陳興強(qiáng) 李榮華 王春琳① 胡益鳴 程繼生 王 成詹萍萍 母昌考 宋微微 龔小敏

(1. 寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 寧波 315211; 2. 浙江海洋高效健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心寧波 315211; 3. 象山鶴浦鎮(zhèn)人民政府海洋與漁業(yè)辦公室 象山 315733)

紫貽貝(Mytilus edulis)是一種營足絲固著生活的貝類, 在大西洋、北美洲沿岸等地均有分布。在我國原主要分布于北方, 1973年后南移到浙江嵊泗海域,現(xiàn)主要為人工養(yǎng)殖種類, 當(dāng)?shù)厝擞纸小梆B(yǎng)殖淡菜”(張義浩, 2009)。紫貽貝成體殼長一般在6—8cm, 個(gè)體較小, 殼薄。

與紫貽貝同為貽貝屬的厚殼貽貝(Mytilus coruscusGould), 是浙江沿海本地優(yōu)勢種類, 俗稱“野生淡菜”(張義浩, 2009), 成體一般殼長在 10—12cm,由于其個(gè)頭大, 肉質(zhì)厚實(shí), 肉味鮮美, 被越來越多的養(yǎng)殖戶所青睞。但長期近親繁育、累代養(yǎng)殖, 導(dǎo)致貝類出現(xiàn)近交衰退, 種質(zhì)逐年下降, 表現(xiàn)為生長緩慢、經(jīng)濟(jì)性狀下降、抗逆性降低等等(張玉勇等, 2005), 嚴(yán)重影響了當(dāng)?shù)刎愵愷B(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。雜交育種是改良遺傳性狀、培育優(yōu)良品種的可靠途徑之一(Argueet al, 2014; 官俊良等, 2016; Marulandaet al, 2016)。近年來, 我國學(xué)者進(jìn)行了較多有關(guān)海洋貝類種間雜交的實(shí)驗(yàn): 孫長森等(2007)研究了華貴櫛孔扇貝和櫛孔扇貝種間的雜交, 蔡明夷等(2007)報(bào)道了雜色鮑與盤鮑的種間雜交試驗(yàn), 張躍環(huán)等(2012a, b)開展了太平洋牡蠣與近江牡蠣的種間雜交試驗(yàn)以及香港巨牡蠣與長牡蠣的種間雜交試驗(yàn), 張守都(2013)開展了海灣扇貝和秘魯紫扇貝的種間雜交試驗(yàn), 證實(shí)了海洋貝類雜交育種的可行性且后代具有一定的雜交優(yōu)勢。

不同種類貽貝在自然分布重疊的環(huán)境中存在雜交現(xiàn)象, 表現(xiàn)出基因漂移與漸滲(Secoret al, 2001;Hilbishet al, 2002; Toroet al, 2002; Brabyet al,2006)。?？姑赖?2008)于 2006年進(jìn)行了厚殼貽貝與紫貽貝的人工雜交育苗生產(chǎn)性實(shí)驗(yàn), 發(fā)現(xiàn)正交F1代:紫貽貝×厚殼貽貝在存活率和生長速度上相比自交組均表現(xiàn)出生長優(yōu)勢。本研究以紫貽貝和厚殼貽貝為材料進(jìn)行雜交試驗(yàn), 采用熒光顯微觀察方法, 對其受精和早期卵裂過程中核行為的細(xì)胞學(xué)變化進(jìn)行觀察, 并對雜交后代早期的生長狀況進(jìn)行比較, 以期為貽貝新品種選育提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)于2015年12月—2016年4月在寧波兢業(yè)水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司進(jìn)行。紫貽貝(Mytilus edulis)與厚殼貽貝(M. coruscus)于2015年12月采自浙江省象山縣漁山列島。將親貝懸掛在 16℃水溫的海水中進(jìn)行暫養(yǎng)促熟, 每天定時(shí)定量投喂球等鞭金藻(Isochrysis galbana)和牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri), 流水培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

