王仁香 歐霞娩 康馬飛

[摘要] 目的 觀察正常胃組織、胃癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的低氧誘導因子-1α（HIF-1α）、N-myc下游調(diào)節(jié)基因2（NDRG2） 和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關蛋白的表達差異。 方法 采用免疫組化法檢測正常胃組織、胃癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的HIF-1α、NDRG2、E-Cadherin、Snail和 Twist的表達。 結(jié)果 正常胃組織內(nèi)HIF-1α無表達，而NDRG2高表達，NDRG2與E-Cadherin表達無差異，而與Snail和Twist的表達有顯著差異。胃癌組織中HIF-1α與NDRG2表達無顯著差異，HIF-1α和NDRG2表達均與E-Cadherin表達無顯著差異，但均與Snail 和Twist表達有顯著差異。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中HIF-1α高表達，而NDRG2無表達，HIF-1α表達與E-Cadherin、Snail和Twist的表達均無顯著差異。NDRG2與E-Cadherin、Snail和Twist的表達密切相關，而HIF-1α與E-Cadherin、Snail和Twist的表達無關。 結(jié)論 在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中HIF-1α高表達，而NDRG2無表達。NDRG2與E-Cadherin、Snail和Twist的關系最密切，而HIF-1α與E-Cadherin、Snail和Twist的表達無關，故HIF-1α影響EMT可能是通過抑制NDRG2表達而實現(xiàn)的。

[關鍵詞] 胃腫瘤/胃癌；低氧誘導因子-1α；N-myc下游調(diào)節(jié)基因2；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)移

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）28-0034-04

[Abstract] Objective To observe the difference in expression of hypoxia-inducible factor-1α（HIF-1α）， N-myc downstream regulatory gene 2（NDRG2） and epithelial-mesenchymal transition（EMT）-related proteins in normal gastric tissue， gastric cancer tissue and lymph node metastasis. Methods Immunohistochemistry was used to detect the expression of HIF-1α， NDRG2， E-Cadherin， Snail and Twist in normal gastric， gastric and lymph node metastatic tissues. Results There was no expression of HIF-1α in normal gastric tissue， while NDRG2 was highly expressed. There was no difference in the expression of NDRG2 and E-Cadherin， but there was significant difference between the expression of Snail and Twist. There was no significant difference in the expression of HIF-1α and NDRG2 between gastric cancer tissues. The expressions of HIF-1α and NDRG2 were not significantly different from those of E-Cadherin， but were significantly different from those of Snail and Twist. HIF-1α was highly expressed in lymph node metastasis， while NDRG2 was not expressed. There was no significant difference between HIF-1α expression and E-Cadherin， Snail and Twist expression. NDRG2 was closely related to the expression of E-Cadherin， Snail and Twist， while HIF-1α was not associated with the expression of E-Cadherin， Snail and Twist. Conclusion HIF-1α is highly expressed in lymph node metastasis of gastric cancer， but NDRG2 has no expression. NDRG2 is most closely related to E-Cadherin， Snail and Twist， while HIF-1α is not related to the expression of E-Cadherin， Snail and Twist. Therefore， HIF-1α may affect EMT by inhibiting NDRG2 expression.

[Key words] Gastric neoplasms/Gastric cancer；Hypoxia-inducible factor-1α；N-myc downstream regulatory gene 2；Epithelial-mesenchymal transition；Metastasis

胃癌發(fā)病率在全球排第4位，70%發(fā)生在發(fā)展中國家，在亞洲，胃癌發(fā)病率排在第3位[1]。在中國，胃癌死亡率排在肺癌和肝癌后，居第3位[2]，即使是R0切除術后，1年、2年和3年的總生存率也分別只有89%、74%和63%[3]，腫瘤轉(zhuǎn)移是胃癌根治性切除后死亡的主要原因。因此，闡明其轉(zhuǎn)移機制非常有意義。有研究認為，缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α）可能在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中起重要作用[4-6]。N-myc下游調(diào)節(jié)基因2（N-myc downstream regulated gene 2，NDRG2）可能為一個抑癌基因，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的抑制作用，胃癌組織中NDRG2表達缺失或下調(diào)可能參與腫瘤的發(fā)展[7-9]。目前，胃癌及胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中HIF-1α與NDRG2 表達是否有相關性尚未見報道。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）參與了腫瘤惡性表型轉(zhuǎn)化的啟動過程，是腫瘤開始轉(zhuǎn)移的關鍵步驟[10]。那么，胃癌轉(zhuǎn)移與HIF-1α和NDRG2的關系如何？本研究觀察了正常胃組織、胃癌組織和胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中HIF-1α、NDRG2和EMT相關蛋白如E-Cadherin、Snail 及Twist等的表達情況，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集本院2014年10月～2016年6月收治的經(jīng)組織學確診的胃癌患者20例，年齡35～70歲，中位年齡56歲。

1.2 實驗方法

采用免疫組化法，觀察胃癌組織、癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織和正常胃組織中HIF-1α、NDRG2、E-Cadherin、Snail 和Twist的表達情況 。

