盧 敏， 何 青， 祝曉瑩

河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室 3病原學(xué)教研室，洛陽 471023 2武漢六七二中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院針灸康復(fù)科，武漢 430071

TRPC3在海人酸誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作大鼠大腦皮質(zhì)中表達上調(diào)

盧 敏1， 何 青2， 祝曉瑩3

河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院1人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室3病原學(xué)教研室，洛陽 4710232武漢六七二中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院針灸康復(fù)科，武漢 430071

目的研究瞬時受體電位通道蛋白3(transient receptor potential canonical 3，TRPC3)在海人酸(kainic acid，KA)致癇大鼠大腦皮質(zhì)中的表達變化，探討其與癲癇發(fā)病的關(guān)系及意義。方法選取54只成年雄性SD大鼠隨機分為對照組(NS組)18只和實驗組(KA組)36只，實驗組給予側(cè)腦室注射KA 2 μg/kg(7 μL左右)制作KA致癇模型，對照組給予側(cè)腦室注射等量生理鹽水，觀察記錄大鼠癲癇發(fā)作的行為學(xué)表現(xiàn)。于癲癇發(fā)作后不同時間點(48 h、72 h)各取18只大鼠注射側(cè)皮層腦組織，對照組于注射結(jié)束后48 h取18只大鼠同側(cè)皮層腦組織，用半定量RT-PCR、Western blot和免疫組織化學(xué)技術(shù)(均各6只)檢測TRPC3的mRNA和蛋白的含量。結(jié)果對照組大鼠無癲癇發(fā)作，實驗組大鼠于注射后5 min左右出現(xiàn)典型癇性發(fā)作，達Ⅳ～Ⅴ級，持續(xù)數(shù)小時；實驗組TRPC3的mRNA和蛋白表達水平在注射后48 h和72 h均較對照組顯著增高(P<0.05)，但實驗組兩個時間點之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論TRPC3在致癇大鼠大腦皮質(zhì)中的表達增加，其可能參與了癲癇的形成和發(fā)展。

癲癇； TRPC3； 海人酸； 大腦皮質(zhì)

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)的一種常見病，其發(fā)病機制十分復(fù)雜，還不完全清楚，目前缺乏有效的治療手段。一般認為，癲癇發(fā)作與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)元的過度放電有關(guān)。已有的研究表明，癲癇患者腦內(nèi)神經(jīng)元Ca2+快速內(nèi)流與細胞去極化有關(guān)，去極化到達一定程度時觸發(fā)Na+內(nèi)流，進而引發(fā)一系列迅速的去極化過程[1]，導(dǎo)致興奮性神經(jīng)遞質(zhì)過度釋放而處于優(yōu)勢，興奮性和抑制性兩大系統(tǒng)失去平衡。瞬時受體電位通道(transient receptor potential canonical，TRPC)是廣泛存在于人體各組織細胞中的一大類蛋白分子，在人體中表達其中6種，即TRPC1、TRPC3、TRPC4、TRPC5、TRPC6、TRPC7，它們形成同源或異源聚合體，作為一種非選擇性陽離子通道，介導(dǎo)Ca2+及其它陽離子穿過細胞膜，在細胞的去極化過程中發(fā)揮作用。其中TRPC3的結(jié)構(gòu)是目前研究得最清楚的，有研究顯示TRPC3在結(jié)節(jié)硬化癥癲癇患者皮層灶區(qū)表達升高顯著[2]；TRPC3在顳葉癲癇苔蘚纖維突觸的再生過程中表達上調(diào)[3]；TRPC3的激活導(dǎo)致癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠大腦皮層血管性水腫[4]。但這方面的基礎(chǔ)研究還不多。海人酸(kainic acid，KA)是興奮性氨基酸L-谷氨酸的類似物，作為一種經(jīng)典致癇劑，常被用于實驗動物癲癇模型的制備。因此本實驗通過建立KA大鼠癲癇模型，研究TRPC3分子在癲癇大鼠大腦皮質(zhì)中的表達變化，探討TRPC3與癲癇的相互關(guān)系，進一步探索癲癇發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

