吳發(fā)帥， 高 楓， 浦飛飛， 邵增務(wù)

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院骨科，武漢 430022

長鏈非編碼RNA在骨肉瘤中的研究進(jìn)展

吳發(fā)帥， 高 楓， 浦飛飛， 邵增務(wù)△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院骨科，武漢 430022

長鏈非編碼RNA； 骨肉瘤； 分子標(biāo)志物

骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)是青少年最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，年發(fā)病率為(1～4)/100萬，男女發(fā)病率之比為1.22∶1[1]。骨肉瘤患者預(yù)后極差，目前我國骨肉瘤患者的5年生存率為37.5%～77.6%，而治療后復(fù)發(fā)、肺部轉(zhuǎn)移的患者，其平均生存時(shí)間更是不超過1年[2-3]。因此，為提高骨肉瘤患者的診治率及改善預(yù)后，進(jìn)一步探究骨肉瘤發(fā)病分子機(jī)制，找尋新的早期診斷、預(yù)后判斷分子標(biāo)志物及靶向治療位點(diǎn)顯得尤為迫切。

以往，骨肉瘤分子機(jī)制研究多集中于蛋白質(zhì)編碼基因，而將非蛋白質(zhì)編碼基因視為“垃圾”序列[4]。來源于非蛋白質(zhì)編碼基因的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一類長度大于200 nt，不具有或僅具有少許蛋白質(zhì)編碼能力的內(nèi)源性RNA序列[5]。近年來研究表明，LncRNA可在染色體修飾、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平等多層面上發(fā)揮調(diào)控作用，廣泛參與腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡及耐藥等生物學(xué)過程[6]。因LncRNA所顯露出的抑瘤或致瘤效應(yīng)，及其在腫瘤的診治及預(yù)后判斷中的潛在巨大作用，其已成為繼microRNA后腫瘤研究的新熱點(diǎn)。本文就LncRNA在骨肉瘤中的研究進(jìn)展作一綜述，旨在為骨肉瘤的進(jìn)一步研究及提出新的有效的診療策略提供有益指導(dǎo)。

1 LncRNA對骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展的影響

Li和Liu等[7-8]運(yùn)用微矩陣基因芯片技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，較于瘤旁非腫瘤組織，骨肉瘤組織中某些LncRNA表達(dá)下調(diào)，另一些LncRNA表達(dá)上調(diào)。這些LncRNA可通過多種途徑、機(jī)制對骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展起抑制或促進(jìn)作用。

1.1 LncRNA抑制骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展

截止目前，細(xì)胞水平驗(yàn)證對骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展起抑制作用的LncRNA有：MEG3[9]、TUSC7[10]、HIF2PUT[11]、LOC285194[12]等。Zhou等[9]在HCT116及U2OS細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，MEG3主要通過抑制MDM2的表達(dá)，使p53蛋白水平增高，促進(jìn)p53蛋白結(jié)合至GDF15啟動子近端的p53蛋白結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)GDF15表達(dá)而發(fā)揮抗腫瘤作用。骨肉瘤組織中TUSC7的表達(dá)水平降低，降低骨肉瘤細(xì)胞中TUSC7的表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖與集落形成，抑制細(xì)胞凋亡；在裸鼠異種腫瘤移植模型中，TUSC7低表達(dá)可顯著促進(jìn)骨肉瘤的生長[10]。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)骨肉瘤組織、細(xì)胞中HIF-2 mRNA表達(dá)水平與HIF2PUT表達(dá)水平相關(guān)，HIF2PUT可通過HIF-2發(fā)揮骨肉瘤抑制作用，若降低HIF2PUT的表達(dá)，骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移能力明顯提高，若增加HIF2PUT的表達(dá)則得到相反的結(jié)果。LOC285194位于osteo3q13.31位點(diǎn)，Pasic等[12]首先報(bào)道osteo3q13.31基因表達(dá)水平降低可能是骨肉瘤發(fā)生多步驟過程中的早期事件，但其具體機(jī)制還未明確。這些LncRNA對骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展的抑制作用，提示我們可以上調(diào)某些LncRNA的表達(dá)來作為骨肉瘤的治療策略，但此設(shè)想的具體臨床運(yùn)用尚需更深入的探究。