1.2.1 免疫組化 對常規(guī)石蠟包埋的組織切片進行脫蠟處理，然后進行修復，加一抗和二抗，DAB顯色，蘇木素復染和封片等步驟。然后按各指標的評價標準進行評價。

1.2.2 HIF-1α檢測結(jié)果評價標準[11] HIF-1α 蛋白主要表達于胃癌細胞胞質(zhì)和（或）胞核內(nèi)，以半定量積分法來判斷陽性結(jié)果：（1）按著色強度評分：未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；（2）每張切片隨機選取10個高倍視野，每視野計數(shù) 100個胃腺上皮細胞，計算陽性細胞占同類細胞的百分數(shù)：無陽性細胞為 0 分，陽性細胞數(shù)<25%為1分，25%～50%為2 分，>50%為3分。將兩項得分結(jié)果相乘：<2分為陰性，>2分為陽性。

1.2.3 NDRG2結(jié)果評價標準[12] 每張切片隨機選擇 10 個高倍視野進行判定，抗原染色最終評分綜合了染色強度和染色細胞比例兩項指標。將細胞染色強度分為不著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色并依次記為0分、1分、2分、3分；將染色細胞占計數(shù)細胞比例分為0分<5%、5%≤1分<25%、25%≤2分<50%、50%≤3分< 75%、4分≥75%。細胞陽性強度評分：染色強度評分×染色細胞比例評分，（-）為 0 分，（+）為 1～4分，（++）為5～8分，（+++）為9～12分。

1.2.4 E-Cadherin、Snail 和Twist的結(jié)果評價標準[13] E-Cadherin 表達于胞膜或胞質(zhì)，呈黃色染色為陽性細胞，Twist 蛋白表達于細胞質(zhì)，少數(shù)位于胞核，呈清晰的棕色或棕褐色為陽性細胞。每例切片隨機選取10個高倍視野，以陽性細胞的百分比進行結(jié)果判定。E-Cadherin：陽性細胞百分比≥25% 為陽性；Twist：陽性細胞百分比≥5% 為陽性。Snail 染色以胞核或/和胞漿出現(xiàn)淡黃色至棕黃色為陽性細胞。細胞按染色強度結(jié)合陽性細胞數(shù)百分比綜合計分作半定量分析。染色強度以多數(shù)細胞呈現(xiàn)的染色特性計分，與背景著色相對比，0分：無染色；1分：弱陽性；2分：陽性；3分：強陽性。按著色細胞百分比，1分：1%～25%；2 分：26%～50%；3分： 51%～75%；4分：76%～100%。然后按陽性細胞×染色強弱計積分，積分1～2為陰性，積分3～12為陽性。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，兩組間計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中HIF-1α、NDRG2、E-Cadherin、Snail和Twist的表達檢測情況

HIF-1α在正常胃組織中不表達，在胃癌組織中有表達，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中表達更高。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中與胃癌組織中比較，HIF-1α表達有顯著差異（χ2=4.395，P=0.037）。NDRG2在正常胃組織中高表達，陽性率達85%，而胃癌組織中表達明顯下降，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中無表達。正常胃組織與胃癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的表達比較，有顯著差異（χ2=30.179，P=0.000）。胃癌組織與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的表達比較，有顯著差異（P=0.047）。正常胃組織與胃癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的表達比較，E-Cadherin表達有顯著差異（χ2=12.217，P=0.000）；Snail表達無顯著差異（χ2=3.811，P=0.051）；Twist表達有顯著差異（χ2=15.372，P=0.000）。胃癌組織與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的表達比較，E-Cadherin、Snail和Twist的表達均無顯著差異（χ2分別為1.804、1.541和0.419，P值分別為0.179、 0.214和0.517）。見表1、封三圖3～7。

2.2 同一組織內(nèi)HIF-1α、NDRG2、E-Cadherin、Snail和Twist的關系

在正常胃組織中HIF-1α不表達，NDRG2高表達，與E-Cadherin表達無顯著差異，與Snail 和Twist表達有顯著差異。在胃癌組織中HIF-1α與NDRG2表達無顯著差異（P=1.000）。HIF-1α和NDRG2表達均與E-Cadherin表達無顯著差異，與Snail 和Twist表達有顯著差異。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中HIF-1α高表達，NDRG2不表達。HIF-1α表達與E-Cadherin、Snail 和Twist表達均無顯著差異。見表2。

3 討論

3.1 HIF-lα的作用

HIF-1是細胞在缺氧狀態(tài)下廣泛存在于哺乳動物和人體內(nèi)的一種重要的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其在血管形成、細胞增殖、能量代謝、紅細胞生成、細胞黏附等相關基因的調(diào)控方面均占很重要的地位。缺氧誘導因子-1是由HIF-1α及HIF-1β亞單位構(gòu)成的異二聚體。低氧可以通過HIF-lα誘導多種基因的表達，參與腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移。HIF-1α在細胞內(nèi)水平的增高僅僅只是因為在缺氧或低糖的環(huán)境下HIF-1α的穩(wěn)定性明顯提高而在胞內(nèi)積聚，當缺氧或低糖得到改善時，HIF-1α被迅速降解。腫瘤組織生長迅速，必然會處于缺氧狀態(tài)而誘導HIF-1α表達，因此，癌基因的激活及抑癌基因的失活可導致瘤細胞中HIF-1α的表達升高及活性的增強。有研究認為，細胞外基質(zhì)蛋白1通過整合素β4/FAK/SOX2/HIF-1α信號通路調(diào)節(jié)胃癌細胞轉(zhuǎn)移和葡萄糖代謝[13]。