建立紫貽貝和厚殼貽貝 2個(gè)雜交組和 2個(gè)自交組。雜交組包括紫貽貝♀×厚殼貽貝(EC,正交)和厚殼貽貝♀×紫貽貝(CE, 反交); 自交組包括厚殼貽貝♀×厚殼貽貝(CC)和紫貽貝♀×紫貽貝(EE)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 催產(chǎn)與人工受精 挑選健壯、個(gè)大、無損傷的親貝, 剪斷足絲, 清洗掉殼表面的黏附物, 放在1×10－6濃度的高錳酸鉀溶液里浸泡 2—3min, 期間不斷攪拌貝體, 防止貽貝開殼吸入高錳酸鉀溶液。消毒后用干凈海水沖洗貝體, 采用陰干升溫流水刺激法催產(chǎn)。觀察到開始排放精卵的雌雄紫親貝時(shí), 將其單個(gè)挑揀出, 仔細(xì)清洗殼面和外套膜部位, 單獨(dú)放在盛有海水的干凈消毒的 2L塑料盒里繼續(xù)排放, 精卵待排放完畢后, 挑選 4—6個(gè)紫貽貝的精子進(jìn)行混合,4—6個(gè)紫貽貝的卵子進(jìn)行混合, 厚殼貽貝也相同操作, 得到分別盛有紫、厚貽貝的精液和卵液共四份,鏡檢確定無污染后, 按設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行精卵混合受精, 控制精子的濃度, 以一個(gè)卵子周圍 5—8個(gè)為宜。受精卵分別在4個(gè)90L聚乙烯桶中孵化, 孵化過程微量充氣, 水溫保持在16℃。

1.3.2 胚胎發(fā)育過程取樣 受精25min后, 用400目的撈網(wǎng)取卵子樣品, 此后2h內(nèi)每隔10min取樣一次, 用2%海水稀釋的甲醛溶液固定于2mL離心管中,放于陰涼干燥處或4℃冰箱里儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 幼蟲培育 40h后, 受精卵均孵化成D形幼蟲, 用虹吸法進(jìn)行 100%換水, 統(tǒng)計(jì)幼蟲數(shù)量, 計(jì)算各組孵化率, 控制在 15—20ind/mL的幼蟲數(shù)量。此后每周 100%換水兩次, 每天定時(shí)投喂金藻和角毛藻的混合藻液, 藻液濃度以100×104ind/mL為宜。培育過程中每組均設(shè)單獨(dú)換水器具, 避免交叉污染。

1.4 數(shù)據(jù)測量與分析

1.4.1 受精細(xì)胞學(xué)觀察 取各組甲醛溶液固定的胚胎樣品, 用0.1mol/L磷酸緩沖液PBS (pH=7.4)清洗一次, 離心數(shù)秒吸出上清液, 滴加Hoechst 33258 (上海碧云天生物技術(shù)有限公司)熒光染料, 放在黑暗環(huán)境里染色5—8min后, 用PBS清洗一次, 在Olympus DP-73熒光顯微鏡(UV365nm)下觀察、統(tǒng)計(jì)和拍照。

1.4.2 生長數(shù)據(jù)測量 從 D 形幼蟲開始, 每隔四天隨機(jī)抽取各組 20—30個(gè)幼蟲進(jìn)行殼長和殼高的測量。每次換水時(shí), 統(tǒng)計(jì)幼蟲數(shù)量, 計(jì)算成活率。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)各組生長及存活數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差, 并進(jìn)行單因素方差分析及Duncan多重比較分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞學(xué)觀察

細(xì)胞經(jīng)熒光染料染色后, 在365nm激發(fā)光下, 胞內(nèi)核物質(zhì)發(fā)出亮藍(lán)色熒光, 可以清晰的看到各組減數(shù)分裂和卵裂過程的核相變化(圖 1—圖 4)。在 16℃水溫的條件下, 自交組EE和CC受精及早期卵裂過程中的核相變化見圖3、圖4, 雜交組EC和CE受精率及受精卵發(fā)育速度與自交組差異較大, 存在較多多精入卵導(dǎo)致發(fā)育停止的現(xiàn)象,但正常發(fā)育的受精卵核相變化過程與自交組無明顯差別(圖1, 圖2)。在此以反交組 CE(厚殼貽貝♀×紫貽貝)為例, 詳述卵子受精和早期卵裂的核相變化過程(表1, 圖1)。

2.2 卵子受精和受精卵卵裂的統(tǒng)計(jì)

熒光顯微觀察發(fā)現(xiàn), 各實(shí)驗(yàn)組均存在發(fā)育不同步、多個(gè)發(fā)育階段并存的現(xiàn)象(表2)。受精后第25min,所有實(shí)驗(yàn)組均能觀察到未受精卵至第二極體的胚胎發(fā)育階段。其中反交組CE未受精卵較多; 自交組EE和CC較多受精卵發(fā)育到第二極體, 約占受精卵數(shù)目的 35%和37%; 雜交組 EC和 CE第一極體較多, 發(fā)育到第二極體的受精卵僅占9.5%和11.5%。受精后第45min, 各實(shí)驗(yàn)組發(fā)育不同步現(xiàn)象明顯, EC組大部分處于原核融合期, 占47.5%, 而EE、CC和CE組均有部分受精卵已發(fā)育到二細(xì)胞。受精后第 65min, 各實(shí)驗(yàn)組大部分均處于二細(xì)胞階段。受精后第 75min, 各