1.2 LncRNA促進(jìn)骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展

1.2.1 LncRNA通過影響基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮調(diào)節(jié)作用 LncRNA可在表觀遺傳及轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控、影響相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮促瘤作用。例如：ZEB1-AS1可招募p300并結(jié)合至ZEB1基因啟動子區(qū)域，誘導(dǎo)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)開放，表觀活化ZEB1基因，促使ZEB1基因轉(zhuǎn)錄，而促進(jìn)骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展[13]；EWSAT1可通過與HNRNPK(核內(nèi)不均一核糖核蛋白)的相互作用在轉(zhuǎn)錄水平抑制LncRNA MEG63的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)骨肉瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[14]。此外，Bida等[15]發(fā)現(xiàn)LncRNA MA-linc1至少可部分通過順式作用抑制鄰近pura基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程。有研究提示PACER可在轉(zhuǎn)錄水平上激活COX-2基因表達(dá)而促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移[16-17]；還有，陳聲燦等[18]研究表明BCAR4可與GLI2靶基因(包括RPS3、IL-6、MUC5AC、TGF-β1等)的啟動子相互作用，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，使RPS3、IL-6、MUC5AC和TGF-β1等表達(dá)水平增高，促進(jìn)骨肉瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移，若降低BCAR4的表達(dá)水平，骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移能力則被抑制。

1.2.2 LncRNA在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)節(jié)作用 Fang等[19]發(fā)現(xiàn)高濃度雌炔醇可上調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中miR-9水平，促進(jìn)miR-9與MALAT1的相互作用，使MALAT1降解而抑制骨肉瘤發(fā)展，這表明microRNA可通過LncRNA發(fā)揮作用。反之，我們也發(fā)現(xiàn)，有些LncRNA可通過作為競爭性內(nèi)源RNA與microRNA結(jié)合，抑制microRNA活性而促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。例如：LncRNA TUG1作為競爭性內(nèi)源RNA與miR-9-5p、miR-335-5p結(jié)合，下調(diào)microRNA的水平，使POU2F1、ROCK1等表達(dá)水平升高，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，抑制凋亡[20-23]；LncRNA PVT1作為競爭性內(nèi)源RNA而調(diào)節(jié)miR-195的水平，影響骨肉瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為[24]。Chan等[25]的研究表明，小鼠成熟成骨細(xì)胞中Hedgehog(Hh)信號上調(diào)，可以使Yap1和LncRNA H19表達(dá)增高而促進(jìn)成骨細(xì)胞型骨肉瘤的發(fā)生；在進(jìn)一步研究中，Li等[26]發(fā)現(xiàn)LncRNA H19通過與miR-200家族(包括miR-200a、miR-200b、miR-200c等)的競爭性結(jié)合，造成miR-200水平降低，使miR-200與ZEB1 mRNA、ZEB2 mRNA的3’UTR的作用減弱，ZEB1和ZEB2表達(dá)水平增高，促進(jìn)骨肉瘤轉(zhuǎn)移和侵襲。Taniguchi等[27]應(yīng)用合成的吡咯咪唑聚酰胺(Myc-6)可部分下調(diào)MALAT1水平而發(fā)揮骨肉瘤抑制作用；Luo等[28]研究揭示，MALAT1能直接與miR376a相互作用，降低miR376a水平，使TGF-α表達(dá)增高，促進(jìn)骨肉瘤進(jìn)展。

除與microRNA發(fā)生相互作用外，LncRNA還可通過與mRNA直接相互作用及其他多種方式在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)節(jié)功能。例如：Sun等[29]研究顯示FGFR3-AS1(LncRNA-BX537709)通過與其自然反義轉(zhuǎn)錄本FGFR3 3’UTR的相互作用，增加FGFR3 mRNA的穩(wěn)定性，使FGFR3的含量增高，促進(jìn)骨肉瘤發(fā)展；SATB2-AS1通過在翻譯水平上影響SATB2基因的表達(dá)而促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖、生長[8]；SPRY4-IT1通過翻譯后修飾調(diào)節(jié)Snail蛋白的穩(wěn)定性而抑制E-cadherin的表達(dá)水平，誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[30]；MALAT1通過與SFPQ的相互作用，使SFPQ與PTBP2的相互作用減弱而影響骨肉瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為[19]。