選取清潔級健康雄性SD大鼠54只，體重范圍在180～220 g(由華中科技大學(xué)實驗動物中心提供)。隨機分成對照組18只和實驗組36只。主要實驗試劑：KA(美國Cayman公司)，兔抗TRPC3多克隆抗體(美國Abcam公司)，兔抗β-肌動蛋白(β-actin)多克隆抗體IgG(Sigma公司)，Trizol總RNA抽提試劑(Invitrogen公司)，RT-PCR試劑盒(Fermentas公司)，羊抗兔IgG二抗(北京中杉公司)。

1.2 KA大鼠癲癇模型的制備及行為學(xué)記錄

大鼠經(jīng)3.5%水合氯醛溶液(10 mL/kg)腹腔麻醉后固定于立體定位儀(江灣Ⅱ型)上，于前囟后0.8 mm，中線右1.5 mm處鉆開顱骨，注射點在此處硬膜下3.8 mm，采用微量注射器緩慢注射藥物。實驗組大鼠于側(cè)腦室注射KA 2 μg/kg(約7 μL)，對照組大鼠側(cè)腦室注射等量生理鹽水。注射完成后，保留注射針于側(cè)腦室內(nèi)5 min，然后緩慢拔針。記錄各組大鼠行為學(xué)表現(xiàn)，參考Racine法[5]分6級(0級：無癲癇發(fā)作的行為改變；Ⅰ級：動物有胡須抖動，咀嚼動作；Ⅱ級：有頭面部間歇性抽搐；Ⅲ級：動物的單個肢體節(jié)律性抽搐或陣攣；Ⅳ級：四肢均有節(jié)律性、持續(xù)性抽搐；Ⅴ級：全身性、強直性抽搐，并同時有豎尾或翻滾動作)。

1.3 半定量RT-PCR檢測各組大鼠大腦皮質(zhì)TRPC3 mRNA含量

TRPC3上游引物為5′-GCGGAATTCAGATGGAGGGAAGCCCATCC-3′，下游引物為5′-GCGGTCGACAGTTCACATCTCAGCATGCTG-3′，β-actin上游引物為5′-ACGGTCAGGTCATCACTA-TCG-3′，下游引物為5′-GGCATAGAGGTCTTT-ACGGATG-3′。實驗組于癲癇發(fā)作后48、72 h各取6只大鼠的注射側(cè)皮層腦組織，對照組于注射后48 h取6只大鼠的同側(cè)皮層腦組織，Trizol法提取組織總RNA，70℃ 5 min變性后進行逆轉(zhuǎn)錄，條件是37℃15 min，85℃5 s，-20℃保存。獲取的cDNA進行PCR擴增，TRPC3反應(yīng)條件設(shè)置是95℃ 20 s，53℃ 30 s，72℃ 20 s，30個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參，反應(yīng)條件設(shè)置是95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)。產(chǎn)物均在72℃延伸10 min，加EB染色后于0.2%瓊脂糖凝膠中電泳，條帶經(jīng)凝膠掃描儀處理計算吸光度值，以TRPC3與內(nèi)參β-actin的比值作為其相對表達量。

1.4 Western blot檢測各組大鼠大腦皮質(zhì)TRPC3蛋白表達情況

實驗組大鼠于癲癇發(fā)作后48、72 h各取6只，對照組于注射后48 h取6只斷頭取注射側(cè)大腦皮質(zhì)，提取總蛋白，BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度并標(biāo)準(zhǔn)化，以β-actin蛋白作為內(nèi)參。樣品徹底變性后經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后TBST溶液洗膜3次，然后用5%脫脂牛奶4℃封閉過夜。分別加入兔抗TRPC3多克隆抗體(1∶2 000)，兔抗β-actin多克隆抗體(1∶500)孵育纖維膜(4℃過夜)。TBST溶液洗膜3次，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫孵育膜1 h，TBST溶液洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，曝光洗片后掃描，采用Image J軟件測定灰度值，以TRPC3與內(nèi)參β-actin的比值作為其相對表達量。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠大腦皮質(zhì)TRPC3蛋白表達

