫超聲所得的62.8%, 原核生物豐度為常溫超聲所得的27.6%。這說明在水浴中添加冰塊會降低超聲提取的效能, 導(dǎo)致獲取的病毒和原核生物豐度的下降, 且對原核生物提取的影響更大。

2.4 離心與稀釋的定量效能

對離心和稀釋兩種方法的定量效能的對比分析顯示, 沙質(zhì)沉積物樣品經(jīng)離心處理后, 獲得的病毒豐度僅為稀釋處理所得豐度的58.3%; 泥沙質(zhì)沉積物經(jīng)離心處理后, 獲得的病毒豐度僅為稀釋處理所得豐度的51.7%(圖3a)。離心對原核生物豐度的影響更大,經(jīng)離心處理后兩中沉積物中所獲原核生物豐度僅為稀釋處理所得豐度的18.7%及13.0%(圖3b)。

圖3 離心與稀釋對沙質(zhì)(a)和泥沙質(zhì)(b)沉積物中病毒和原核生物計數(shù)的影響Fig.3 Effects of centrifugation and dilution on enumeration of viruses and prokaryotes from sandy (a) and muddy-sand (b) sediments

對新鮮和冷凍保存的沙質(zhì)和泥沙質(zhì)沉積物以及冷凍保存的泥質(zhì)沉積物進(jìn)行了提取率的測算。通過數(shù)次清洗的計數(shù)發(fā)現(xiàn), 通過一次提取加兩次清洗后, 新鮮的沙質(zhì)和泥沙質(zhì)沉積物以及冷凍的泥質(zhì)沉積物中獲取的病毒豐度分別達(dá)總豐度的 94.1%、91.8%及95.6%。新鮮的沙質(zhì)和泥沙質(zhì)沉積物中獲取的原核生物豐度略低于 90%(分別為 88.3%和 83.5%), 冷凍泥質(zhì)沉積物中原核生物提取率達(dá)到93.3%。據(jù)此, 可將一次提取加兩次清洗所得的豐度計為樣品中病毒及原核生物總豐度。

在此基礎(chǔ)上, 對各種沉積物中病毒和原核生物的提取率進(jìn)行了測算(圖4)。結(jié)果顯示, 新鮮的沙質(zhì)、泥沙質(zhì)沉積物病毒提取率分別為 76.4%和 81.8%, 顯著高于冷凍后的 63.6%和 66.1%, 且新鮮沉積物的病毒提取率具有較低的標(biāo)準(zhǔn)差(表1)。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn), 在不同類型沉積物中測得的病毒提取率有顯著差異(Kruskal-WallisH檢驗,X2=19.73,P＜0.05)。通過Mann-WhitneyU檢驗兩兩對比發(fā)現(xiàn), 新鮮沉積物樣品與其對應(yīng)的冷凍樣品獲得的病毒提取率均有顯著差異(U=0.0,P＜0.05), 新鮮的沙質(zhì)和泥沙質(zhì)沉積物間、冷凍的沙質(zhì)和泥沙質(zhì)沉積物間病毒的提取率無統(tǒng)計學(xué)差異, 而冷凍的泥質(zhì)沉積物病毒提取率與除冷凍泥沙質(zhì)沉積物之外的所有類型沉積物的病毒提取率均有顯著差異(表2)。

除泥質(zhì)冷凍沉積物外, 原核生物提取率均低于相應(yīng)沉積物中的病毒提取率。與病毒提取率相同, 新鮮沉積物中的原核生物提取率相對冷凍沉積物也具有較小的標(biāo)準(zhǔn)差(表 1)。對原核生物提取率進(jìn)行Kruskal-WallisH檢驗及Mann-WhitneyU兩兩對比檢驗, 結(jié)果均無顯著差異(表 2)。將同類型沉積物測得的病毒和原核生物的提取率進(jìn)行兩兩對比發(fā)現(xiàn), 兩種新鮮沉積物樣品中病毒提取率與原核生物提取率之間有顯著差異(U=0.0,P＜0.05), 而三種冷凍樣品的病毒提取率與原核生物提取率之間無統(tǒng)計學(xué)差異。據(jù)此, 計算所得沙質(zhì)沉積物病毒轉(zhuǎn)換系數(shù)為 1.31, 泥沙質(zhì)沉積物病毒轉(zhuǎn)換系數(shù)為1.22; 沙質(zhì)沉積物原核生物轉(zhuǎn)換系數(shù)為1.57, 泥沙質(zhì)沉積物為1.51。

