楊 佳， 王 輝， 張 濤， 史建國(guó)， 周 豪， 沈黎明， 曹英豪， 蔡開琳△

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院胃腸痔瘺外科，武漢 430070 2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院胃腸外科，武漢 430022

雌激素通過調(diào)節(jié)COX-2介導(dǎo)的血管生成減弱DMH的誘癌作用*

楊 佳1， 王 輝1， 張 濤1， 史建國(guó)1， 周 豪1， 沈黎明2， 曹英豪2， 蔡開琳2△

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院胃腸痔瘺外科，武漢 4300702華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院胃腸外科，武漢 430022

目的探究雌激素抑制結(jié)腸腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制。方法二甲肼(DMH，20 mg/kg，每周1次，共16周)注射誘導(dǎo)卵巢切除術(shù)(OVX)處理的SD大鼠，建立結(jié)腸腫瘤動(dòng)物模型，同時(shí)設(shè)DMH聯(lián)合雌激素處理組(雌二醇50 μg/kg，每周1次，共16周)及對(duì)照組。免疫組化法檢測(cè)結(jié)腸腫瘤微血管密度(MVD)及Ki-67陽性細(xì)胞百分比，評(píng)估雌激素對(duì)腫瘤微血管生成及細(xì)胞增殖的影響，Real-time PCR及Western blot檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和環(huán)氧合酶(COX-2)在腫瘤組織中的表達(dá)情況。結(jié)果與DMH組相比，雌激素能夠減少平均負(fù)瘤率(5.75個(gè)/只vs.3.25個(gè)/只，P<0.05)；降低結(jié)腸腫瘤微血管密度[(28.0±1.9)根/視野vs.(14.0±2.8)根/視野，P<0.05]；降低細(xì)胞增殖能力[Ki-67陽性細(xì)胞百分比(51.3±6.5)%vs.(31.1±9.7)%，P<0.05]；下調(diào)COX-2及VEGF表達(dá)水平(均P<0.05)。結(jié)論雌激素能夠降低DMH誘導(dǎo)的SD大鼠結(jié)腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其機(jī)制可能為通過調(diào)節(jié)COX-2及VEGF表達(dá)從而抑制腫瘤微血管生成。

雌激素； 結(jié)腸癌； 環(huán)氧合酶-2； 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子； 血管生成

大量研究顯示性激素對(duì)結(jié)腸癌的發(fā)生有影響作用。流行病學(xué)研究顯示絕經(jīng)后婦女患結(jié)腸癌的概率明顯上升，而使用雌激素替代療法(HRT)后，結(jié)腸腫瘤的發(fā)生率明顯降低[1-3]。

腫瘤內(nèi)部血管的形成對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)至關(guān)重要，其可為腫瘤組織提供新陳代謝所必須的氧氣及各種營(yíng)養(yǎng)成分，也是腫瘤細(xì)胞發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的途徑之一。無血管期的腫瘤大小局限在2 mm以內(nèi)，一旦血管形成，腫瘤就會(huì)迅速生長(zhǎng)，發(fā)生浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等。

成人器官組織，除了女性生殖系統(tǒng)，正常情況下不存在血管生成，反映了雌激素對(duì)血管生成的潛在作用。雌二醇可通過雌激素受體介導(dǎo)子宮的血管生成，而雌激素受體基因敲除或者雌激素受體阻斷劑則能抑制血管生成[4]。雌激素及其受體介導(dǎo)的血管生成在乳腺腫瘤的侵襲中也發(fā)揮了重要作用[5-6]。

本課題組在前期研究中已證實(shí)雌激素能夠通過調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)進(jìn)而影響血管生成來減弱二甲肼(dimethylhydrazine，DMH)的誘癌作用[7]，本研究擬證實(shí)雌激素能否通過調(diào)節(jié)炎癥因子COX-2及VEGF的表達(dá)影響血管生成來減弱DMH的誘癌作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD雌性大鼠，購(gòu)于華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，24只，體重(200±20)g。清潔級(jí)飼養(yǎng)，12 h晝夜交替，動(dòng)物房溫度(22±2)℃，相對(duì)濕度(50±10)%，自由飲食水。