1.2.3 LncRNA通過影響信號通路發(fā)揮調(diào)控作用信號通路異?？捎绊慙ncRNA表達(dá)水平[25]，反之，LncRNA也可通過影響信號通路發(fā)揮腫瘤調(diào)控作用。例如：有研究在細(xì)胞水平揭示HNF1A-AS1、HOTTIP可通過激活Wnt/beta-catenin通路而促進(jìn)骨肉瘤的進(jìn)展，若降低骨肉瘤細(xì)胞中HNF1A-AS1、HOTTIP表達(dá)水平可下調(diào)Wnt/beta-catenin通路的活性，發(fā)揮骨肉瘤抑制作用，而應(yīng)用Wnt/beta-catenin通路激活劑則可逆轉(zhuǎn)HNF1A-AS1、HOTTIP低表達(dá)所引起的骨肉瘤抑制效應(yīng)[31-33]。另外，Cai和Dong等[34-35]的研究分別揭示MALAT1可通過RhOA/ROCK通路和PI3K/Akt通路促進(jìn)骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展，降低MALAT1水平后，骨肉瘤細(xì)胞中RhoA、ROCKs及PCNA、MMP-9、磷酸化的PI3Kp85α、Akt等表達(dá)水平均降低。Feng等[20]的研究表明TUG1至少可部分通過Akt通路促進(jìn)骨肉瘤的發(fā)展。

p53蛋白是多條信號通路中的關(guān)鍵分子，多種LncRNA可通過影響p53蛋白而調(diào)節(jié)骨肉瘤發(fā)生發(fā)展，例如MEG3[9]、HOTAIR[36]、PANDA[37]等。HOTAIR即HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA，研究表明HOTAIR至少可部分通過調(diào)控p53蛋白而促進(jìn)骨肉瘤發(fā)生發(fā)展，降低骨肉瘤細(xì)胞中HOTAIR表達(dá)水平后，TGF-β和Bcl-2表達(dá)顯著降低，p53和TNF-α表達(dá)水平顯著增高，同時(shí)MMP-2和MMP-9的分泌減少[36，38]。還有研究顯示，多柔比星或依托泊甙可造成骨肉瘤細(xì)胞DNA損傷并促進(jìn)PANDA的表達(dá)，在DNA損傷情況下，PANDA通過提高p53蛋白穩(wěn)定性而抑制骨肉瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞生存[37]；而在DNA未受損情況下，PANDA通過抑制P18轉(zhuǎn)錄而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞G1-S期的進(jìn)程，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖[39]。

1.2.4 其他機(jī)制 LncRNA除由上述機(jī)制調(diào)控骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展外，還可通過其他機(jī)制發(fā)揮作用。例如：Yin等[40]發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組織中FOXP4表達(dá)水平與LncRNA MFI2的表達(dá)水平正相關(guān)，MFI2可通過調(diào)節(jié)FOXP4的表達(dá)而促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Ruan等[41]的研究顯示，骨肉瘤中AMOT mRNA表達(dá)水平與SNHG12表達(dá)水平正相關(guān)，SNHG12能通過上調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中AMOT基因的表達(dá)而促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移。Min等[42]的研究發(fā)現(xiàn)，ANCR在骨肉瘤中起致瘤作用，可以促進(jìn)骨肉瘤的增殖，降低骨肉瘤細(xì)胞中ANCR水平可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和集落形成，同時(shí)骨瘤細(xì)胞內(nèi)p21水平增高而CDK2水平降低。由此可見，這些LncRNA的作用機(jī)制并未十分清楚，需要進(jìn)一步闡明。