圖4 不同海洋沉積物中病毒(a)及原核生物(b)提取率Fig.4 Extraction efficiency of viruses (a) and prokaryotes (b) in different marine sediments

表1 不同類型海洋沉積物中病毒及原核生物的提取率Tab.1 The extraction efficiency of viruses and prokaryotes in different marine sediments

3 討論

3.1 沉積物保存方式和保存時間對計數(shù)的影響

新鮮樣品采集后立刻染色制片并于-20°C下保存是目前病毒定量中公認(rèn)的最優(yōu)保存手段(Henneset al, 1995; Brussaard, 2004; Wenet al, 2004; Patelet al,2007; Dell’Annoet al, 2009; Suttleet al, 2010)。但受條件所限, 野外采樣常難以立即制片, 需經(jīng)過一段時間的保存才能進(jìn)行后續(xù)處理分析, 因此沉積物的有效保存對病毒的定量結(jié)果十分重要。

表2 不同類型海洋沉積物中病毒和原核生物提取率的兩兩對比檢驗Tab.2 Pairwise comparison test for extraction efficiency of viruses and prokaryotes from different marine sediments

目前較為有效的保存方法有兩種, 即制片后于-20°C的制片保存及經(jīng)液氮閃凍后-80°C冰箱的冷凍保存。本研究結(jié)果表明, 制片保存1個月后得到的病毒豐度低于當(dāng)天計數(shù)所得豐度, 泥沙質(zhì)沉積物封片所得豐度與當(dāng)天計數(shù)相差較大(64.3%)。然而, 經(jīng)3個月保存后, 泥沙質(zhì)沉積物封片計數(shù)得到的病毒豐度則與當(dāng)天計數(shù)相差無幾(95.4%), 而沙質(zhì)沉積物封片計數(shù)得到的病毒豐度還高于當(dāng)天計數(shù)所得。這說明封片保存1個月后計數(shù)的降低并非豐度的損失, 實驗條件和人為因素均可對計數(shù)結(jié)果產(chǎn)生影響。這可從原核生物的定量中獲得佐證, 其豐度在制片保存1個月和3個月后均未降低, 說明封片經(jīng)長時間保存后仍可有效計數(shù), 證實制片保存可作為沉積物病毒和原核生物樣品長期保存的手段。這一點與水體病毒保存方法的研究結(jié)果一致(Henneset al, 1995; Wenet al, 2004)。計數(shù)結(jié)果的差異可能主要是由于病毒和原核生物在封片上的不均勻分布造成的。因此, 在計數(shù)前應(yīng)先通過低倍鏡對封片上顆粒分布的均勻性進(jìn)行評估, 選取分布較為均勻的區(qū)域進(jìn)行計數(shù), 顆粒分布過于不均的封片應(yīng)舍棄。

冷凍保存在水體病毒的保存中被證明行之有效。Brussaard(2004)的研究表明, 水體病毒在保存 6個月后仍未見豐度的降低。而對于沉積物病毒, 實驗顯示了與已有研究不同的結(jié)果, 且對不同類型沉積物的冷凍保存效果差異明顯。沙質(zhì)沉積物在冷凍保存7天后, 病毒豐度即出現(xiàn)顯著下降; 保存 30天后病毒豐度降低超過一個數(shù)量級, 表明對沙質(zhì)沉積物而言冷凍保存效果不佳。泥沙質(zhì)沉積物的冷凍保存效果明顯優(yōu)于沙質(zhì)沉積物, 保存7天后的病毒豐度幾乎未見變化(降低6.1%), 保存30天后病毒豐度有少許降低(約27%), 但在保存 60天后病毒豐度有明顯降低, 表明泥沙質(zhì)沉積物短期冷凍保存效果尚可, 但不宜超過30天。