實驗組大鼠于相應(yīng)時間點(癲癇發(fā)作后48、72 h)從左心室灌流，分別取6只大鼠注射側(cè)大腦皮質(zhì)部位的腦組織塊，6只對照組大鼠于注射48 h后灌注取材，于4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液中后固定過夜，20%蔗糖浸泡至組織塊下沉，使用冰凍切片機切片(片厚20 μm)，貼片，風(fēng)干，0.01 mmol/L PBS洗片，Triton X-100(0.2%)處理30 min，0.01 mmol/L PBS洗片，3%小牛血清37℃孵育30 min。此后各片滴加兔抗TRPC3多克隆抗體(1∶2 000)孵育48 h，再滴加羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)室溫孵育膜1 h，DAB顯色。脫水，透明，封片，顯微鏡觀察并攝片。采用Image-Pro plus 6.0軟件對圖片進行吸光度測定，取平均值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，兩組間及實驗組兩時間點間均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)觀察結(jié)果

對照組大鼠無癲癇發(fā)作，KA致癇實驗組大鼠于注射后5 min左右出現(xiàn)癇性發(fā)作，達Ⅳ～Ⅴ級，表現(xiàn)為四肢節(jié)律性、持續(xù)性抽搐，或全身性、強直性抽搐，并同時有豎尾或翻滾動作，持續(xù)數(shù)小時。

2.2 TRPC3 mRNA水平在癲癇大鼠大腦皮質(zhì)中升高

為了顯示癲癇大鼠大腦皮質(zhì)中的TRPC3 mRNA水平，我們使用RT-PCR法進行檢測。結(jié)果顯示：在堿基數(shù)2 500 bp左右的條帶處(TRPC3堿基數(shù)為2 547)，實驗組大鼠大腦皮質(zhì)在造模后48、72 h TRPC3 mRNA水平明顯高于對照組(P<0.05)，而實驗組48 h和72 h兩時間點之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1。

與對照組比較，#P<0.05圖1 RT-PCR法檢測癲癇大鼠大腦皮質(zhì)TRPC3 mRNA表達水平Fig.1 TRPC3 mRNA expression in cerebral cortex of epilepsy rat detected by RT-PCR

2.3 TRPC3蛋白質(zhì)表達水平在癲癇大鼠大腦皮質(zhì)中上調(diào)

為了顯示TRPC3蛋白在癲癇大鼠大腦皮質(zhì)中

的表達水平，我們使用Western blot法進行檢測。結(jié)果顯示：在分子量接近100 kD處的條帶(TRPC3分子量為97 kD)，實驗組大鼠在造模后48、72 h的TRPC3蛋白水平與對照組比較顯著增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，實驗組48 h和72 h之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖2。

與對照組比較，#P<0.05圖2 Western blot法檢測癲癇大鼠大腦皮質(zhì)TRPC3蛋白水平Fig.2 TRPC3 protein level in cerebral cortex of epilepsy rat detected by Western blotting

2.4 TRPC3在癲癇大鼠大腦皮質(zhì)組織中表達增多

為了直觀顯示TRPC3在癲癇大鼠大腦皮質(zhì)中的表達，我們采用免疫組織化學(xué)法進行檢測。結(jié)果顯示：對照組大鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)有TRPC3陽性表達，但染色較弱(0.372 9±0.015 7)，實驗組大鼠在癲癇發(fā)作后48、72 h時間點大腦皮質(zhì)內(nèi)TRPC3免疫染色明顯增加，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而實驗組48 h和72 h之間免疫染色強度[(0.756 2±0.012 9)vs.(0.864 5±0.035 8)]差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖3。