1.2 卵巢切除及分組

水合氯醛麻醉，取腰背部中線縱向切口約1 cm，找到卵巢并絲線結(jié)扎末端輸卵管，切除卵巢，連續(xù)陰道涂片4 d，確定無性周期存在。將SD大鼠隨機(jī)分為3組：DMH組、DMH聯(lián)合雌激素E2組、對(duì)照組，每組8只。藥物購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，給藥劑量DMH為20 mg/kg，E2為50 μg/kg，每周1次，皮下注射，2種藥物間隔1 d給藥[8]。16周后停止給藥，繼續(xù)喂養(yǎng)6周以達(dá)到最優(yōu)誘癌效果。所有大鼠禁食水1 d后過量水合氯醛處死，取出整段結(jié)腸沿縱軸切開，在冰生理鹽水中漂洗掉糞便，分別計(jì)數(shù)腫瘤數(shù)量，計(jì)算平均負(fù)瘤率(每只大鼠平均腫瘤數(shù)量)及腫瘤發(fā)生率(即出現(xiàn)腫瘤的大鼠數(shù)占該組大鼠總數(shù)的比例)，用游標(biāo)卡尺測(cè)量誘發(fā)的每顆腫瘤長(zhǎng)徑、寬徑及厚徑并計(jì)算其體積。

1.3 免疫組化檢測(cè)

取結(jié)腸腫瘤組織進(jìn)行切片，免疫組化檢測(cè)CD34以評(píng)估微血管密度(MVD)，檢測(cè)Ki-67評(píng)估細(xì)胞增殖。CD34、Ki-67抗體購(gòu)自BOSTER公司。石蠟切片置于65℃烘箱中烘片2 h，脫蠟至水，切片微波修復(fù)，3%過氧化氫溶液孵育以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，BSA封閉，加入一抗覆蓋組織，4℃過夜，再加入相應(yīng)種屬的二抗，4℃孵育。加入DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色。

運(yùn)用Weidner等[9]的方法對(duì)結(jié)腸腫瘤MVD進(jìn)行評(píng)估。首先于顯微鏡低倍鏡下選擇4個(gè)血管密度較為密集的區(qū)域作為檢測(cè)區(qū)域(hot spots)，然后在高倍鏡視野(×400)對(duì)微血管進(jìn)行計(jì)數(shù)，只要是被染成棕色的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞叢，與周圍組織境界清楚，均可視為1根微血管，紅細(xì)胞或管腔結(jié)構(gòu)不作為納入的必須條件。

1.4 Real-time PCR檢測(cè)

腫瘤組織加入Trizol(Invitrogen公司)，勻漿離心，氯仿充分乳化，加入等體積異丙醇，充分混勻后，加入75%乙醇并離心，加入適量RNA Free水溶解沉淀，完全溶解后-80℃保存。采用TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增試劑盒，操作按說明書進(jìn)行。引物序列為：VEGF上游5′-CAGCTATTGCCGTCCA-ATGA-3′，下游5′-CCAGGGCTTCATCATTGCA-3′；COX-2上游5′-CATTCTTTGCCCAGCACTT-3′，下游5′-TCTCCACCGATGACCTGAT-3′；β-actin(內(nèi)參)上游5′-CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3′，下游5′-TAGGAGCCAGG-GCAGTAAT-CT-3′。采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA表達(dá)，以其與內(nèi)參基因的比值反映目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 Western blot檢測(cè)

組織裂解提取總蛋白，超聲處理，蛋白濃度測(cè)定，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別加入相應(yīng)的一抗孵育過夜，加入相應(yīng)的稀釋二抗孵育1 h，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，掃描膠片，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的吸光度值，以目的基因與內(nèi)參的積分吸光度比值作為蛋白表達(dá)水平。COX-2及VEGF抗體購(gòu)自Abcam公司。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 雌激素對(duì)DMH誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生的影響

DMH組、DMH+E2組結(jié)腸腫瘤發(fā)生率分別為87.5%(7/8)、62.5%(5/8)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但平均負(fù)瘤率分別為5.75個(gè)/只及3.25個(gè)/只，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)，DMH組腫瘤平均體積為(87.42±56.23)mm3明顯大于DMH+E2組的(38.63±25.57)mm3，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

2.2 雌激素對(duì)DMH誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響

Ki-67在細(xì)胞核中表達(dá)，以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性標(biāo)志，以Ki-67染色陽性細(xì)胞百分比評(píng)估各組結(jié)腸腫瘤細(xì)胞增殖情況。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示：DMH組Ki-67陽性細(xì)胞百分比平均為(51.3±6.5)%，DMH+E2組Ki-67陽性細(xì)胞百分比降低到(31.1±9.7)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明經(jīng)雌激素處理后細(xì)胞增殖顯著降低。對(duì)照組細(xì)胞增殖處于極低水平。見圖2。