實(shí)驗(yàn)組四細(xì)胞比例增多, 且均存在少數(shù)八細(xì)胞, 受精率 CC＞EE＞EC＞CE。

圖1 厚殼貽貝♀×紫貽貝雜交受精卵的減數(shù)分裂和卵裂過程(×400)Fig.1 The process of meiosis and cleavage in eggs of the cross M. coruscus♀×M. edulis (×400)

圖2 紫貽貝♀×厚殼貽貝雜交卵子的減數(shù)分裂和卵裂過程(×400)Fig.2 The process of meiosis and cleavage in eggs of the cross M. edulis♀×M. coruscus (×400)

圖3 紫貽貝♀×紫貽貝自交卵子的減數(shù)分裂和卵裂過程(×400)Fig.3 The process of meiosis and cleavage in eggs of the cross M. edulis♀×M. edulis (×400)

圖4 厚殼貽貝♀×厚殼貽貝自交卵子的減數(shù)分裂和卵裂過程(×400)Fig.4 The process of meiosis and cleavage in eggs of the cross M. coruscus♀×M. coruscus (×400)

表1 厚殼貽貝♀×紫貽貝♂雜交受精卵的減數(shù)分裂和卵裂過程Tab.1 The process of meiosis and cleavage in eggs of the cross M. coruscus♀×M. edulis♂

表2 各實(shí)驗(yàn)組受精后處于各發(fā)育階段的卵子百分比(%)Tab.2 The percentage of eggs in different developmental stages after fertilization of the four crosses (%)

2.3 幼蟲的生長及存活情況

各實(shí)驗(yàn)組幼蟲的生長情況見表3。剛孵化的D形幼蟲, 各組殼高在100—120μm之間。第1—5天, 幼蟲生長較慢, 平均日生長量5μm左右。第5—9天, 各組生長變化較為接近。第9—13天, 自交組生長速率超過雜交組。第13—17天, 各組幼蟲生長較快, 生長率為EE＞CE＞EC＞CC, EE、CC與 CE組均在 17—21天內(nèi)出現(xiàn)眼點(diǎn), EC組在21—25天出現(xiàn)眼點(diǎn)。第29天,EE與CE組殼長均超過殼高, 但生長差異較大, 此時(shí)殼長EE＞EC＞CE＞CC, EE、EC、CE組均完成附著變態(tài)。CC組在第29—33天殼長與殼高變化相對其他各組較小, 變態(tài)時(shí)間長達(dá) 7—8天, 這可能是導(dǎo)致厚殼貽貝育苗成活率低的原因。幼蟲完成變態(tài)以后, 生長速率加快, 最明顯的是 EC, 在 29—33天, 生長率達(dá)到104%, 平均日生長長度達(dá)到85μm。在43—53天,EE和CC生長較慢, EC的雜交優(yōu)勢表現(xiàn)明顯, 殼長均超過了2mm。第50天時(shí), 對4個(gè)實(shí)驗(yàn)組的稚貝數(shù)量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì), 獲得平均殼長 0.98mm的 EE組附著稚貝51.58×104個(gè), 平均殼長0.95mm的CC組附著稚貝17.12×104個(gè), 平均殼長 2.07mm 的 EC組附著稚貝9.24×104個(gè), 平均殼長 1.82mm 的 CE組附著稚貝5.08×104個(gè)。養(yǎng)殖成活率 EE＞CC＞EC＞CE(表 4)。

表4 各實(shí)驗(yàn)組受精率、孵化率和成活率的比較Tab.4 Fertilization rate, hatching rate and survival rate in four experimental groups

3 討論

本研究采用熒光顯微觀察的方法對紫貽貝與厚殼貽貝受精和早期卵裂過程中核行為的細(xì)胞學(xué)變化進(jìn)行觀察(圖1—圖4), 結(jié)果表明紫貽貝與厚殼貽貝正反交的受精細(xì)胞學(xué)過程和自交無明顯區(qū)別, 精子進(jìn)入一個(gè)異源卵子, 激活卵子完成兩次減數(shù)分裂和卵裂。但雜交組胚胎發(fā)育速度明顯慢于自交組, 受精后25min, 雜交組第二極體釋放所占比例遠(yuǎn)低于第一極體釋放, 而自交組這兩個(gè)階段則的胚胎比率接近于1:1。說明異源精子對卵子的識別是一個(gè)緩慢適應(yīng)和協(xié)調(diào)的過程。之后的取樣觀察發(fā)現(xiàn), 雜交組發(fā)育并未出現(xiàn)明顯的發(fā)育延后, 發(fā)育階段較為統(tǒng)一。表明異源精子識別的過程可能是延緩其胚胎發(fā)育的原因之一,其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