在沙質(zhì)沉積物中, 經(jīng) 30天保存后原核生物豐度損失了約 69.7%, 明顯低于病毒豐度的損失(約94.4%), 表明原核生物冷凍保存效果明顯優(yōu)于病毒。因此沙質(zhì)沉積物經(jīng)長期冷凍保存后, 其測得的病毒-原核生物比例(VPR or VBR)會被顯著低估。泥沙質(zhì)沉積物中病毒和原核生物的保存效果相差不大。

綜上, 本研究表明冷凍保存不適合作為沉積物樣品長期保存的方法, 這與水體病毒的保存方法研究的結(jié)論不一致(Brussaard, 2004; Wenet al, 2004)。對沙質(zhì)沉積物而言, 樣品采集后立刻制片是得到可靠豐度數(shù)據(jù)的唯一方法。對泥沙質(zhì)沉積物而言, 在1個月以內(nèi)冷凍保存的樣品獲得的豐度數(shù)據(jù)相對可靠,但保存2個月后的數(shù)據(jù)可信度便大大降低。本研究未對泥質(zhì)沉積物樣品進(jìn)行保存效果的評估, 但據(jù)筆者后續(xù)的分析發(fā)現(xiàn), 泥質(zhì)沉積物的冷凍保存效果與泥沙質(zhì)沉積物類似。沉積物顆粒性質(zhì)的差異可能是造成不同類型沉積物保存效果差異的主要因素, 而病毒對沉積物顆粒的非特異性吸附作用是病毒豐度衰減的主要原因之一(Nobleet al, 1998; Danovaroet al,2008a), 因此。在對沉積物病毒進(jìn)行定量研究時, 對于沙質(zhì)沉積物應(yīng)采取盡快制片保存的方法, 對于泥沙質(zhì)和泥質(zhì)沉積物病毒定量研究時可在短期內(nèi)對樣品進(jìn)行冷凍保存, 若需要對樣品長期保存則應(yīng)選擇制片保存。

3.2 焦磷酸鈉濃度對計數(shù)的影響

應(yīng)用表面活性劑對沉積物進(jìn)行孵育是病毒顆粒提取中重要的一步, 旨在破壞病毒顆粒與沉積物顆粒之間的黏附作用, 從而使病毒顆粒從沉積物顆粒表面脫離。焦磷酸鈉是目前使用最為廣泛的表面活性劑(Danovaroet al, 2008a)。本研究對用于沙質(zhì)和泥沙質(zhì)沉積物中的焦磷酸鈉濃度的實驗結(jié)果顯示, 使用終濃度為3mmol/L的焦磷酸鈉對沉積物進(jìn)行處理時,兩種的類型沉積物中病毒均計數(shù)到最大豐度, 優(yōu)于目前普遍使用的 5mmol/L焦磷酸鈉濃度。泥沙質(zhì)沉積物經(jīng)不同終濃度焦磷酸鈉處理所獲得的豐度差異具有統(tǒng)計學(xué)差異, 說明焦磷酸鈉終濃度對病毒與沉積物顆粒的分離效果具有重要作用。而沙質(zhì)沉積物經(jīng)處理后病毒豐度并無統(tǒng)計學(xué)差異, 表明焦磷酸鈉對不同類型沉積物處理效果不同。對原核生物的處理結(jié)果與病毒相似, 也從側(cè)面驗證了不同濃度下焦磷酸鈉對沉積物的定量效能。因此, 使用3mmol/L終濃度焦磷酸鈉處理沉積物效果最好。

3.3 冰浴與常溫超聲對計數(shù)的影響

超聲處理是病毒顆粒提取中非常重要的一步,可有效的將病毒顆粒與沉積物顆粒分離開來。Duhamel等(2006)的研究發(fā)現(xiàn), 添加冰塊會導(dǎo)致病毒計數(shù)的低估, 本研究結(jié)果驗證了這一結(jié)論。研究還發(fā)現(xiàn), 冰浴會對原核生物計數(shù)造成更大的低估。分析認(rèn)為, 水浴可為沉積物樣品提供一個良好的散熱環(huán)境,在實際操作中也未發(fā)現(xiàn)樣品出現(xiàn)過熱現(xiàn)象; 而添加冰塊可能會影響介質(zhì)振動, 從而導(dǎo)致分離效果變差。