還有些LncRNA也可促進(jìn)骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展。Naemura等[43]在非小細(xì)胞肺癌、宮頸癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)ANRIL可通過抑制與細(xì)胞周期相關(guān)的P15或其他基因的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，而在骨肉瘤中，Wei等[44]研究表明，在缺氧條件下，HIF1-α通過直接結(jié)合ANRIL上游區(qū)域的缺氧反應(yīng)元件，促進(jìn)ANRIL的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)缺氧骨肉瘤細(xì)胞侵襲，抑制凋亡，但ANRIL對骨肉瘤的具體促進(jìn)機(jī)制并不明確。Sun等[45]發(fā)現(xiàn)骨肉瘤組織、細(xì)胞中HULC水平增高，降低U2OS細(xì)胞中HULC的表達(dá)可以顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為；Xia等[46]揭示骨肉瘤患者血清及骨肉瘤細(xì)胞中LncRNA 91H的水平增高，降低骨肉瘤細(xì)胞中91H水平可以抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡；Zhou等[47]降低骨肉瘤細(xì)胞CCAL的表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力；Li等[48]的研究表明，調(diào)高UCA1表達(dá)可促進(jìn)骨肉瘤的進(jìn)展，而降低UCA1水平則抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移，促進(jìn)凋亡；另外，F(xiàn)an等[49]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Oct4可通過調(diào)節(jié)LncRNA AK055347促進(jìn)骨肉瘤進(jìn)展，降低Oct4的水平可以使AK055347的水平下降，并抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲，促進(jìn)凋亡；這些LncRNA對骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展的作用機(jī)制都有待研究。

2 LncRNA與骨肉瘤化療敏感性

研究顯示，某些LncRNA可影響骨肉瘤對化療藥物的敏感性。Zhu等[50]發(fā)現(xiàn)MG63/DXR細(xì)胞系中有些LncRNA表達(dá)水平上升，另一些LncRNA表達(dá)下降，其中LncRNA EST00000563280(即ODRUL、FOXC2-AS1)表達(dá)升高最多，NR-036444表達(dá)降低最多。他們預(yù)測ODRUL和NR-036444可能通過調(diào)節(jié)MAPK、NF-κB等通路中的某些基因及多種經(jīng)典MDR基因(包括ABCB1、HIF1A、FOXC2等)的表達(dá)而影響MG63/DXR細(xì)胞對阿霉素的敏感性。隨后，Zhang等[51]的細(xì)胞學(xué)研究證實(shí)，ODRUL可促進(jìn)ABCB1基因的表達(dá)，使p-gp水平增高而增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞對阿霉素耐藥。

Wang等[52]研究發(fā)現(xiàn)，順鉑可使骨肉瘤細(xì)胞LINC00161表達(dá)增高，并通過LINC00161-miR-645-IFIT2路徑促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡；在對順鉑耐藥的骨肉瘤細(xì)胞系中，LINC00161的表達(dá)水平降低，若調(diào)高LINC00161水平則可通過LINC00161-miR-645-IFIT2路徑逆轉(zhuǎn)骨肉瘤對順鉑的耐藥性。Li等[32]發(fā)現(xiàn)，HOTTIP可通過激活wnt/β-catenin通路增強(qiáng)MG63細(xì)胞對順鉑的耐藥性；若降低HOTTIP水平，則骨肉瘤細(xì)胞對順鉑敏感性增強(qiáng)。

Feldstein等[53]以依托泊甙處理骨肉瘤細(xì)胞使DNA損傷，可造成細(xì)胞凋亡和LncRNA XLOC006942(即ERIC)表達(dá)水平上升；若同時(shí)抑制ERIC的水平，則可進(jìn)一步促進(jìn)依托泊甙誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，表明ERIC可抑制骨肉瘤細(xì)胞對依托泊甙的敏感性。

Bida等[15]的研究表明，LncRNA MA-linc1在促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞周期進(jìn)程及影響細(xì)胞對紫杉醇敏感性中具有作用。紫杉醇是通過抑制M期細(xì)胞微管解聚而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的，若降低骨肉瘤細(xì)胞中MA-linc1水平，則可使M期腫瘤細(xì)胞增多，進(jìn)而增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞對紫杉醇的敏感性，使骨肉瘤細(xì)胞凋亡增加。