A：對照組；B：實驗組癲癇發(fā)作后48 h；C：實驗組癲癇發(fā)作后72 h圖3 免疫組化法檢測癲癇大鼠大腦皮質(zhì)TRPC3的表達(DAB顯色，×40)Fig.3 TRPC3 expression in cerebral cortex of epilepsy rat detected by immunohistochemistry (DAB staining，×40)

3 討論

癲癇是一種神經(jīng)系統(tǒng)常見病，發(fā)病機制尚不清楚。有學(xué)者認為，癲癇的發(fā)病與神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)失衡密切相關(guān)，以神經(jīng)機制為主，免疫和內(nèi)分泌分別在受體、信使和基因水平對其進行調(diào)節(jié)[6]。目前較一致的觀點是，癲癇發(fā)病是因為中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性與抑制性失去平衡所致，這種失衡主要與離子通道的異常改變有關(guān)。目前認為，人類特發(fā)性癲癇是一種“離子通道病”，即因有缺陷的基因編碼有缺陷的離子通道蛋白而發(fā)病，如鈣離子通道與癲癇相關(guān)性的研究較為明確[7]。Badea等[1]用Ca2+成像的方法觀察了神經(jīng)元參與癲癇發(fā)作的情況，證實Ca2+快速內(nèi)流和細胞去極化有關(guān)。當(dāng)去極化達到一定程度時就觸發(fā)Na+內(nèi)流，從而引發(fā)一系列迅速的去極化過程，進而促使細胞病理過程的發(fā)生。

TRPC在1996年被發(fā)現(xiàn)[8]，包括7個亞型(TRPC1-7)，其中TRPC2在人細胞中不表達。大量研究表明，TRPC主要參與形成受體門控或第二信使激活的Ca2+可透過的非選擇性陽離子通道[9-10]。TRPC通道廣泛存在于各組織各類細胞中，在細胞生理病理過程中發(fā)揮作用，在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用表現(xiàn)在多方面。TRPC通道與神經(jīng)元的生長、增殖與分化相關(guān)[11-12]。在調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌、長時程增強，以及突觸可塑性的過程中也發(fā)揮作用[13]。在一些神經(jīng)性疾病，如帕金森病(Parkinson’s disease，PD)，阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)等的發(fā)病過程中，TRPC的作用不容忽略[14-15]。TRPC通道與癲癇的相關(guān)性研究目前尚不多見。已有文獻報道，TRPC4基因與癲癇大發(fā)作有明顯相關(guān)性[16]；TRPC1/TRPC4異構(gòu)體形成的通道在癲癇發(fā)作及其導(dǎo)致的神經(jīng)退行性變的過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[17]；TRPC5通道在胞膜上的插入促使海馬CA1區(qū)錐體細胞的膽堿能平臺電位的形成[18]；TRPC7在癲癇發(fā)作過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[19]。而結(jié)構(gòu)最為清楚的TRPC3與神經(jīng)系統(tǒng)亦關(guān)系密切。在大鼠和人，TRPC3在中樞神經(jīng)系統(tǒng)各部位中均有廣泛表達。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neuotrophic factor，BDNF)對于神經(jīng)的作用大多是通過TRPC3來介導(dǎo)的。TRPC3參與了浦肯野細胞功能和GABA能神經(jīng)元的活化以及運動調(diào)節(jié)。此外，TRPC3在生長錐的引導(dǎo)調(diào)控方面發(fā)揮作用[20]。TRPC3與癲癇的關(guān)系報道不多見，僅見在結(jié)節(jié)硬化癥癲癇[2]和難治性顳葉癲癇患者[21]腦組織標(biāo)本中顯示表達上調(diào)，近來一些新的研究表明，TRPC3在顳葉癲癇苔蘚纖維突觸的再生過程中表達上調(diào)[3]；TRPC3的激活導(dǎo)致癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠大腦皮層血管性水腫[4]。