然而, 在已有的研究中, 不同的研究者并未對此進(jìn)行統(tǒng)一。我們的結(jié)果顯示冰浴會使超聲處理的效果變差, 且由于冰浴超聲對原核生物的影響更大, 從而導(dǎo)致求得的 VPR偏高。這不僅降低了不同研究之間數(shù)據(jù)的可比性, 也會影響對數(shù)據(jù)的分析。因此我們建議, 水浴超聲時常溫條件下即可, 不宜添加冰塊。

3.4 離心與稀釋的定量效能

離心處理是現(xiàn)行沉積物病毒熒光計數(shù)法中常用的手段, 可降低沉積物顆粒對觀察計數(shù)的干擾。然而,經(jīng)超聲和焦磷酸鈉處理后的沉積物顆粒上仍會有大量病毒和原核生物附著, 且離心時沉積物顆粒會連帶許多懸浮的病毒及原核生物一同沉降, 導(dǎo)致計數(shù)結(jié)果偏低。

相較離心處理, 沉積物經(jīng)超聲和焦磷酸鈉處理后再行稀釋, 可避免離心處理造成的病毒和原核生物豐度損失, 且操作步驟更為簡單。對這兩種處理獲得的數(shù)據(jù)比較顯示, 直接稀釋計數(shù)獲得的豐度明顯高于離心處理, 而且離心處理造成的原核生物豐度損失明顯高于病毒的損失, 由此導(dǎo)致通過離心處理求得的 VPR也會顯著高于稀釋的結(jié)果。這一點從本研究結(jié)果和前人的工作中均得以證實(Fischeret al,2005; Danovaroet al, 2010)。這不僅降低了不同研究之間數(shù)據(jù)的可比性, 也會影響對病毒生態(tài)功能的探究。

因此, 對于沙質(zhì)和泥沙質(zhì)沉積物可直接進(jìn)行稀釋處理并計數(shù), 所含的少許雜質(zhì)通常也不會影響鏡檢結(jié)果(圖5a, b)。但對于病毒豐度較低、沉積物顆粒較細(xì)密且腐殖質(zhì)較多的沉積物樣品(如深海泥質(zhì)沉積物), 由于無法同時滿足排除雜質(zhì)干擾并保證稀釋后足夠的病毒豐度進(jìn)行定量, 因此必須對樣品進(jìn)行離心處理(圖5c, d)。

圖5 直接稀釋的沙質(zhì)(a)、泥沙質(zhì)(b)和泥質(zhì)(c)沉積物及離心后稀釋的泥質(zhì)沉積物(d)中病毒(箭)及原核生物(箭頭)的熒光顯微照片F(xiàn)ig.5 Epifluorescence micrographs showing viruses (arrows) and prokaryotes (arrowheads) from directly diluted sandy (a),muddy-sand (b) and muddy (c) sediments and diluted muddy sediment after centrifugation (d)

對必須進(jìn)行離心處理的樣品, 離心造成的豐度損失可通過測算提取率以求得轉(zhuǎn)換系數(shù)來補(bǔ)償(Elleryet al, 1984; Danovaroet al, 2001)。Danovaro 等(2001)測得海洋沙質(zhì)和泥沙質(zhì)沉積物中病毒提取率約為60%, Helton等(2006)自河口沉積物獲得的病毒提取率約為70%。本研究自5種不同處理的海洋沉積物獲得的病毒提取率在47%—82%之間, 且自不同沉積物的病毒提取率差異較大, 無法使用統(tǒng)一的轉(zhuǎn)換系數(shù)進(jìn)行計算。研究還發(fā)現(xiàn), 自新鮮沉積物獲得的病毒和原核生物提取率較高, 而冷凍后的提取率則明顯下降, 且實驗誤差增大, 這說明冷凍處理可能會改變沉積物和病毒顆粒及原核生物之間的非特異吸附作用(Nobleet al, 1998; Danovaroet al, 2008a)。由此建議,對不同類型沉積物的離心處理應(yīng)單獨測算提取率,對冷凍保存的樣品處理應(yīng)增加樣品的重復(fù)數(shù)和洗滌次數(shù)以降低實驗誤差。對于原核生物的計數(shù), 則應(yīng)另外制片。由于原核生物顆粒較大, 熒光較亮(圖5a, b),沉積物顆粒對原核生物計數(shù)的干擾程度不高, 因此對絕大多數(shù)類型的沉積物都可以采用稀釋處理。