A：DMH組；B：DMH+E2組；C：對(duì)照組圖1 各組大鼠DMH誘導(dǎo)的結(jié)腸腫瘤標(biāo)本Fig.1 The specimens of DMH-induced colon tumors in each group

2.3 雌激素對(duì)微血管密度的影響

DMH組MVD平均為(28.0±1.9)根/視野，而DMH+E2組減少到(14.0±2.8)根/視野(P<0.05)，對(duì)照組微血管密度遠(yuǎn)低于2個(gè)實(shí)驗(yàn)組(圖3)。

2.4 雌激素對(duì)VEGF以及COX表達(dá)的影響

DMH組VEGF及COX-2表達(dá)水平明顯上調(diào)，其mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別約為DMH+E2組的2及3倍，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。VEGF及COX-2蛋白表達(dá)水平亦呈相同趨勢(shì)，見圖4。

A：DMH組；B：DMH+E2組；C：對(duì)照組；D：各組Ki-67陽性細(xì)胞百分比；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與DMH組比較，#P<0.05圖2 各組DMH誘導(dǎo)的結(jié)腸腫瘤組織中Ki-67陽性細(xì)胞百分比(×200)Fig.2 Ki-67 positive cell percentage in DMH-induced tumors in each group (×200)

A：DMH組；B：DMH+E2組；C：對(duì)照組；D：各組微血管密度值；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與DMH組比較，#P<0.05圖3 各組DMH誘導(dǎo)的結(jié)腸腫瘤組織中的微血管密度(×400)Fig.3 MVD of DMH-induced tumors in each group(×400)

A：VEGF mRNA表達(dá)；B：COX-2 mRNA表達(dá)；C、D：VEGF及COX-2蛋白表達(dá)水平；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與DMH組比較，#P<0.05圖4 各組VEGF及COX-2蛋白的表達(dá)水平Fig.4 The expression of COX-2 and VEGF at both mRNA and protein levelsin each group

3 討論

炎癥是身體對(duì)外界或內(nèi)部刺激的應(yīng)激反應(yīng)，若炎癥短時(shí)間存在，其過程可以產(chǎn)生治療效果，若炎癥持續(xù)存在時(shí)，則可能會(huì)導(dǎo)致疾病，如心血管疾病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性疾病以及腫瘤等[10-11]。慢性炎癥可對(duì)DNA以及蛋白進(jìn)行修改，使細(xì)胞組織重塑，改變氧化應(yīng)激的某些過程及最終結(jié)果，而這些都會(huì)增加罹患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)[12]。

環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)是花生四烯酸轉(zhuǎn)變?yōu)榍傲邢偎卮x過程中的一個(gè)重要的限速酶，包含COX-1和COX-2兩個(gè)異構(gòu)體。COX-1為管家基因，表達(dá)于多數(shù)哺乳動(dòng)物的組織中，COX-2在正常組織中不表達(dá)或微表達(dá)，當(dāng)出現(xiàn)炎癥或腫瘤等情況下，表達(dá)量可迅速增加[13-14]。大量研究證實(shí)COX-2能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，涉及到的相關(guān)機(jī)制有：促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)；抑制細(xì)胞凋亡；刺激腫瘤血管生成；促進(jìn)腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移；抑制局部免疫功能[14-19]。

COX-2是一種氫過氧化物酶，許多促癌物質(zhì)如煙草、環(huán)境及食物因素都可以誘導(dǎo)COX-2合成并使這些底物轉(zhuǎn)變成致癌物損傷DNA及其他大分子物質(zhì)[20]。DMH誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸腫瘤動(dòng)物模型是一種廣泛使用的有效模型，用來模擬環(huán)境、飲食以及化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的人體結(jié)腸癌，該模型也很好地模擬了炎癥刺激導(dǎo)致COX-2表達(dá)上升這一生物過程[21-22]。COX-2在許多腫瘤組織中均過表達(dá)，與預(yù)后不良密切相關(guān)[10]。在結(jié)腸腫瘤組織中，VEGF及COX-2的表達(dá)存在正相關(guān)[23-25]，VEGF是COX-2的重要調(diào)控靶蛋白之一，COX-2表達(dá)水平變化使前列腺素水平(PGE2、PGF2a、PGD2、PGI2，主要為PGE2[26])發(fā)生變化，從而對(duì)VEGF表達(dá)水平產(chǎn)生影響，而VEGF能夠正反饋調(diào)節(jié)COX-2的表達(dá)，使腫瘤血管生成這一過程得以強(qiáng)化[27]。COX-2催化花生四烯酸轉(zhuǎn)變?yōu)榍傲邢偎睾?，后者通過一系列G蛋白耦合跨膜受體(G-protein-coupled receptors，GPCRs)發(fā)揮生物作用，包括EP1、EP2、EP3以及EP4等4種亞型受體，EP1及EP3參與抑制細(xì)胞內(nèi)cAMP合成及增強(qiáng)磷酸肌醇水解作用，EP2及EP4均促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)cAMP合成，EP4主要參與PGE2的短期快速生物過程，故前列腺素促進(jìn)血管生成主要通過EP2受體實(shí)現(xiàn)[28-29]，當(dāng)EP2受體敲除后，結(jié)腸腫瘤動(dòng)物模型中的腫瘤體積明顯縮小[30]，腫瘤血管生成過程明顯減弱[31]，其中涉及到的信號(hào)通路有EP2-cAMP-PKA-GSK-3[32]。