Fellenberg等[54]在一項(xiàng)包含35例高度惡性骨肉瘤患者的研究中發(fā)現(xiàn)：與化療反應(yīng)較好組相比較，化療效應(yīng)差組的MALAT1平均表達(dá)水平升高5.97倍，表明MALAT1水平與患者化療敏感性顯著相關(guān)，但MALAT1影響化療敏感性的具體機(jī)制并不明確。

3 LncRNA表達(dá)水平與骨肉瘤患者預(yù)后的關(guān)系

骨肉瘤惡性程度高，易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差，早期診斷和準(zhǔn)確判斷預(yù)后有助于疾病的及時(shí)、規(guī)范治療，改善臨床結(jié)局，故積極挖掘、尋找合適的早期診斷和預(yù)后判斷分子標(biāo)志物具有重要臨床意義[55]。LncRNA與骨肉瘤患者預(yù)后關(guān)系的相關(guān)研究結(jié)果如表1，但是，LncRNA能否作為骨肉瘤早期診斷和預(yù)后判斷的分子標(biāo)記物，還須長期臨床實(shí)踐的檢驗(yàn)。

4 結(jié)語與展望

相對于蛋白編碼基因及miRNA的研究，LncRNA的研究還處于起步階段。截止目前，進(jìn)行過細(xì)胞水平探究且與骨肉瘤密切相關(guān)的LncRNA僅幾十個(gè)，其他LncRNA對骨肉瘤的影響及機(jī)制還未闡明。在這些已研究的LncRNA中，有些在骨肉瘤中低表達(dá)，有些在骨肉瘤中高表達(dá)，相關(guān)研究初步揭示了引起LncRNA在骨肉瘤中異常表達(dá)的機(jī)制以及LncRNA異常表達(dá)對骨肉瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡和耐藥性等的影響及作用機(jī)制，但更具體的機(jī)制還需更深入的研究。上述研究為進(jìn)一步尋找骨肉瘤的治療方法和逆轉(zhuǎn)骨肉瘤耐藥奠定了理論基礎(chǔ)，但是否可以利用阻斷在骨肉瘤中過表達(dá)的LncRNA或者上調(diào)在骨肉瘤中低表達(dá)的LncRNA作為潛在的骨肉瘤治療和逆轉(zhuǎn)骨肉瘤耐藥的策略，亦有待更深入的探索。此外，LncRNA能否作為骨肉瘤患者臨床診斷與判斷預(yù)后的分子標(biāo)志物，也需要經(jīng)過長期的臨床實(shí)踐檢驗(yàn)。在研究中，研究者通常獲取骨肉瘤組織來測定LncRNA水平，但在臨床運(yùn)用中，患者的組織并不容易獲得，因此通過血液、尿液等標(biāo)本來測定LncRNA水平將值得研究與關(guān)注。

LncRNA保守，但其原始序列所包含的信息少，功能難以預(yù)測，序列相差很大的LncRNA可能具有相似的功能，序列相似的LncRNA又可能功能相差很大。另外，同一種LncRNA在骨肉瘤中可能有多種作用機(jī)制，不同機(jī)制間錯綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系都會給研究帶來巨大困難，探索LncRNA與骨肉瘤的關(guān)系是一項(xiàng)長期而艱巨的任務(wù)。隨著生命科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，對LncRNA的認(rèn)識將越來越深刻，LncRNA在骨肉瘤中的作用機(jī)制也將越來越明確，相信在不久的將來，具有細(xì)胞和組織特異性的LncRNA將成為一類全新的有效的骨肉瘤新藥治療靶點(diǎn)及診斷和預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。

表1 LncRNA表達(dá)水平與骨肉瘤患者預(yù)后的關(guān)系Table 1 Associations between LncRNA expression and prognosis of osteosarcoma patients

*：HIF2PUT表達(dá)水平與骨肉瘤患者預(yù)后的關(guān)系存在矛盾

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吳發(fā)帥，男，1991年生，博士研究生，E-mail：18771036347@163.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：szwjj@medmail.com.cn

R738.1

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.06.022

(2017-02-28 收稿)