然而, 即便將離心所獲的豐度經(jīng)轉(zhuǎn)換系數(shù)補(bǔ)償后, 也可能與直接稀釋的計數(shù)結(jié)果有較大差異。本研究顯示, 沙質(zhì)沉積物離心所獲病毒豐度僅為稀釋所獲豐度的 76.3%, 泥沙質(zhì)沉積物為 63.1%。所獲沙質(zhì)和泥沙質(zhì)沉積物中原核生物的豐度分別僅為稀釋所得的 28.3%和 19.7%。這說明, 即使通過本文所述的附加數(shù)次清洗的方法測得提取率, 也難以彌補(bǔ)離心處理造成的豐度損失。增加洗滌次數(shù)無疑有助于獲得更為準(zhǔn)確的豐度數(shù)據(jù)(Siem-J?rgensenet al, 2008), 但同時增加了樣品處理的工作量和成本。因此, 建議在處理沉積物樣品時應(yīng)盡量用稀釋的方法, 以獲取更加準(zhǔn)確的豐度數(shù)據(jù)。

4 病毒熒光計數(shù)法流程

基于Danovaro等(2001, 2010)建立的沉積物病毒熒光計數(shù)法, 并結(jié)合本研究的結(jié)果, 提出了如下優(yōu)化的處理流程。

4.1 試劑配制及保存

實驗所用玻璃器皿經(jīng)10% HCl浸泡過夜、蒸餾水充分清洗后, 再以高壓蒸汽(120°C, 20min)滅菌處理; 所用離心管、槍頭等塑料耗材需用高壓蒸汽(120°C, 20min)滅菌處理。

實驗所用海水及蒸餾水需經(jīng)0.22μm孔徑的硝酸纖維素濾膜過濾(直徑 25mm), 并經(jīng)高壓蒸汽(120°C,20min)滅菌后, 再以0.02μm孔徑的Anodisc Al2O3濾膜(Whatman; 25mm直徑)過濾, 裝入滅菌處理后的藍(lán)口瓶儲存; 所用試劑均經(jīng)無菌處理后的蒸餾水配制,再以0.22μm孔徑針頭式過濾器過濾。所用固定液應(yīng)使用無菌處理后的海水配置。

焦磷酸鈉儲備液: 為方便后續(xù)操作, 將焦磷酸鈉儲備液濃度配制為50mmol/L的母液。稱取0.532g焦磷酸鈉(分子量265.90)溶于40mL無菌蒸餾水, 經(jīng)0.22μm孔徑針頭式過濾器過濾, 于4°C避光冷藏保存。

熒光劑保護(hù)劑: 由 PBS(phosphate buffered saline)-甘油溶液和 10%(體積質(zhì)量比)對苯二胺(p-phenylenediamine)溶液混合而成, 兩部分需分開儲存。稱取 0.0425g氯化鈉(NaCl)和0.09g磷酸氫二鈉(Na2HPO4…12H2O)溶解于 5mL 無菌蒸餾水水中配成50% PBS溶液 (Na2HPO4終濃度0.05mol/L, NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.85%), 再加入 5mL甘油充分混勻。所得PBS-甘油溶液經(jīng) 0.22 μm孔徑針頭式過濾器過濾后,小份分裝(990μL一份), -20°C冰箱保存; 稱取0.1g對苯二胺鹽酸鹽(PDA)溶解于 1mL無菌蒸餾水中配成10%對苯二胺溶液, 經(jīng) 0.22μm 孔徑針頭式過濾器過濾后, 小份分裝并于-20°C冷凍暗保存。

臨用前取 10%對苯二胺儲備液融化, 搖勻后吸取 10μL 與 990μL PBS-甘油儲備液混合, 制成工作液。工作液應(yīng)避光冷藏待用, 未用完的工作液可于-20°C短期保存, 建議每次實驗均使用新配置的熒光保護(hù)劑。未用完的10%對苯二胺儲備液應(yīng)立即再行冷凍, 但累計凍、融3次后須丟棄。新配置的對苯二胺儲備液呈淡紫色, 冷凍后呈白色。若儲備液或熒光保護(hù)劑工作液顏色變深則不可使用, 應(yīng)重新配制。