本研究中，DMH能夠誘導(dǎo)結(jié)腸腫瘤形成，而雌激素處理后，結(jié)腸腫瘤雖然在腫瘤發(fā)生率上無明顯差異，但平均負(fù)瘤率及腫瘤體積均顯著減小。Ki-67檢測(cè)顯示雌激素能夠顯著降低腫瘤細(xì)胞的增殖能力，進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，雌激素處理組微血管密度明顯低于DMH組，說明雌激素能夠通過影響腫瘤血管生成減弱腫瘤的形成及增殖能力。在探索雌激素發(fā)揮這一生物學(xué)作用所涉及到的靶點(diǎn)時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)雌激素能夠在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平對(duì)COX-2表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，并進(jìn)而影響重要的血管生成因子VEGF的表達(dá)，從而對(duì)血管生成進(jìn)行調(diào)控，最終對(duì)腫瘤產(chǎn)生影響。

雌激素主要通過其受體ERα及ERβ發(fā)揮作用。我們之前的研究證實(shí)，結(jié)腸組織中主要表達(dá)的雌激素受體為ERβ[33]，相關(guān)文獻(xiàn)也證實(shí)雌激素能夠通過結(jié)合組織特異性受體ERβ而減輕慢性炎癥反應(yīng)[34]，因此推測(cè)雌激素可能通過與其受體ERβ結(jié)合而實(shí)現(xiàn)上述生物學(xué)過程。

綜上，雌激素可能通過ERβ對(duì)COX-2表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而影響前列腺素PGE2的水平，后者通過其受體EP2影響VEGF的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)腫瘤血管生成進(jìn)行調(diào)控，最終對(duì)DMH誘導(dǎo)的結(jié)腸腫瘤形成及發(fā)展產(chǎn)生影響。

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EstrogenInhibitsDMH-inducedTumorFormationbyRegulatingCOX-2MediatedAngiogenesis

Yang Jia，Wang Hui，Zhang Taoetal

DepartmentofGastrointestinalSurgery，TheCentralHospitalofWuhan，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430070，China

ObjectiveTo explore the underlying mechanism by which estrogen protects against colon cancer.MethodsDMH(20 mg/kg，once a week，for 16 weeks)induced colon carcinogenesis model on ovariectomized SD rats.Estradial combined with DMH group was treated with estradiol 50 μg/kg，once a week，for 16 weeks.Immunohistochemistry was used to detect micro-vessel formation and Ki-67 positive cell percentage，and then VEGF and COX-2 expression was examined by RT-PCR assay and Western blotting.ResultsEstrogen reduced the tumor number and cell proliferation of DMH induced colon tumors[from 5.75 to 3.25，Ki-67 positive cell percentage from(51.3±6.5)% to (31.1±9.7)%，bothP<0.05].The blood vessel densities in polyps decreased in estrogen group，from (28.0±1.9) to (14.0±2.8)，and COX-2 and VEGF expression in mRNA and protein levels also decreased(bothP<0.05).ConclusionEstrogen replacement was a protective factor for ovariectomized rat to DMH induced carcinogenesis and the possible mechanism was inhibition on blood vessel formation by down-regulating VEGF and COX-2 expression.

estrogen； colon cancer； COX-2； VEGF； angiogenesis

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81272655)

楊 佳，男，1986年生，醫(yī)學(xué)碩士，住院醫(yī)師，E-mail：yangjia3319@163.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：caikailin@gmail.com

R735.35

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.06.006

(2017-08-10 收稿)