3.2 NDRG2的作用

NDRG2由李劍等[14]首次發(fā)現(xiàn)，NDRG2 在包括膠質(zhì)瘤、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌、前列腺癌在內(nèi)的較多腫瘤中低表達[15，16]。NDRG2在正常胃組織中高表達，而在胃癌組織中低表達。在胃癌細胞SNU-620 中干預NDRG2的表達，能夠促進胃癌細胞的增殖[17]，提示NDRG2可抑制胃癌的發(fā)生和發(fā)展。

3.3 EMT的作用

EMT主要的特征有細胞黏附分子，如E鈣黏蛋白（E-Cadherin）表達的減少、細胞角蛋白細胞骨架轉(zhuǎn)化為波形蛋白（Vimentin）為主的細胞骨架及形態(tài)上具有間充質(zhì)細胞的特征等。轉(zhuǎn)錄因子：Snail因子表達上調(diào)可以作為EMT的生物標志物。Twist具有獨立的抑制E-Cadherin表達并上調(diào)纖連蛋白和N鈣黏蛋白的作用。EMT是腫瘤轉(zhuǎn)化瀑布中重要的一步，在腫瘤遷移和侵襲過程中具有重要性。

3.4不同組織中HIF-1α、NDRG2、E-Cadherin、Snail和Twist的表達

本研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α 和NDRG2在正常胃組織、胃癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的表達相反，即正常胃組織內(nèi)HIF-1α無表達，而NDRG2高表達，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中HIF-1α高表達，而NDRG2無表達。在上述3種組織中，HIF-1α或NDRG2表達均有顯著差異，提示HIF-1α可能通過抑制NDRG2表達而促進胃癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。有學者利用HIF-1α單克隆抗體檢測了HIF-1α在多種腫瘤中的表達，發(fā)現(xiàn)90%的結(jié)腸癌、乳腺癌及前列腺癌組織中HIF-1α表達升高，而在腫瘤附近正常組織中則不表達[18-20]。在本研究中，正常胃組織中NDRG2與E-Cadherin均高表達，胃癌和淋巴結(jié)癌組織中均低表達。E-cadherin可維持細胞間緊密連接，阻止細胞活動侵襲及轉(zhuǎn)移擴散，NDRG2是否通過E-Cadherin起作用有待于進一步研究。Twist表達在上述組織中的表達相反，兩者比較有統(tǒng)計學差異，而Snail表達無統(tǒng)計學差異，考慮Twist具有獨立的抑制E-Cadherin表達而促進EMT的功能。有研究認為通過調(diào)節(jié)STAT3通路可調(diào)節(jié)胃腸癌的EMT，通過NDRG2抑制NDRG2/gp130/STAT3通路，下調(diào)Snail表達而抑制EMT，從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[21-23]，但在本研究結(jié)果中，NDRG2與Snail表達無顯著差異，原因不明。

3.5 同一組織中HIF-1α、NDRG2、E-Cadherin、Snail和Twist的表達

已有學者證實HIF-1α在肝癌、乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤組織中表達并調(diào)節(jié)其生物學行為[24，25]。可以通過DNA甲基化、組蛋白修飾或改變小RNA等改變各種信號通路，如TGF-β、PI3K、MAPK、Hedgehog 和Wnt等通路，從而控制EMT過程[26]。轉(zhuǎn)錄因子Grhl2可抑制TGF-β誘導的EMT，從而降低胃癌細胞的侵襲和遷移能力[27]。抑制Snail可抑制HIF-1α誘導的EMT[28，29]。在本研究中，正常胃組織中HIF-1α不表達，NDRG2高表達，NDRG2表達與Snail 和Twist表達有顯著差異。在胃癌組織中HIF-1α和NDRG2均與Snail 和Twist表達有顯著差異。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中HIF-1α高表達，NDRG2不表達，HIF-1α表達與E-Cadherin、Snail 和Twist表達均無顯著差異。提示NDRG2與E-Cadherin、Snail和Twist的關系最密切。而HIF-1α與E-Cadherin、Snail和Twist的表達無關，故可能的解釋就是HIF-1α影響EMT是通過NDRG2而實現(xiàn)的。

總之，本研究結(jié)果顯示，正常胃組織內(nèi)HIF-1α無表達，而NDRG2高表達，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中HIF-1α高表達，而NDRG2無表達。NDRG2與E-Cadherin、Snail和Twist的關系最密切，而HIF-1α與E-Cadherin、Snail和Twist的表達無關，故HIF-1α影響EMT可能是通過抑制NDRG2表達而實現(xiàn)的。

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（收稿日期：2018-05-21）