熒光染色劑: 市售SYBR Green I (Sigma), 小份分裝并于-20°C避光保存。臨用前, 取出SYBR Green I儲備液, 用無菌蒸餾水按1: 20稀釋(如50μL儲備液加到 950μL蒸餾水中)配制為工作液。未用完的工作液避光、4°C冷藏, 保存一個月后仍可使用。但使用時, 需加新配制的熒光保護(hù)劑, 否則觀察時熒光亮度不足、淬滅較快。未用完的工作液不能再行冷凍, 反復(fù)凍融對染液影響較大, 因此在分裝儲備液時應(yīng)根據(jù)實驗需要合理控制分裝體積。

需要指出的是, SYBR Gold也是海洋病毒定量中常用的熒光染色劑, 但價格較SYBR Green I更低, 故二者均可擇用。Fischer等(2005)及Duhamel等(2006)提出SYBR Gold對沉積物病毒的染色效果較SYBR更好, 而Hewson等(2003)則認(rèn)為SYBR Green I的效果略佳。

4.2 樣品采集與保存

用滅菌后的采樣勺刮取未受擾動的表層沉積物(目前普遍采取表層 0—1cm)約 50mL, 充分混勻后采集至少3個分樣, 每個 0.5mL, 置于無菌10mL離心管中, 加入無菌海水配制的 2%醛類(甲醛或戊二醛)固定液4.2mL充分混勻, 經(jīng)提取染色制片后計數(shù)或?qū)⒎馄?20°C冰箱保存; 若無法立即制片, 則置于無菌5mL凍存管中, 加入無菌海水配制的2%醛類(甲醛或戊二醛)固定液 4.2mL充分混勻, 于避光處靜置15—30min使樣品充分固定, 之后經(jīng)液氮閃凍后移至-80°C冰箱冷凍保存, 1個月內(nèi)處理。

4.3 沉積物樣品處理流程

(1) 融化: 采取37°C水浴及室溫融化樣品均可。

(2) 表面活性劑處理: 樣品融化后充分搖勻, 加入300μL焦磷酸鈉儲備液(終濃度3mmol/L), 充分混勻后室溫避光孵育15min。

(3) 超聲處理: 孵育之后將樣品充分搖勻, 置于水浴超聲波細(xì)胞破碎儀中超聲處理 3×1min。為避免樣品過熱, 每超聲處理 1min后中斷 30s并手動搖勻樣品。

(4) 稀釋: 采取梯度稀釋的方法以防止因樣品分布不均所造成的誤差。例如稀釋 1000倍, 可取 2個10mL離心管, 每管加入 4.5mL無菌的海水, 先從充分混勻后的樣品管中取0.5mL懸液加入1號管充分混勻, 再從1號管取0.5mL懸液加入 2號管充分混勻,最后從2號管中取0.5mL懸液進(jìn)行過濾。

(5) 離心: 對無法通過稀釋降低沉積物顆粒干擾的樣品應(yīng)進(jìn)行離心。樣品搖勻后離心800g×1min, 對于顆粒較細(xì)、雜質(zhì)較多的沉積可適當(dāng)延長離心時間至3—5min, 離心后取上清液進(jìn)行稀釋。

(6) 提取率: 若在處理中加入離心步驟, 則應(yīng)測算病毒提取率。小心移除剩余上清液, 在離心管中加入4.5mL無菌蒸餾水洗滌剩余沉積物, 充分混勻后再次離心, 取上清液制片。重復(fù)數(shù)次清步驟后, 計數(shù)所有封片的總豐度作為樣品總豐度, 以第一次提取所得豐度除以總豐度計算提取率。

(7) 過濾: 濾筒用蒸餾水仔細(xì)清洗后高溫滅菌。在過濾裝置的濾板上放置孔徑為 0.45μm 孔徑的25mm微孔濾膜作為副膜, 加入無菌蒸餾水抽洗濾筒(若抽洗濾筒后副膜上有肉眼可見雜質(zhì), 則應(yīng)更換副膜)。抽洗后將 Al2O3濾膜仔細(xì)覆蓋于潤濕的副膜上,注意 Al2O3濾膜與副膜之間不可有氣泡, 否則過濾時液體將殘留在 Al2O3濾膜上, 影響后續(xù)操作。在壓力＜250mm 汞柱條件下把樣品抽濾至干, 卸下濾筒, 在真空泵開啟狀態(tài)下取下Al2O3濾膜。由于抽濾速度極慢, 過膜樣品體積不可過多, 一般在0.5—1mL為宜。當(dāng)天使用的濾器, 在各個樣品過濾前抽洗一次, 抽洗時不必取下副膜。