關(guān)于貝類種間雜交的研究中, 有較多的物種雜交能實(shí)現(xiàn)雙向受精, 但正、反交組受精率卻不盡相同,如紫貽貝Mytilus edulis×翡翠貽貝Perna viridis(陳新祥等, 1976)、太平洋牡蠣Crassostrea gigas×近江牡蠣Crassostrea rivularis(Allen Jret al, 1993)、紫貽貝Mytilus edulis×地中海貽貝Mytilus galloprovincialis(Beaumontet al, 2004)、長牡蠣Crassostrea gigas×熊本牡蠣Crassostrea sikamea(滕爽爽等, 2010)等。本研究中紫貽貝和厚殼貽貝的正反交組均能受精, 但正交組EC受精率高達(dá)82.0%, 而反交組CE僅有50.5%,兩組也存在較大的受精率差異。許飛(2009)提出卵子表面的受精相關(guān)物質(zhì)是在其遺傳背景的指導(dǎo)下形成的, 部分基因型形成的卵子可以與外源精子結(jié)合發(fā)生受精作用, 而那些不相容的配子不能發(fā)生受精作用。本研究的正反交組均能受精, 說明母本表達(dá)結(jié)合素(bindin)、細(xì)胞溶素(lysin)等合成的基因能與異源配子兼容。而不對稱受精現(xiàn)象的發(fā)生, 則可能跟母本的精子結(jié)合素蛋白的表達(dá)強(qiáng)弱有關(guān)。

?？姑赖?2007)通過厚殼貽貝與紫貽貝的人工雜交育苗生產(chǎn)性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 正交F1代紫貽貝♀×厚殼貽貝在經(jīng)過近 37天的培養(yǎng)后, 生長率和成活率均顯著超過自交組與反交組, 在第 37天的殼長生長速度是厚殼貽貝的 162%。在本實(shí)驗(yàn)中, 雜交組幼蟲在浮游階段并未表現(xiàn)出明顯的生長優(yōu)勢, 而正交組 EC在經(jīng)過附著變態(tài)以后生長迅速, 在 29—38天殼長生長率達(dá)到275.0%, 在第38天時(shí)殼長比自交組EE高56.39%, 比CC高出226%, 與?？姑缊?bào)道較一致。本研究中反交組CE在附著后個(gè)體間生長差異明顯增大,推測可能存在多方面原因, 例如較優(yōu)的附著位置、異源精子刺激下導(dǎo)致雌核發(fā)育等, 具體情況有待進(jìn)一步研究。陳新祥等(1976)對紫貽貝♀×翡翠貽貝的雜交實(shí)驗(yàn)中, 也觀察到雜種優(yōu)勢出現(xiàn)于附著后的情況。但貝類雜交后代的生長情況呈現(xiàn)出比較大的差異性,如海灣扇貝秘魯紫扇貝正反交組在 1—10天均表現(xiàn)出了雜種優(yōu)勢, 在第10天雜交組殼長遠(yuǎn)大于純種組,雜種優(yōu)勢達(dá) 21.43%(張守都, 2013); 長牡蠣和近江牡蠣正反交組在浮游期的 12天內(nèi)都為正向雜種優(yōu)勢,而在 12天后雜種優(yōu)勢下降, 經(jīng)歷了一個(gè)正向到負(fù)向的過程。推測可能是配子兼容性發(fā)揮作用, 不利于浮游期幼苗的生長(姚托, 2014)。說明同為雙殼貝類, 雜交后代可能表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢, 也會(huì)存在雜種劣勢, 說明在雙親遺傳差異、遺傳背景、所攜帶等位基因還有環(huán)境等因素的不同下, 會(huì)得到不一樣的雜交結(jié)果, 顯示出了親本選擇的重要性。

4 結(jié)論

本研究采用熒光顯微觀察的方法, 對紫貽貝與厚殼貽貝雜交及自交組受精卵的核行為進(jìn)行了細(xì)胞學(xué)觀察, 并對早期子代生長情況進(jìn)行了比較, 研究發(fā)現(xiàn)雜交組正常發(fā)育的受精卵核相變化過程與自交組無明顯差別, 但受精率、孵化率、成活率均低于自交組; 正交組在附著變態(tài)后表現(xiàn)出明顯的生長優(yōu)勢。本研究結(jié)果為進(jìn)一步解析貽貝的雜交機(jī)理提供了理論參考, 并為貽貝雜交育種提供了一定的實(shí)踐依據(jù)。

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