本研究選取TRPC3作為研究對象，在KA癲癇大鼠模型的基礎(chǔ)上，采用多種實驗技術(shù)，檢測癲癇大鼠大腦皮質(zhì)中TRPC3的表達變化，以期明確TRPC3與癲癇的關(guān)系。我們采用半定量RT-PCR方法檢測TRPC3在mRNA水平上的差異，采用Western blot法測定各組TRPC3蛋白質(zhì)表達水平的差異，同時采用免疫組織化學(xué)技術(shù)直觀顯示組織中TRPC3表達量的差異。結(jié)果顯示，無論是mRNA水平，還是蛋白質(zhì)水平，TRPC3在癲癇大鼠大腦皮質(zhì)中的含量均明顯高于正常對照組。而在癲癇發(fā)作后48 h和72 h這兩個時間點之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示TRPC3可能參與癲癇的發(fā)生及發(fā)展，且在癲癇發(fā)作48 h后，其含量不再升高。TRPC3單分子有6個跨膜區(qū)(TM1-6)，在TM5與TM6之間有形成孔道的袢，4個單分子TRPC3 TM5與TM6間的袢彼此靠近形成離子通道，經(jīng)由ROCE和SOCE兩種機制，通過與磷脂酶C(phospholipase C，PLC)相偶聯(lián)的方式被激活[22]，介導(dǎo)Ca2+快速內(nèi)流，引起去極化到一定程度，觸發(fā)Na+內(nèi)流，進而引發(fā)一系列迅速的去極化過程，導(dǎo)致興奮性神經(jīng)遞質(zhì)過度釋放而處于優(yōu)勢，興奮性和抑制性兩大系統(tǒng)失去平衡，誘發(fā)癲癇。這其中，TRPC3通過何種途徑誘發(fā)癲癇，以及癲癇產(chǎn)生后如何引起腦組織的進一步損傷，這些方面的分子機制還需要進一步的研究。

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Up-regulationofTRPC3intheCortexofRatswithKainicAcid-inducedSeizures

Lu Min1，He Qing2，Zhu Xiaoying3

1DepartmentofHumanAnatomyandHistologyandEmbryology，3DepartmentofNosetiology，MedicalCollege，HenanUniversityofScienceandTechnology，Luoyang471023，China2DepartmentofAcupuncture，Wuhan672TraditionalChineseandWesternMedicineHospital，Wuhan430071，China

ObjectiveTo observe the expression change of TRPC3 in cortex of rats with Kainic acid(KA)-induced seizures，and to explore the role of TRPC3 in epileptogenesis.MethodsFifty-four adult Sprague Dawley(SD)rats were randomly divided into two groups(18 for control group，36 for epilepsy group).The behavior of rats was observed and recorded.The epilepsy group was treated with KA(2 μg/kg，about 7 μL，lateral intracerebroventricular injection)，and control group was treated with isotonic Nachloride(equivalent volume with KA，lateral intracerebroventricular injection).For epilepsy group，samples were taken 48 and 72 h after seizure burst.For control group，samples were taken 48 h after isotonic Nachloride injection.The mRNA level of TRPC3 in cortex was detected and recorded by RT-PCR，and the protein level of TRPC3 in cortex was measured by Western blotting，and immunohistochemistry was also used to display the TRPC3 expression in cortex.ResultsThe control group showed no seizure activity，and the epilepsy group showed classical seizure activity(Ⅳ-Ⅴ level)about 5 min after injection and last for several hours.The mRNA and protein levels of TRPC3 in epilepsy group were both higher than those in control group with obvious distinction(P<0.05).ConclusionThe TRPC3 level increases in cortex of rats with KA-induced seizures.These results point out that TRPC3 is possibly involved in epilepsy etiopathogenesis and development.

epilepsy； TRPC3； kainic acid； cortex

盧 敏，女，1979年生，醫(yī)學(xué)博士，講師，E-mail：364588020@qq.com

R742.1

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.06.008

(2017-04-24 收稿)