(8) 干燥濾膜: 用低塵紙輕輕擦拭濾膜無樣品面,擦去殘留液體后置于低塵紙上避光靜置至濾膜完全干燥(此時濾膜不透明, 無水跡)。

(9) 染色: 吸取20μL SYBR Green I染色劑工作液滴加在一次性培養(yǎng)皿中, 培養(yǎng)皿及染色劑需置于避光處; 用平頭鑷子夾取干燥后的濾膜, 無樣品面朝下放在培養(yǎng)皿的染色液滴上避光染色20min。染色后用 0.5—1mL無菌蒸餾水沖洗濾膜上殘留的染液, 以降低熒光背景干擾。沖洗后用前述方式干燥濾膜。

(10) 制片: 載玻片中央滴加 5μL熒光保護(hù)劑工作液。待濾膜完全干燥后, 置于載玻片上的液滴當(dāng)中,并在蓋玻片上滴加 25μL熒光保護(hù)劑工作液, 液面朝下蓋緊濾膜(濾膜上下兩面均不能有氣泡)。

(11) 計數(shù): 在熒光顯微鏡藍(lán)色激發(fā)光道和油鏡下, 視野中可見病毒顆粒呈針扎狀、亮綠色。隨機(jī)取不重復(fù)視野計數(shù)病毒顆粒數(shù), 每張封片至少計數(shù) 400個病毒顆?；?0個視野。計數(shù)前應(yīng)先通過低倍鏡對封片上顆粒分布的均勻性進(jìn)行評估, 選取分布較為均勻的區(qū)域進(jìn)行計數(shù), 顆粒分布過于不均的封片應(yīng)舍棄。

原核生物豐度較高時也可從同一張封片上計數(shù)。在熒光顯微鏡藍(lán)色激發(fā)光道和油鏡下, 視野中可見原核生物顆粒呈明亮、規(guī)則的桿狀或球狀, 大小約為0.2—2μm。隨機(jī)取不重復(fù)視野計數(shù)原核生物顆粒數(shù),每個樣品至少計數(shù)400個原核生物或40個視野。若樣品經(jīng)離心處理, 則建議原核生物另外制片計數(shù)。

(12) 病毒豐度計算公式:

式中:

N —— 樣品含病毒數(shù), 單位為病毒樣顆粒數(shù)每克沉積物干重(VLP/g);

Na——各視野平均病毒數(shù), 單位為 VLP(virus like particles);

S —— 濾膜實際過濾面積, 單位為平方毫米(mm2);

Sf—— 顯微鏡視野面積, 單位為平方毫米(mm2);

M —— 0.5mL沉積物干重, 單位為克(g);

D—— 樣品稀釋倍數(shù);

CF —— 轉(zhuǎn)換系數(shù)(處理過程中有離心步驟時應(yīng)測算此系數(shù), 計算方法為1/提取率)。

5 結(jié)論

利用 SYBR Green I等高亮度熒光染色劑染色,以熒光顯微鏡進(jìn)行觀察計數(shù)是沉積物病毒定量研究最通行的方法。但對于該法技術(shù)流程中一些至關(guān)重要的實驗條件及處理方式, 要么未行實驗驗證, 要么未行統(tǒng)一。本研究采用不同類型海洋沉積物, 對現(xiàn)行的病毒熒光計數(shù)法的主要實驗流程及條件進(jìn)行了效能評估和優(yōu)化, 通過實驗檢驗和分析, 提出了一套優(yōu)化的沉積物病毒熒光計數(shù)法流程。實驗結(jié)果表明, 本文提出的技術(shù)流程可重復(fù)性較強(qiáng), 適用于從近海到深海的多種類型沉積物病毒的定量分析, 獲得可靠的沉積物病毒定量數(shù)據(jù)。

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